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Resumo

Transporte retrógrado de proteínas de superfície celular para o Golgi é essencial para manter a homeostase de membrana. Aqui, descrevemos um método para analisar bioquimicamente transporte de superfície-para-Golgi celular de proteínas recombinantes usando funcionalizados nanobodies em células HeLa.

Resumo

Transporte de proteínas e membranas de superfície celular para o Golgi e além é essencial para a homeostase, organela identidade e fisiologia. Para estudar o tráfego de proteína retrógrada, recentemente desenvolvemos um versátil baseado em nanobody toolkit para analisar o transporte de superfície celular para o complexo de Golgi, quer por células fixas e ao vivo de imagens, por microscopia electrónica, ou bioquimicamente. Nós produzimos funcionalizados antiproteína verde fluorescente (GFP) nanobodies — ligantes pequenos, monomérico, alta afinidade da proteína — que pode ser aplicado a linha celular expressam proteínas de membrana de interesse com um moiety extracelular de GFP. Nanobodies pyrazole vinculados para os repórteres de GFP especificamente são internalizados e transportado às costas ao longo das rotas de classificação dos repórteres. Nanobodies foram acrescidas com fluorophores siga transporte retrógrado por microscopia de fluorescência e viver de imagem, com peroxidase de ascorbato 2 (APEX2) para investigar a localização ultra-estrutural do repórter-nanobody complexos por elétrons microscopia e com motivos de tirosina sulfatação (TS) para avaliar a cinética da chegada de rede (TGN) trans-Golgi. Neste artigo metodológico, descrevem o procedimento geral para o modo express e purificar nanobodies funcionalizados. Ilustramos o uso poderoso de nossa ferramenta usando o nanobodies mCherry - e TS-modificado para analisar a captação endocítica e TGN chegada de proteínas de carga.

Introdução

Trânsito retrógrado de proteínas e lipídios de superfície celular para vários compartimentos intracelulares é crucial para a manutenção da homeostase de membrana para contrabalançar a secreção e reciclar componentes de anterógrada transporte machineries1 , 2. após internalização através de endocitose dependente de Clatrina ou - independente, carga de proteínas e lipídios primeiro preencher cedo endossomos de onde eles são mais Redirecionado ou ao longo do sistema endo-lisossomal, reciclado para a membrana plasmática, ou direcionados à rede trans-Golgi (TGN). Reciclagem de endossomos e/ou a superfície da célula para o TGN é parte do ciclo funcional de um número de receptores de carga do transmembrane anterógrada, tais como os receptores de manose-6-fosfato de cação-dependente e independente de cátion (CDMPR e CIMPR) entregando recém sintetizado hidrolases lisossômicas do TGN para tarde endossomos lisossomos3,4,5, sortilin e SorLA6,7e Wntless (WLS) transportando Wnt ligantes à superfície da célula 8 , 9 , 10 , 11. outras proteínas obtidas para o TGN são TGN46 e suas isoformas relacionados12,13,14, SNAREs (solúvel em N- proteà sensíveis à fusão fator acessório receptores) 15 , 16 , 17, precursora amiloide (APP) de proteína18,19, anquilose progressiva (ANK) proteína20transportadores metálicos tais como ATP7A/B ou DMT121,22e do transmembrane processamento de enzimas, incluindo a carboxipeptidase D, furina ou BACE123,24,25. Para além destas proteínas endógenas, toxinas bacterianas e vegetais (por exemplo, toxina Shiga e cólera, ricina e abrin) sequestrar máquinas de transporte retrógrado para alcançar a ER para retrotranslocation para o citosol26,27, 28,29.

