Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega de siRNA intranasal ao sistema nervoso central

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo usando um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada dos ratos para a administração intranasal de uma formulação do peptide-siRNA do cérebro-alvejando permitindo o silenciamento de gene eficaz no sistema nervoso central.

Resumo

A entrega da droga intranasal (IN) ao cérebro emergiu como um método prometedor para contornear a barreira do sangue-cérebro (BBB) para a entrega das drogas no sistema nervoso central (CNS). Os estudos recentes demonstram o uso de um peptide, RVG9R, incorporando o domínio receptor-obrigatório mínimo da glicoproteína do vírus de raiva, em eliciando a entrega de siRNA em neurônios no cérebro. Neste protocolo, a formulação do peptídeo-siRNA é entregada intranasal com uma pipeta na mão dominante, quando o rato anestesiado for contido pelo scruff com a mão nondominante em uma "posição para baixo e para a frente da cabeça" para evitar a drenagem no pulmão e estômago após a inalação. Esta preensão exata dos ratos pode ser aprendida mas não é fácil e exige a prática e a habilidade de conduzir à tomada eficaz do CNS. Além disso, o processo é longo-desenhado, exigindo cerca de 45 min para a administração de um volume total de ~ 20-30 μL de solução em 1-2 μL de volumes de gotas por inalação, com períodos de repouso de 3-4 min entre cada inalação. O objetivo deste estudo é divulgar um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada de ratos para eficiente na administração da formulação do peptide-siRNA. As características múltiplas são incorporadas no projeto do dispositivo, tal como quatro ou oito cadeiras de posicionamento com altura e inclinação ajustáveis para conter os ratos anestesiados na posição para baixo e para diante da cabeça, permitindo a visualização fácil das narinas dos ratos e de um almofada de aquecimento incorporado para manter as temperaturas do corpo dos ratos durante o procedimento. Importante, a habilidade de tratar quatro ou oito ratos simultaneamente com os complexos de RVG9R-siRNA desta maneira permite estudos em uma escala de tempo muito mais rápida, para o teste de um na aproximação terapêutica do siRNA. Em conclusão, este dispositivo permite o posicionamento apropriado e controlado da cabeça do rato para na aplicação de RVG9R-siRNA e de outras moléculas terapêuticas, tais como nanopartículas ou anticorpos, para a entrega do CNS.

Introdução

O BBB previne moléculas administradas sistemicamente de > 400-600 da de entrar no cérebro, representando um desafio significativo para a entrega de biomoléculas terapêuticas para doenças que afetam o SNC e o cérebro¹. A entrega direta da droga ao cérebro pode ser conseguida pela injeção stereotactic; no entanto, isso requer experiência cirúrgica e é altamente restrito ao parto para áreas proximais ao local da injeção, tornando-o inadequado para uso clínico de rotina². Na entrega ao cérebro também pode resultar em entrega cerebral direta por ignorando o BBB, permitindo a transferência direta e rápida de uma variedade de substâncias para o cérebro^3,4. Esta transferência é pensada para ocorrer por mecanismos do transporte através dos nervos olfactory e do trigeminal que conectam a passagem nasal ao cérebro, ao líquido cerebrospinal, e aos sistemas linfáticos⁵. Como a rota direta nariz-a-cérebro não envolve órgãos e tecidos periféricos, reduz substancialmente os efeitos colaterais sistêmicos e melhora a potência. NA administração é uma alternativa não invasiva promissora para as rotas locais e sistêmicas para a entrega cerebral de agentes terapêuticos e pode representar uma abordagem poderosa para combater distúrbios neurológicos, incluindo a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, e câncer cerebral, e está sendo explorado em vários ensaios clínicos^6,7,8.

