Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Resumo

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Resumo

Várias limitações de sistemas de cultura de células 2D têm despertou interesse em plataformas de análise e cultura de células 3D, o que seria melhor imitar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e imitar as funções de tecido in vivo. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o desenvolvimento de ambientes in vitro em 3D em que as células podem ser integradas em uma matriz extracelular bem definida (ECM) e um conjunto definido de biomoléculas solúveis ou matriciais associadas. No entanto, as barreiras tecnológicas limitaram seu uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Aqui, descrevemos um método para construir dispositivos simples para a cultura 3D e experimentação com células e organóides multicelulares em microambientes 3D com um gradiente quimioatractivo definido. Nós ilustramos o uso desta plataforma para a análise da resposta de pilhas epithelial e de organóides aos gradientes de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento epidérmico (EGF). Os gradientes de EGF eram estáveis nos dispositivos por diversos dias que conduzem à formação dirigida da filial em organoids da mama. Essa análise permitiu concluir que a detecção coletiva de gradiente por grupos de células é mais sensível versus células individuais. Nós igualmente descrevemos o método da fabricação, que não exige facilidades do photolithography nem técnicas macias avançadas da litografia. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D no contexto da análise do desenvolvimento e dos Estados patológicos, incluindo o câncer.

Introdução

No ambiente fisiológico, as células são incorporadas em uma matriz extracelular (ECM) e expostas a uma infinidade de biomoléculas. As interações entre as células e o microambiente circundante regulam processos intracelulares controlando diversos fenótipos, incluindo migração, crescimento, diferenciação e sobrevida^1,2. Muito tem sido aprendido sobre os comportamentos celulares em uma cultura de células 2D convencional. Entretanto, com o advento da imagem latente e da experimentação intravital com as pilhas encaixadas em hydrogels 3D, as diferenças importantes em comportamentos da pilha foram reconhecidas nas culturas 2D in vitro simplificadas contra o tecido 3D-como ambientes. Enquanto as células interagem com as fibras de ECM e sentem suas propriedades mecânicas dentro da matriz 3D, a rigidez do material do gel não é uma variável totalmente independente em um sistema in vitro 2D. A dimensionalidade altera a formação de adesão focal, resultando em diferentes morfologia e comportamento celular. Além disso, as células em uma superfície 2D são expostas a menos sinais de sinalização do que as células abertas a todas as direções em 3D.

Essas limitações aumentaram os interesses dos sistemas 3D que representam a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e melhor prever as funções in vivo do tecido. Eles foram desenvolvidos em muitas formas de organóides como microestruturas celulares de automontagem para células aleatoriamente intercaladas em ECM^3,4. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o advento de vários tipos de sistemas de cultura 3D^5,6,^7, 8,9 para o estudo de alterações fenotípicas e respostas celulares a sinais solúveis; no entanto, as barreiras tecnológicas limitam o uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Em muitos casos, os processos de fabricação requerem técnicas de fotolitografia e conhecimentos de fundo para litografia suave. Além disso, vários fatores devem ser controlados para construir com sucesso um dispositivo e para conseguir uma função óptima do dispositivo durante um longo período de tempo.

Nosso método descreve como construir um dispositivo 3D PDMS para incorporar células e organóides multicelulares em um microambiente 3D com gradientes quimioatrativos definidos e, em seguida, analisar respostas epiteliais ao EGF¹⁰. Nossos dados revelam que a capacidade de organóides para responder a gradientes de EGF superficial surge do acoplamento químico intercelular através de junções de Gap. Sugere o potencial de organóides para a deteção mais precisa de entradas espacially graduadas fracas e ruidosas. O processo da fabricação não exige uma facilidade da sala de limpeza nem técnicas do photolithography. No entanto, o dispositivo 3D PDMS inclui os fatores necessários do ambiente fisiológico 3D. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D e tem grande potencial de pesquisa com diferentes tipos de células, quimioattractantes e combinações de ECM.

Protocolo

Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins, faculdade de medicina.