A fim de analisar diretamente trânsito retrógrado, anteriormente desenvolvemos um conjunto de ferramentas baseadas em nanobody para rotular e siga proteínas de carga de superfície celular para compartimentos intracelulares30. Nanobodies representam uma nova família de proteínas ligantes derivados de homodimeric cadeia pesada-somente anticorpos (hcAbs) que ocorrem naturalmente em camelídeos e peixes cartilagíneos31,32. Eles constituem o domínio variável de cadeia pesada (VHH) de hcAbs e têm muitas vantagens sobre anticorpos convencionais (por exemplo, IgGs): eles são monoméricos, pequeno (~ 15 kDa), altamente solúvel, desprovida de ligações de bissulfeto, pode ser bacteriana expressos e selecionado para ligação de alta afinidade33,34,35,36. Para tornar a nossa ferramenta de nanobody versátil e amplamente aplicável, utilizamos funcionalizados anti-GFP nanobodies às proteínas de superfície-rótulo e faixa com GFP no seu domínio extracelular/lumenal. Por functionalization de nanobodies com mCherry, peroxidase de ascorbato 2 (APEX2)37, ou sequências de sulfatação (TS) de tirosina, transporte retrógrado de proteínas transmembranares carga de bonafide pode ser analisado por qualquer fixo e vive de imagem latente da pilha, por microscopia eletrônica de varredura, ou bioquimicamente. Desde sulfatação tirosina mediada por sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 e TPST2) é uma modificação pós-traducional restringida para o trans-Golgi/TGN, podemos diretamente estudar transporte e cinética de proteínas de interesse da superfície da pilha para isso intracelulares Golgi compartimento38,39,40.

Neste artigo de métodos, descrevemos a facilidade de produção de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry e derivados) adequado para uma série de aplicativos para analisar o transporte retrógrado em células de mamíferos,30. Focamos principalmente o uso de TS site-modificado nanobody para análise de tráfego intracelular de superfície celular para o compartimento de sulfatação.

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Protocolo

1. bacteriana transformação com funcionalizados Nanobodies

Nota: Este protocolo foi otimizado para a expressão, purificação e análise de nanobodies anti-GFP funcionalizados como descrito anteriormente,30. Derivatização com outras partes da proteína pode requerer a modificação do presente protocolo padrão.

  1. Descongelar as bactérias chemocompetent (~ 100 µ l) adequadas para a expressão da proteína (por exemplo, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) células), colocando-os em gelo.
    Nota: Prepare chemocompetent células bacterianas de acordo com os procedimentos padrão do laboratório. Alternativamente, as células bacterianas quimicamente competentes podem ser adquiridas comercialmente.
  2. Adicionar 50 ng de um plasmídeo codificação nanobodies funcionalizados. Para permitir o suficiente biotinylation site-specific do repórter nanobody durante a expressão bacteriana, também adicionar um excesso de triplo (150 ng) de um plasmídeo bacteriano expressão codificação biotina ligase do BirA (ver também a tabela 1 para obter informações do plasmídeo). Suavemente a pipeta acima e para baixo.
    Nota: Se nanobody biotinylation não é necessário ou os repórteres nanobody são desprovidas de um peptídeo de aceitador de biotina (BAP), transformação co com um plasmídeo BirA de codificação não é necessária.
  3. Incube as células bacterianas por 30 min no gelo.
  4. As células bacterianas de choque de calor, colocando-os por 1 min a 42 ° C em banho-maria ou um bloco de aquecimento.
  5. Adicionar 1 mL de temperatura (RT) médio de caldo (LB) de Luria e incubar a bactéria transformada em uma thermoshaker para 1 h a 37 ° C, para permitir a expressão fenotípica dos genes de resistência. Para preparar 1 L LB médio, equilíbrio 5 g de fermento extrato, 10g de triptona e 10 g de NaCl, encher com água e esterilizar em autoclave. Se o nanobody funcionalizado tem sido subcloned em um vetor de expressão contendo resistência à ampicilina/carbenicilina, passo 1.5 pode ser omitido.
  6. As bactérias a 11.000 x g por 1 min de pelotas e Resuspenda em 100 µ l de meio LB fresco.
  7. As bactérias suspensas em LB placas contendo os respectivos antibióticos (por exemplo, com 50 µ g/mL canamicina e 50 carbenicilina µ g/mL quando as bactérias têm sido co transformadas com nanobody repórter e BirA, tal como acima referido (etapa 1.2)) da placa.
  8. Coloque as placas LB em uma incubadora a 37 ° C e deixe crescer durante a noite (O/N).
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui armazenando a placa LB com colônias crescidas em 4 ° C. Use o parafilm para selar as placas LB.