Vários fatores experimentais, como o volume e o método de inoculação, bem como o pH da formulação, influenciam fortemente a entrega do fármaco ao SNC através da via do nariz para o cérebro⁹. Em estudos com camundongos, o sucesso da IN na entrega da droga depende fortemente do posicionamento adequado da cabeça, o que é crítico para o depósito cerebral eficiente e para evitar a drenagem de drogas no ambiente externo ou nas vias aéreas. Notavelmente, a maioria dos estudos de roedores empregam uma posição de cabeça para trás (supina) com uma inclinação de 70 °-90 ° para a entrega de fármacos ao epitélio olfativo, embora o posicionamento da cabeça a 0 ° possa favorecer a drenagem na traquéia⁹. NA entrega de drogas em camundongos que estão acordados resulta em redução do depósito cerebral em comparação com qualquer aplicação na posição supina, principalmente devido à incapacidade dos cientistas para segurar os ratos na posição desejada por longos períodos de tempo. Além disso, a posição de cabeça para baixo exigida pelo método do aperto da pele empregada para ratos acordados conduz ao depósito da droga predominante no nervo de trigeminal e no bulbo olfactory, assim como órgãos periféricos, tais como rins e pulmões, dentro de 30 minutos pós-inoculação¹⁰. A posição corporal mais adequada para a realização da terapêutica através dos nervos olfatório ou trigeminal em animais maiores, como primatas não humanos em estudos clínicos, parece ser a posição de cabeça para baixo e para frente (ou seja, a chamada "orando para Meca posição ")¹¹. No entanto, esta posição não foi bem estudada no modelo do rato, e a posição supina é mais amplamente utilizada em estudos de roedores.

Previamente, nós mostramos que o RVG9R, um peptide projetado baseado no domínio obrigatório do receptor mínimo do vírus da raiva, indica o tropismo às pilhas que expressam subunidades nicotínico do receptor da acetilcolina como neurônios e macrófagos e Medeia o entrega intracelular de siRNA por um mecanismo envolvendo o acoplamento do receptor e a delocalização temporária da membrana plasmática no local da agregação do receptor^12,13. Importante, a administração intravenosa sistemática de complexos de RVG9R-siRNA permite a entrega escapamento do siRNA no CNS¹⁴. No entanto, a via sistêmica dilui a quantidade de siRNA entregue ao SNC, e os dados recentes demonstram que a administração de IN de RVG9R: complexos de siRNA para camundongos posicionados na posição de cabeça para baixo e para frente provoca knockdown de gene alvo de grande propagação em várias regiões do cérebro¹⁵. Importante, este nível de knockdown foi conseguido com tão pouco quanto 13,5 μg de siRNA administrado ao longo de um regime de quatro doses, 2 dias, enquanto a via IV requer uma dose de ~ 5 vezes maior por injeção para conseguir knockdown comparável. A única lacuna da abordagem IN é que é um procedimento árduo, exigindo o uso de ambas as mãos durante a administração da solução, enquanto continuamente segurando os camundongos alternativamente na cabeça para baixo e para a frente e em posições descontraídas entre cada inalação por um período considerável de tratamento prolongado (um procedimento de 30-45 min para a absorção efetiva de um volume de ~ 20-30 μL por rato). Usando o dispositivo de posicionamento do mouse apresentado aqui permite a colocação adequada de camundongos com pouca coação física para os animais e o pessoal que executa o protocolo, bem como o tratamento de múltiplas coortes de camundongos dentro de um período de tempo razoável, permitindo um estudo aprofundado sobre o uso de siRNAs como terapêutica para a encefalite do Nilo Ocidental em camundongos em estágios tardios da doença¹⁵.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Comitê de cuidado e uso de animais da Universidade de Hanyang. Neste protocolo, foram utilizados camundongos Balb/c de 6 semanas de idade, pesando 20-25 g (n = 3 por grupo). Os animais foram alojados em uma instalação livre de patógenos com 12 h de luz/ciclos escuros em um nível de temperatura e umidade controlada com acesso livre à água e alimentos.

1. montagem do dispositivo

1. Monte as partes individuais do dispositivo de posicionamento como mostrado na Figura 1a.
   Nota: o dispositivo é fornecido em peças individuais que podem ser facilmente montadas e desmontadas.

2. configuração do material

Nota: a administração IN de medicamentos liquefeitos requer as seguintes etapas de pré-tratamento.

1. Prepare os materiais exigidos, incluindo o dispositivo de posicionamento, uma micropipeta de 10 μL, 10 pontas da micropipeta do μL, uma solução do tratamento (por exemplo, complexo de RVG9R-siRNA), um pulso de disparo do temporizador, e 70% etanol (refira a Figura 2a).
2. Ligue o código de alimentação para ligar o sistema de aquecimento do dispositivo, pelo menos, 15-20 min antes do experimento. A temperatura ideal para experimentos com animais é mantida automaticamente a ~ 37 ° c.
3. Prepare a anestesia cetamina: xilazina: solução salina tamponada por fosfato (PBS) em uma proporção de 1:0,5:8,5 e anestesie cada rato com uma única injeção intraperitoneal (i.p.) em um volume final de 200 μL por rato de 20 g.
   Nota: por favor, note que qualquer medicamento otimizado para garantir a condição de anestesia por um período de 30-45 min pode ser usado.