1. fabricação do dispositivo mesofluídico

1. Projete a máscara do molde para o dispositivo de PDMS usando um software do CAD 3D.
2. Imprima o molde usando o equipamento do estereolitografia com uma resina resistente térmica.
   Nota: os procedimentos aqui descritos foram realizados por um serviço de impressão 3D comercial.
3. Misture completamente uma solução do monômero de PDMS com o agente de cura em uma relação 10:1. 3 mL de mistura PDMS foi necessária para a fabricação do dispositivo. O volume total depende do número de moldes a serem fabricados.
4. Degas a mistura aplicando um vácuo com o uso de um vácuo ou de uma bomba de vácuo da em-casa em um exsicador do vácuo por 1 hora.
5. DAB a superfície do molde com uma fita adesiva para remover a poeira, e despeje então a mistura de PDMS ao molde. Se forem introduzidas bolhas no processo, repita a desgaseificação no vácuo. Bolhas presas entre os pilares do molde pode ser removido por picando-los com uma agulha afiada.
   Nota: o processo de desgaseificação à temperatura ambiente deve ser feito dentro de 1 hora ou menos.
6. Cure o PDMS por aquecimento a 80 ° c por 2 horas. Deixe o molde arrefecer à temperatura ambiente.
7. Corte o limite entre o molde e o PDMS com uma lâmina e descasque então fora PDMS do molde com cuidado.
8. Aparar a peça PDMS para caber o 22 mm x 22 mm lamela e perfurar um furo na entrada.
   Observação: o protocolo pode ser pausado aqui.
9. Limpe a peça PDMS e a lamínula de 22 mm x 22 mm limpando as superfícies com tecidos de baixo-Lint e 70% de etanol. Em seguida, remova partículas de poeira grandes por dabbing com uma fita adesiva.
10. Esterilizar a peça de PDMS e a lamínula por autoclavagem (121 ° c por 8 minutos molhados, 15 minutos secos) ou exposição à luz UV por 1 hora.
11. Trate a superfície inferior da peça do PDMS e deslize a tampa com o injetor da descarga da Corona por 5 minutos na capa da cultura do tecido e lig-os então junto.
    Cuidado: Coloque qualquer material não condutor, como espuma de poliestireno na parte inferior e remova todos os materiais condutores durante este processo. Injete o colagénio no dispositivo imediatamente, dentro de 5 minutos, após o tratamento para aumentar a ligação entre o gel do colagénio e o COVERSLIP de vidro.

2. preparação da pilha: isolação organoid mamária preliminar

Nota: os detalhes da isolação organoid mamária podem ser encontrados em um trabalho precedente¹¹. Qualquer tipo de célula única ou organóide pode ser preparado de acordo com seus próprios protocolos de isolamento/destacamento.

1. Mince o tecido da glândula mamária dos camundongos com um bisturi até que o tecido relaxe e agite por 30 min a 37 ° c em 50 mL de solução de colagenase/tripsina (10 mL por rato) em DEME/F12 suplementado com 0,1 g de tripsina, 0,1 g de colagenase , 5 mL de FBS, 250 μL de 1 μg/mL de insulina e 50 μL de 50 μg/mL de gentamicina.
2. Centrifugue a solução de colagenase/tripsina a 1.250 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante por aspiração. Dispersar células em 10 mL de DMEM/F12, e centrifugar a 1.250 x g por 10 min. Após a remoção de DMEM/F12 por aspiração, resuspenda as células em 4 mL de DMEM/F12 suplementados com 40 μL de DNase (2 unidades/μL).
3. Agitar a solução DNase à mão por 2-5 min e, em seguida, centrifugar a 1.250 x g por 10 min.
4. Separe organóides de células simples através de quatro centrífugas diferenciais (pulso para 1.250 x g e parar a centrífuga 3-4 s depois que atinge a velocidade pretendida). Entre cada pulso, aspirar o sobrenadante e suspender a pelota em 10 mL de DMEM/F12.
5. Resuspender a pelota final na quantidade desejada de meio de crescimento de DMEM/F12 com 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de insulina-transferrina-Selenium-X para preparação de colágeno.