2. bacteriana cultura líquida e indução da expressão de Nanobody funcionais

  1. Escolher uma colônia bacteriana contendo o vetor de interesse do prato e deixe crescer em um frasco contendo 20 mL de LB suplementado com antibióticos O/N em uma agitação incubadora a 37 ° C (ver também passo 1.7 sobre seleção de antibióticos).
  2. No dia seguinte, dilua a cultura bacteriana adulto 20 mL em um frasco contendo 1 L de meio LB com antibióticos de seleção.
  3. Continue a incubar a cultura bacteriana a 37 ° C, até que ele atinja uma OD600 de 0,6-0,7. Permitir que a cultura arrefecer a RT antes induzindo a expressão de proteínas.
  4. Induzi a expressão da proteína de nanobodies funcionalizados e BirA pela adição de 1 mL de 1 M isopropil-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) a uma concentração final de 1 mM do indutor (1:1, 000 diluição). Também, adicionar 10 mL de 20 mM d-biotina estoque solução resultando em 200 µM d-biotina, o meio de crescimento para permitir biotinylation do epítopo BAP presente no nanobodies funcionalizados (ver também a tabela 1 para obter informações do plasmídeo)
    Nota: A solução d-biotina é preparada em ddH2O e trazida para a solução pela adição de algumas NaH2PO4a 500 mm. Como alternativa, d-Biotina também pode ser dissolvido em DMSO. Para produzir nanobodies fundido ao APEX2 (VHH-APEX2), o meio LB deve ser complementado além com cloridrato de (dALA) o ácido 5-aminolevulínico 1mm para promover a incorporação do heme. dALA é preparado como uma solução estoque de 100 mM em ddH2O.
  5. Incubar a cultura bacteriana induzida por IPTG 1 L a 30 ° C, durante 4 h para VHH-2xTS, a 20 ° C ou O de RT/N para VHH-APEX2 ou no 16 ° C O/N para VHH-mCherry (ver também a tabela 1 para obter informações do plasmídeo).
    Nota: Condições de expressão para uma nova construção de nanobody devem ser otimizadas pelo experimentador.
  6. Transferir a cultura bacteriana do recipiente dentro de uma garrafa de centrifugação de 1 L e pelota as células a 5.000 x g a 4 ° C, durante 45 min. decantar o sobrenadante e continuar com a purificação.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui armazenando a pelota bacteriana a-80 ° C indefinidamente. A pelota para VHH-APEX2 ou VHH-mCherry normalmente é acastanhada (por causa do hemo incorporado) ou cor de rosa, respectivamente.