3. posicionamento do mouse

1. Avaliar o nível de anestesia por pedal Reflex (firme Toe pinch) para manter o plano cirúrgico.
2. Coloc o dispositivo de posicionamento em uma distância e em uma altura apropriadas para fornecer o acesso conveniente a todos os reagentes exigidos.
3. Uma vez que os ratos são devidamente anestesiados, levante suavemente cada rato pelo scruff de seu pescoço com o dedo polegar e ponteiro e colocá-lo na cadeira designada.
4. O posicionamento apropriado do rato na cadeira é muito importante nesta fase. Coloque a parte traseira do rato paralela ao apoio traseiro da cadeira, e em 90 ° ao assento da cadeira. Levante as mãos do rato e deixe que o animal se deite naturalmente na posição de cabeça para baixo e para a frente, sem empurrar ou pressionar, como mostrado na Figura 2b. Certifique-se de que os membros anteriores do mouse forneçam suporte natural enquanto o animal está nesta posição relaxada, sem qualquer desconforto para o mouse.
5. Uma vez que os ratos são posicionados corretamente, cinta os ratos com o cinto da cadeira, e imediatamente iniciar a inoculação.

4. entrega intranasal

Observação: Este protocolo descreve o IN entrega de RVG9R: siRNA complexos usando o dispositivo de posicionamento do mouse. Usando este protocolo, um máximo de 20-30 μL de solução pode ser facilmente administrado a cada rato em 2 μL de gotas. Este volume é inferior ao da cavidade nasal do rato, que é de 0, 32 cm³, de modo que o procedimento não resulta em obstrução da narina letal ou asfixia. Este protocolo permite a inoculação simultânea de pelo menos quatro camundongos e um máximo de oito camundongos por dispositivo, resultando em otimização de tempo e redução da variabilidade.

1. Tome a micropipeta de 10 μL e ajuste-a para 2 μL.
2. Carregar a micropipeta com 2 μL de RVG9R: solução complexa de siRNA (por exemplo, 5,2 μg de siCy5 complexado com 104 μg de RVG9R para o experimento de parto e 13,5 μg de siSOD1 complexado com 270 μg de RVG9R para o experimento de silenciamento, em um volume final de 25 μL de PBS contendo 5% de glicose.
3. Enquanto segura a pipeta na mão dominante, ajuste a posição colocando um cotovelo na parte superior do banco. Apoie a mão segurando a pipeta com a outra mão para evitar movimentos descontrolados durante a administração.
4. Coloque uma gota de ~ 2 μL muito perto de uma narina para que o rato possa inalar diretamente a gota (consulte a Figura 2b). Se uma pequena gota não for facilmente formada, substitua a ponta da pipeta por uma nova e repita a operação. Use o cronômetro para verificar o intervalo de tempo entre as inoculações.
5. Este dispositivo permite o tratamento de pelo menos quatro ratos de cada vez. Se outro grupo de camundongos for necessário para repetir a etapa 4,4, defina outra barra com quatro cadeiras acima ou abaixo da primeira barra com quatro cadeiras para acomodar até oito camundongos por vez no dispositivo.
6. Repita a etapa 4,4 com a outra narina após 3-4 min da primeira inoculação. Este intervalo de tempo é suficiente para o rato para completar a inalação da primeira dose e restaurar a respiração normal. Se uma gota da solução inalada for desalojada devido a um ronco acidental das Naris do rato, reocultar um adicional de 2 μL de solução.
7. Repita todo o processo com narinas alternadas até que a dose de 20-30 μL esteja terminada. Levará ~ 30-45 min para completar todo o procedimento de inoculação.
8. Põr a pomada molhada sobre os olhos dos ratos antes de retornar os ratos de volta a suas gaiolas designadas.
   Nota: não deixe os ratos desacompanhado até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência esternal.