3. preparação e injeção de colágeno

Nota: outros tipos de géis ECM podem ser preparados de acordo com seus próprios protocolos de gelação.

1. Prepare a solução do tipo I do colagénio (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 solução de NaOH do N, meio normal do crescimento no gelo.
   Nota: Mantenha no gelo até que o procedimento esteja terminado.
2. Adicione 6 μL de solução de 1 N NaOH, 200 μL de meio de crescimento e 50 μL de 10x DMEM em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado e misture a solução completamente.
3. Adicione 425 μL de colágeno na solução pré-misturada e misture cuidadosamente com pipetagem.
4. Centrifugue a mistura de colágeno brevemente (menos de 5 segundos) para separar e remover bolhas da mistura.
5. Mantenha a solução de colágeno neutralizada no gelo por 1 hora para induzir a formação de fibras.
6. Adicione 50 μL de suspensão celular na mistura de colágeno e misture completamente.
   Nota: a concentração final de colágeno é de 2 mg/mL.
7. Injete a solução usando 200 μL de Pipet através da entrada do dispositivo PDMS até que toda a câmara seja preenchida. Se a mistura de colágeno transborda através das lacunas de pilares, cortar o excesso de colágeno gel com lâmina cirúrgica afiada após a geladura.
8. Mantenha o dispositivo na incubadora a 37 ° c com 5% de CO₂ por 1 hora para induzir a geladura.
9. Encha os reservatórios de ambos os lados com meio de crescimento e mantenha o dispositivo na incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 até que a imagem confocal seja realizada.

4. imagem latente 3D e quantificação

1. Instale uma câmara da cultura da imagem latente da vivo-pilha a um microscópio confocal e pré-ajuste a temperatura e o CO₂ a 37 ° c e a 5%, respectivamente. Para obter umidade, adicione água no reservatório da câmara e coloque lenços umedecidos na câmara, se necessário.
2. Coloque o dispositivo PDMS na câmara e adicione EGF a um dos reservatórios como uma "fonte" do FEG na formação de gradiente. O outro reservatório servirá uma "pia" necessária para o desenvolvimento da distribuição EGF espacialmente graduada. 2,5 nM de EGF foi adicionado na pia para fazer o gradiente de 0,5 nM/mm neste estudo.
3. Defina o intervalo de Z-Stack cobrindo o volume de organóides de interesse e iniciar a imagem.
   Cuidado: para evitar a fototoxicidade, tente uma intensidade mais baixa do laser na imagem latente Confocal ou use técnicas da imagem latente do multi-fotão.
4. Reconstruir uma imagem 3D a partir de pilhas de imagens 2D usando um software comercial ou um programa feito medida. Meça o comprimento e o ângulo das filiais que estendem dos organóides ou da migração de pilhas individuais. Aqui, realize a quantificação desenhando um contorno à mão livre ao redor do corpo organoide usando o ImageJ.

Resultados

EGF é um regulador essencial da morfogênese ramificando em glândulas mamárias e um quimioatractivo crítico orientando a migração de células epiteliais do peito no crescimento do cancro invasivo. Utilizamos os dispositivos fluílicos mesoscópicos descritos acima para estudar a resposta das células aos gradientes de EGF definidos (Figura 1a, B)¹⁰. O dispositivo produz uma área de cultura de 5 mm de largura, 10...

Discussão

A fabricação de moldes PDMS foi realizada utilizando um serviço de impressão 3D comercial, mas também pode ser realizada por uma impressora 3D de alta-final em casa. Entre os vários métodos da fabricação 3D, o estereolitografia é recomendado para a geração de molde de alta resolução. Como a cura do PDMS ocorre em uma temperatura alta (80 ° c), os materiais devem ser suficientemente resistentes a termicamente, o que deve ser explicitamente especificado, se a impressão for terceirizada. Uma pós-cura térmi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935