3. purificação de Nanobodies funcionais

  1. Se necessário, descongelar a pelota bacteriana congelada no gelo (ver também passo 2.6).
  2. Adicionar 30 mL de tampão de ligação gelada (imidazol 20mm em 1X PBS) para a pelota de célula bacteriana e ressuspender pipetando para cima e para baixo. Transferência de ressuspensão de bactérias em um tubo de 50ml rotulados.
  3. Suplemento a vinculação de 30 mL buffer com lisozima 200 µ g/mL, 20 µ g/mL DNase I, 1 mM MgCl2 e fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 1 mM (PMSF) e incube primeiro para 10 min a RT e depois de 1 h a 4 ° C, um agitador de extremidade-sobre-extremidade.
  4. Mecanicamente, lyse pilhas bacterianas em um tubo de 50 mL colocando um sonicador de ponta para a suspensão. Aplica pulsos constante 3 x 1 min com períodos de resfriamento 1 min in-between.
  5. Centrifugue o bacteriano lisado a 15.000 x g a 4 ° C, durante 45 min para os detritos e células intactas de Pelotas. Transferir o lisados bacteriano lisado celular total ou dentro de uma garrafa de centrifugação adequado para centrifugação ou dividir o lisado em vários tubos de 5ml por centrifugação do tabletop.
  6. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL e descartar os detritos peletizados.
  7. Armazenar o apuradas lisado no gelo enquanto prepara a purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC). Para isolar nanobodies funcionalizados com tag histidina, emprega descartáveis suas colunas (ver Tabela de materiais) que permite a purificação de gravidade-fluxo rápido e simples.
    Nota: Alternativamente, purificação de lote em vez de colunas comerciais pode ser usada também.
  8. Montagem de suas colunas em uma base de Metal.
    1. Estabilizarem a solução de armazenamento das colunas e equilibrar a sua coluna com 10 mL de tampão de ligação (imidazol 20mm em 1X PBS).
    2. Vazio por fluxo de gravidade (o escoamento pode ser descartada).
  9. Gradualmente, carrega o apuradas bacteriana lisado (~ 30 mL) para a coluna. Vazio por fluxo de gravidade (o escoamento pode ser descartada).
  10. Lave a sua coluna 2 x com 10 mL de tampão de ligação (imidazol 20mm em 1X PBS).
  11. Eluir o nanobodies com 2 mL de tampão de eluição (imidazol 500mm em 1X PBS) para um tubo de 2 mL e aplicar uma troca de amortecedor.
  12. Troca de amortecedor.
    1. Equilibrar uma dessalinização coluna (ver Tabela de materiais) colocado em um adaptador de coluna de tubo de 50 mL 5 vezes com 5 mL de 1X PBS.
    2. Permitir que o buffer entrar na cama embalada. Descarte o escoamento.
    3. Após a quinta equilibração de PBS, gire a coluna a 1.000 x g por 2 min.
    4. Descarte o escoamento.
    5. Coloque a coluna com o adaptador para um novo tubo de 50 mL. Carregar a 2 mL de eluted nanobody funcionalizado (da etapa 3.11) para a coluna do desalting PBS-equilibrado e girar a 1.000 x g por 2 min e recolher o eluato.
      Nota: Em vez de colunas do desalting comerciais, diálise pode ser aplicado para a composição do tampão de troca.
  13. Determine a concentração de proteína (nanobody) do eluato usando o bicinchoninic (BCA) ou ensaio de Bradford, de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Para ensaios de absorção de nanobody por linhas de células GFP repórter, uma concentração das ações de 2-10 mg/mL é ideal.

4. a validação da expressão Nanobody funcionalizados (coloração Coomassie)

  1. Prepare-se 10-12,5% géis para sódio Dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida electroforese do gel (SDS-PAGE) de acordo com protocolos padrão.
    Nota: Como alternativa, use géis gradientes pré-fabricado comercialmente disponíveis.
  2. Pipetar 20 µ g de nanobody funcionalizado purificado em um tubo de 1,5 mL e fervura no amortecedor da amostra a 95 ° C por 5 min.
    Nota: Por exemplo, adicione 10 µ l de uma solução de reserva de nanobody de 2 mg/mL em um tubo de 1,5 mL com 10 µ l de tampão de amostra x 2. Se o volume é muito pequeno, dilua ainda mais nanobody em PBS antes de adicionar o amortecedor da amostra.
  3. Carregar o nanobody purificado fervido no amortecedor da amostra em um gel de poliacrilamida-SDS e executado de acordo com o protocolo padrão da página até que o corante de referência (por exemplo, o bromofenol) atingiu o fim do gel de separação, seguido pela coloração Coomassie e a descoloração.
  4. Coomassie Gel, coloração e descoloração.
    1. Uncast gel e manchá-la com solução coloração Coomassie (5% de uma solução estoque de Coomassie em 10% ácido acético e 45% de metanol em ddH2O 10g/L) para 20-30 min em RT em uma plataforma de agitação em movimento. O gel deve ser completamente coberto na solução de coloração.
    2. Destain o gel 2 - 3 vezes com destain solução (7,5% ácido acético e 15% metanol em ddH2O) para 1 h no RT, antes de deixar o gel O/N para mais descoloração.
      Nota: Excesso Coomassie pode ser eficientemente embebido colocando toalhas de papel de cozinha em torno do gel.
  5. O gel com uma câmera ou câmera de escolha de imagem.
    Nota: Expressão de Nanobody pode ser ainda mais validado pelo immunoblot análise usando anticorpos direcionando seus resumos (ver também figura 1A).