5. análise de dados

1. Para confirmar a deposição cerebral de fluor-rotulados RVG9R, anestesiam os camundongos (conforme descrito na etapa 2,3) e isolam o cérebro, bem como outros órgãos periféricos, como pulmão, fígado, baço e rim. Coloque cada órgão no ImageStation e visualize a fluorescência usando o ImageStation.
2. Para visualizar a fluorescência devido ao Cy5-Label, Prepare 20 Cryosections μm-grossos, costained com Hoechst 33342, e realize a exploração do cheio-cérebro com um microscópio confocal.
3. Para avaliar o silenciamento genético, extraia o RNA de várias regiões cerebrais, como o bulbo olfativo, o córtex, o hipocampo, o tálamo, o hipotálamo, o cerebelo e o tronco cerebral, com um kit de purificação de RNA, transcrito-reverso em cDNA usando um cDNA Kit de síntese, e executar qPCR com pares de primer como descrito anteriormente¹⁵.

Resultados

A posição principal durante a administração de IN é uma influência principal na eficiência da entrega da droga ao cérebro. Aqui nós descrevemos a posição de cabeça para baixo e para frente usando um dispositivo de posicionamento do mouse para a administração de uma formulação de peptídeo-siRNA de segmentação cerebral para a entrega da mistura ao CNS do mouse. Para verificar a entrega através da rota, utilizou-se o peptídeo RVG9R, previamente mostrado para ligar eficientemente às células neuronais tanto in vitro como in vivo^14,15.

Primeiro testamos a entrega de nariz para cérebro do peptídeo RVG9R rotulado com Alexa fluor 488 (RVG9R-A⁴⁸⁸) usando o dispositivo de posicionamento do mouse descrito aqui. Em 48 h pós-inoculação, vários órgãos, incluindo o cérebro, o seio, os pulmões, o fígado, o baço e os rins foram extirpado para medir a fluorescência de⁴⁸⁸ associada ao tecido. Um⁴⁸⁸ isoladamente, ou um peptídeo de controle (RVM9R-a⁴⁸⁸)¹⁴ que não liga Nachr, foram usados como controles negativos. Como esperado, nem um⁴⁸⁸ nem RVM9R-a⁴⁸⁸ foram detectados em nenhum dos órgãos em 48 h pós-inoculação (Figura 3a, esquerda). Por outro lado, um forte sinal fluorescente A⁴⁸⁸ foi detectado exclusivamente no cérebro do grupo INOCULADO com RVG9R. Além disso, comparamos esta posição de colocação do rato ao método de posição supina que tem sido utilizada anteriormente¹⁷, bem como ao método acordado, para a eficácia. Inoculamos uma quantidade fixa de RVG9R-A⁴⁸⁸ (100 μg) e biodistribuição ensaiada a 48 h de pós-inoculação. Os resultados indicaram que o posicionamento dos camundongos cabeça para baixo e para frente melhorou a penetrância e deposição de RVG9R-A⁴⁸⁸ em todo o tecido cerebral (Figura 3a, direita). Em contrapartida, os animais inoculados em posição supina resultaram na entrega de RVG9R-a⁴⁸⁸ ao cérebro, mas não tão forte como visto com o método de posicionamento do dispositivo. Para confirmar ainda mais a entrega do siRNA ao cérebro, nós executamos a exploração do completo-cérebro após uma única administração de in de RVG9R complexado a 400 pmol (5,2 μg) de Cy5-etiquetado siRNA. Em contraste com a PBS ou RVM9R, complexando com RVG9R resultou em um forte acúmulo de siRNA nas principais regiões cerebrais, incluindo o bulbo olfativo, o córtex, o hipocampo, o tálamo, o hipotálamo, o midbrain e o cerebelo (Figura 3B ).

Finalmente, empregamos a análise de RT-qPCR para verificar a entrega intracelular de siRNA funcional visando o gene superóxido dismutase-1 (SOD1). Os camundongos foram inoculados intranasalmente por 3 vezes em dias consecutivos com RVG9R: siSOD1 (13,2 μg de siRNA), e a expressão de mRNA SOD1 foi analisada 24 horas após a última inoculação. RVG9R: siSOD1 administração resultou em uma redução substancial da expressão SOD1 no bulbo olfativo (63%), no córtex (47%), no hipocampo (61%), no tálamo (53%), no hipotálamo (55%), no midbrain (39%) e no cerebelo (30%) (Figura 4). Em conclusão, o uso de um dispositivo de posicionamento permite uma fácil IN inoculação de RVG9R-complexed siRNA em camundongos, resultando em cérebro-específico de parto siRNA induzindo silenciamento funcional do gene alvo.