5. absorção de Nanobodies funcionalizados por culturas de células para a coloração de fluorescência

  1. Numa vizinhança de cultura celular, as células de HeLa semente ~ 400.000 a 500.000 estàvel expressar uma proteína GFP-etiquetado repórter sobre as lamelas de vidro de 18 mm (n º 1,5 H) em pratos de 35 mm ou 6-poços clusters com meio completo contendo antibióticos (meio Eagle modificado de Dulbecco, DMEM suplementado com 10% de soro fetal bezerro (FCS), 100 unidades/mL estreptomicina, 2 mM l-glutamina e puromicina 1,5 µ g/mL).
    Nota: Aqui, usamos as células HeLa estàvel expressando EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP para fins ilustrativos. Além de linhas de célula estável, podem ser usadas também transitoriamente transfectadas células HeLa. Linha celular estável pode ser co cultivada neste passo com parental não transfectadas células HeLa, por comparação direta.
  2. Incube as celulas O/N a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 a proliferar.
    Nota: As células devem ter uma confluência de ~ 80% no dia seguinte.
  3. Pipetar 2 µ l de uma solução de reserva de nanobody de 2 mg/mL em um tubo de 15 ou 50 mL contendo 2 mL de meio completo (este volume é suficiente para cobrir um prato de 35mm ou um bem de um cluster de 6-poço, ajustar o volume do meio e nanobody proporcionalmente para incluir mais d de cultura celular ishes ou clusters).
    Nota: Para fins de ilustração, nós aqui usamos VHH-mCherry, desde que nenhuma mancha de anticorpo adicional é necessário para ver nanobody internalizada pelos repórteres EGFP (ver Figura 2).
  4. Remover o meio de crescimento das células e adicionar 2 mL de meio completo escaldado contendo 2 nanobody µ g/mL acrescida por prato de 35mm ou unidade 6-poços.
  5. Incube as celulas para 1 h a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 para permitir a absorção mediada por repórter nanobody.
    Nota: Dependendo da experiência planejada, o tempo de absorção de nanobody precisa ser ajustada. Para o experimento mostrado aqui, 1h é suficiente para atingir o estado estacionário de absorção de nanobody pelo CDMPR-EGFP e TfR-EGFP.
  6. Retire o meio e lave-as células de 2 - 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
  7. Consertar as células com 1 mL de 3% paraformaldeído (PFA) durante 10 minutos a RT
  8. Remover a solução PFA e saciar fixador restante com 1 mL de 50mm NH4Cl em 1X PBS durante 5 min à RT
    Nota: 3% PFA deve ser descartado de resíduos separadamente como fixador.
  9. Lavar as células 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
  10. Permeabilize as células com 1 mL de 0.1% Triton X-100 em 1X PBS durante 10 minutos a RT
    Nota: Embora nenhum permeabilização é necessária, EGFP e mCherry de fluorescência é melhor quando depois que as células são incorporadas no meio de montagem.
  11. Lavar as células 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
  12. Coloque as lamelas com pinças em uma gota (~ 100 µ l) de 1% de BSA em 1X PBS contendo 5 µ g/mL DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) durante 5 min à RT
  13. Coloque o prato/poço as lamelas e lavar 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
  14. Rotular as lâminas de vidro e montar as células com Fluoromount-G. Deixe o meio de montagem endurecer no escuro por 3-4 h e armazenar as lâminas de vidro a 4 ° C, sob a proteção de luz.
  15. Padrões de coloração usando um microscópio de escolha (por exemplo, ponto varredura Confocal microscópio vertical) da imagem.

6. absorção de funcionalizados Nanobodies por células cultivadas (para análise de sulfatação)

  1. Numa vizinhança de cultura celular, as células de HeLa ~ 400.000 a 500.000 estàvel expressar uma proteína GFP-etiquetado repórter em pratos de 35mm ou em clusters 6-poços com antibióticos contendo médios completos (meio de Eagle modificado de Dulbecco, DMEM, suplementado com 10% de vitela fetal da semente soro (FCS), 100 unidades/mL estreptomicina, 2 mM l-glutamina e puromicina 1,5 µ g/mL).
    Nota: Como mencionado acima, nós aqui usamos células HeLa estàvel expressando EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP para fins de ilustração. Além de linhas de célula estável, pode ser usado também transitoriamente transfectada HeLa.
  2. Incube as celulas O/N a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 a proliferar.
    Nota: As células devem ter uma confluência de ~ 80% no dia seguinte.
  3. Remover o meio completo, lave 2 vezes com 1X PBS em RT e morrer de fome as células com sulfato livre médio (SFM) por 1 h a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 .
    Nota: SFM é preparado pela adição de 10 mL de solução de MEM aminoácidos (50x), 5 mL de L-glutamina (200 mM), 5 mL da solução de vitamina (100 x) e 900 µ l de CaCl2·2H2O a 500 mL de sais equilibradas da águia. Passe por um 0,22 µm filtro e alíquota.
  4. Em uma campânula ventilada ou banco designado para o trabalho de radioactividade, prepare sulfato de rotulagem meio contendo sulfato de sódio 0,5 mCi/mL [35S] como sal de sódio de SFM.
    Atenção: Manipule com cuidado todas as soluções que contenham radioatividade. Só funcionam em capas designadas ou bancos. Todo material (dicas, tubos, chapas, etc.) ou buffers de lavagem em contato com a radioatividade tem que ser recolhidos e eliminados separadamente. Fazer isso para todas as etapas abaixo (passo 6.5-6.20) também.
  5. Adicione VHH-2xTS em 1X PBS em sulfato de rotulagem médio para uma concentração final de 2 µ g/mL.
    Nota: Como controle, também incluem o VHH-std ou outro nanobody desprovido de sites TS para demonstrar a rotulagem específica.
  6. Substituir o SFM por 0,7 mL de sulfato de rotulagem contendo médio 0,5 mCi/mL [35S] sulfato e 2 µ g/mL VHH-2xTS e incube as celulas para 1 h a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 designada para o trabalho com radioactividade.
    Nota: Dependendo da experiência planejada, o tempo de nanobody sulfatação precisa ser ajustada. Além disso, para determinar a cinética de chegada TGN, rotulagem é executada para momentos diferentes (por exemplo, para 10 min, 20 min, 30 min, etc.).
  7. Retire o meio de rotulagem e lave as células de 2 - 3 vezes com PBS 1x gelada sobre uma placa de refrigeração ou gelo.
  8. Adicionar 1 mL de tampão de lise (PBS contendo 1% Triton X-100 e 0,5% Deoxycholate do) suplementado com 2 mM PMSF e 1 x coquetel de inibidor de protease e incube as celulas por 10-15 min em uma plataforma de balanço a 4 ° C.
  9. Raspe e transfira o lisado em um tubo de 1,5 mL, vórtice o lisado e coloque por 10-15 min em um rotador completa sobre a 4 ° C.
  10. Preparar um pós-nucleares lisado por centrifugação a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
  11. Usando um novo tubo de 1,5 mL, preparar 20-30 µ l de uma suspensão de grânulos de níquel em um tubo de 1,5 mL e lave uma vez com PBS 1x por granulação-os delicadamente a 1.000 x g por 1 min.