Figura 1 : Apresentação fotográfica da montagem do dispositivo. As cadeiras de posicionamento são montadas no suporte na altura apropriada com parafusos. Após a montagem, o dispositivo é conectado a uma fonte de alimentação para o aquecimento à temperatura fisiológica durante a inoculação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Apresentação fotográfica do procedimento de inoculação in utilizando o dispositivo de posicionamento. A) equipamento experimental necessário para a inoculação in. B) os animais na posição de cabeça para baixo e para a frente sentados no dispositivo (à esquerda) e a deposição de uma gota de 2 μl para a inoculação in (direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Distribuição de peptídeo com rótulo fluorescentamente e siRNA após administração de in. (A) biodistribuição do PEPTÍDEO RVG9R inoculado intranasalmente a 48 h após uma única inoculação de in. O cérebro e outros órgãos periféricos foram avaliados quanto à presença de fluorescência em camundongos inoculados com soro fisiológico (PBS), A⁴⁸⁸, RVM-a⁴⁸⁸e rvg-a⁴⁸⁸ (esquerda). Imagem dos camundongos tratados como mencionado acima, enquanto eles estão acordados, na posição supina, e no posicionamento do mouse conceber na posição de cabeça para baixo e para a frente (direita). (B) biodistribuição do complexo RVG9R: siRNA no cérebro (n = 3 por grupo). A distribuição de siRNA Cy5-etiquetada foi visualizada em Cryosections cheios do cérebro com um microscópio confocal do laser nos animais inoculados com o soro fisiológico (PBS), o siRNA complexado com peptide do controle (RVM9R-siCy5), ou o peptide do cérebro-alvejando RVG9R (RVG9R-siCy5). A barra de escala representa 1 mm. abreviaturas: o. b = bulbo olfatório; CTX = córtex; hipopótamo = hipocampo; hipo = hipotálamo; Tha = tálamo; m. b = midbrain; cer = cerebelo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Em aplicação de RVG9R: siSOD1 induz o silenciamento do gene alvo em várias regiões do cérebro. análise de qPCR para o mRNA murino SOD1 em regiões cerebrais indicadas 24 h após a última inoculação de soro fisiológico (PBS), RVG9R: siCD4 (siCD4), RVM9R: siSOD1 (RVM9R) e RVG9R: siSOD1 (RVG9R). O silenciamento relativo de SOD1 no bulbo olfativo, o córtex, o hipocampo (superior), o tálamo, o hipotálamo, o cerebelo (médio) e o midbrain (inferior) são mostrados. Os dados representam a média ± DP em relação ao GAPDH após a normalização com os dados correspondentes de camundongos tratados com soro fisiológico (n = 3 por grupo). Os desenhos animados que descrevem a percentagem de SOD1 mRNA na região cerebral indicada após a inoculação IN é mostrada (inferior direito). * *P < 0, 1, * * *p < 0, 1. Abreviaturas: o. b = bulbo olfatório; CTX = córtex; hipopótamo = hipocampo; hipo = hipocampo; Tha = tálamo; m. b = midbrain; cer = cerebelo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nós desenvolvemos um dispositivo de posicionamento do rato para os ratos de posicionamento otimamente para a entrega do nariz-à-cérebro da terapêutica. O dispositivo é equipado com as funcionalidades diferentes, assegurando a manipulação simultânea fácil dos animais. Também é equipado com almofadas de aquecimento para a manutenção das temperaturas corporais fisiológicas dos animais durante a experimentação. Os camundongos anestesiados podem ser mantidos na posição de cabeça para baixo e para frente por meio de cadeiras especificamente projetadas, com mínimo desconforto para os animais. A altura das cadeiras de posicionamento pode ser ajustada em tal maneira como é o melhor para visualizar narinas animais ao administrar drogas.