    Nota: Em vez de níquel, miçangas, contas de estreptavidina (se nanobody é biotinilado) ou grânulos de A proteína com uma IgG contra um epítopo da nanobody (T7 - ou HA-tag) podem ser usados.
  12. Transferir o pós-nucleares lisado em um tubo de 1,5 mL contendo grânulos de níquel e incubar durante 1 h a 4 ° C em uma extremidade-sobre-extremidade rotador para isolar o nanobodies. Retire uma alíquota (50-100 µ l) do pós-nucleares lisada e ferva em tampão de amostra SDS para análise de immunoblot subsequentes de total associada a célula nanobody, repórter GFP e controle de carregamento.
  13. Lave os grânulos 3 vezes com tampão PBS ou lise 1x por granulação suavemente a 1.000 x g por 1 min.
    Nota: Para lavar mais rigorosa dos grânulos, imidazol 20mm pode ser incluído em tampão PBS ou Lise.
  14. Cuidadosamente remova tampão de lavagem todos os grânulos, adicionar 50 µ l de 2x do amortecedor da amostra e ferva por 5 min à 95 ° C.
  15. Carga ambos cozidos grânulos em um midi 12,5% SDS-PAGE gel e executado de acordo com o protocolo padrão da página até que o corante de referência (por exemplo, o bromofenol) atingiu o fim do gel de separação.
    Nota: Immunoblot análise de total associada a célula nanobody, repórter GFP e controle de carga também pode ser realizada usando um mini 12,5% SDS-PAGE ou gel gradiente pré-moldado.
  16. Corrigir o gel de separação em ~ 30 mL de tampão de fixação (10% de ácido acético e 45% metanol em ddH2O) por 1h no RT, lave o gel três vezes com ~ 50 mL de água desionizada e prepare-se para a secagem de gel.
  17. Secagem geles de SDS-PAGE.
    1. Cuidadosamente coloque o gel fixo na película aderente esticada e cubra com papel de filtro pré-cortados.
    2. Coloque o gel com o papel de filtro para baixo sobre a plataforma de secagem, coloque a tampa de vácuo e ligar a bomba de vácuo para secagem do gel. Seca o gel para 3-5 h.
    3. Retire a película aderente e coloque o gel seco dentro de um estojo de autoradiografia, equipado com uma tela de fósforo.
  18. Autoradiograph de imagem usando um gerador de imagens de tela de fósforo. Siga as instruções do fabricante.
    Nota: Dependendo da força do sinal, secas géis precisam ser expostos mais com écrans de fósforo.

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Resultados

Para investigar o transporte retrógrado proteína para vários destinos intracelulares, nós temos estabelecido recentemente uma ferramenta baseada em nanobody de anti-GFP para rotular e siga as proteínas recombinantes de fusão entre a superfície celular30. Aqui, demonstramos a produção bacteriana de tais derivatizado nanobodies e demonstrar sua aplicação para estudar endocítica absorção por microscopia de fluorescência e immunoblotting, bem como a sua ...

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Discussão

Nanobodies representam uma classe emergente de andaimes de proteína ligante com muitas vantagens sobre anticorpos convencionais: eles são pequenos, estável, monomérico, podem ser selecionados para alta afinidade e falta dissulfeto títulos33,35, 44 , 45. são usados em muitas aplicações, tais como nos sistemas de cultura de células e organismos em biologia do desenvolvimento

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por Grant 31003A-162643 pela Fundação de ciência nacional suíço. Agradecemos a Nicole Beuret e o Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) pelo apoio.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

Referências

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