NO parto cerebral tem várias limitações intrínsecas, incluindo a pequena área superficial das narinas (permitindo volumes máximos de 20-30 μL por administração), irritação nasal, dano do epitélio e absorção limitada em todo o epitélio nasal¹⁸. A administração in de medicamentos para camundongos colocados na posição supina tem sido usada para a entrega do cérebro, soltando drogas líquidas em narinas alternativos dos animais através de pipeta ou tubo de poliuretano (24 G x 19 mm) ligado a seringas de microlitro^{19, 20}. embora o uso de sistemas de tubos para liberar drogas perto do epitélio olfativo é uma abordagem potencialmente adequada, provoca irritação ou inflamação nasal após a administração repetitiva. Além disso, o pequeno tamanho da cavidade nasal limita essa abordagem, especialmente em camundongos que podem ser superados por repetição, bem como por formulações de fármacos que persistem na mucosa nasal. Outra opção é a administração IN de terapêutica para camundongos acordados¹⁰. No entanto, esta abordagem requer procedimentos qualificados para a manipulação de animais durante a inoculação. Além disso, provoca estresse animal e, portanto, não é ideal para modelos de doenças, especialmente modelos de doenças infecciosas. Além disso, a dosagem inconsistente pode facilmente resultar da drenagem da droga nos pulmões ou no estômago devido à preensão animal imperfeita. A abordagem aqui apresentada permite que os cientistas superem essas barreiras técnicas. A posição de cabeça para baixo e para frente reduz a possibilidade de vazamento de drogas do nariz para os pulmões ao inalar, favorecendo a entrega de siRNA direta e seletiva ao cérebro. NA entrega usando o dispositivo de posicionamento do rato não exige nenhuma técnica especializada para segurar ou prender os animais durante a inoculação. Quatro animais de cada vez podem ser tratados por um período de pelo menos 30-45 min. O procedimento pode ser ampliado, incluindo uma barra de quatro cadeiras adicionais, permitindo a fácil gestão de até oito camundongos na mesma sessão experimental. Conseqüentemente, seguindo este método, um único operador pode induzir a entrega da droga aos cérebros de grandes grupos de animais sobre períodos de tempo prolongados.

A estrutura anatômica da cavidade nasal influencia fortemente a entrega do nariz ao cérebro (como revisada por Merkus et al.¹¹ e Ruigrok e de Lange²¹). A área de superfície relativa da cavidade nasal em camundongos é 15 vezes maior do que a dos seres humanos e a área de superfície relativa do epitélio olfativo é 6 vezes maior. Embora existam diferenças significativas na anatomia da cavidade nasal em humanos para roedores, há aproximadamente 45 ensaios clínicos em andamento usando a abordagem IN para tratar vários distúrbios cerebrais (www.clinicaltrials.gov). O estudo aqui apresentado indica que, ao usar IN na entrega de terapêutica, os cientistas devem considerar vários fatores, como a posição da cabeça, dormindo e agentes de entrega adequados.

Nós mostramos a deposição eficiente e específica de siRNA fluorescentamente rotulado para o cérebro do mouse. Além disso, a diminuição significativa na expressão do gene SOD1 observada após IN siRNA entrega confirmou efeitos funcionais. Nós mostramos previamente consistentemente que a administração de IN dos complexos de RVG9R-siRNA que visam o vírus do Nilo Ocidental (WNV) o RNA exerce um efeito terapêutico forte na encefalite¹⁵de WNV. Notavelmente, a entrega do siRNA do nariz-à-cérebro exigiu um ligante Cell-Targeting (RVG) e uma molécula positivamente carregada (9R) ao siRNA complexo. Na ausência desses elementos, as moléculas foram limpas através do circuito sistêmico e vasos linfáticos 48 h pós-tratamento (Figura 3a)¹⁵. Conseqüentemente, na instalação experimental descrita aqui, nós examinamos a localização do peptide/siRNA 48 h após a inoculação à imagem somente os níveis retidos especificamente no cérebro. Essa abordagem poderia ser facilmente implementada para a entrega de outras moléculas, como proteínas, peptídeos e nanopartículas, ou outras terapêuticas, para o tratamento de um número de distúrbios cerebrais.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comercial assays
iScript cDNA synthesis kit	BioRad	Cat# 1708891
RNAiso plus	TaKaRa Bio	Cat# 9108
SYBR Premix ExTaq	TaKaRa Bio	Cat# RR420A
Dyes
Alexa fluor 488	ThermoFisher	Cat# A30052
Mouse strain
Balb/c	Orient Bio	N/A	6-8 week old, 20-30g
Oligonucleotides and primers
Human CD4	ST Pharm	N/A	Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’
siSOD1	ST Pharm	N/A	Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’
GAPDH primers	ST Pharm	N/A	F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’
SOD1 primers	ST Pharm	N/A	F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’
Peptides
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
Software, algorithms and devices
FlowJo software 4.3	FlowJO, LLC	N/A	http://docs.flowjo.com/vx/
Mouse positioning device	Signet Biotech	N/A
Prism software	Graphpad	N/A	https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/
Prism software	Graphpad	N/A	https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/