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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Resumo

A pele é o maior órgão do corpo e tem muitas funções. A pele atua como uma barreira física e protetor do corpo e regula as funções corporais. A biomimética é a imitação dos modelos, sistemas e elementos da natureza com a finalidade de resolver problemas humanos complexos1. Pele a biomimética é uma ferramenta útil para investigação de doença in vitro e in vivo medicina regenerativa. Células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) têm a característica de proliferação ilimitada e a capacidade de diferenciação de três camadas germinativas. IPSCs humanas são gerados a partir de várias células primárias, tais como as células do sangue, queratinócitos, fibroblastos e muito mais. Entre eles, células mononucleares de sangue de cordão (CBMCs) surgiram como uma fonte alternativa de célula na perspectiva da medicina regenerativa alogênico. CBMCs são úteis na medicina regenerativa, porque leucocitário humano (HLA) de antígeno digitando é essencial para a célula, sistema bancário. Nós fornecemos um método para a diferenciação de CBMC-iPSCs em queratinócitos e fibroblastos e para a geração de uma pele 3D organoides. Fibroblastos e queratinócitos CBMC-iPSC derivados têm características semelhantes a uma linha celular primária. Os organoids 3D da pele são gerados pela sobreposição de uma camada epidérmica em uma camada dérmica. Transplantando essa pele 3D organoides, é gerado um modelo de ratos humanizados. Este estudo mostra que um organoides 3D pele humana iPSC-derivado podem ser uma ferramenta de novela, alternativa para pesquisa dermatológica in vitro e in vivo.

Introdução

Pele cobre a superfície mais externa do corpo e protege os órgãos internos. A pele tem várias funções, incluindo proteção contra patógenos, absorver e armazenar água, regular a temperatura do corpo e excretando corpo perca2. Enxertos de pele podem ser classificados dependendo da fonte de pele; enxertos de pele de outro doador são denominados aloenxertos, e enxertos usando a pele do próprio paciente são autoenxertos. Embora um autograft é o tratamento preferido devido ao seu risco de rejeição baixa, biópsias de pele são difíceis de serem realizadas em pacientes com lesões graves ou um número insuficiente de células da pele. Em pacientes com queimaduras graves, três vezes o número de células da pele é necessário para cobrir grandes áreas. A disponibilidade limitada de células da pele do corpo do paciente resulta em situações em que o transplante de allogenous é necessário. Um aloenxerto é usado temporariamente até transplante autólogo pode ser realizado desde que geralmente é rejeitada pelo sistema imunológico do hospedeiro após aproximadamente 1 semana3. Para superar a rejeição pelo sistema imunológico do paciente, enxertos devem ser provenientes de uma fonte com a mesma identidade imunológica do paciente4.

IPSCs humanas são uma fonte emergente das células para terapia de células-tronco5. IPSCs humanas são gerados a partir de células somáticas, usando reprogramação fatores como OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc6. Usar iPSCs humana supera as questões éticas e imunológicas das células-tronco embrionárias (CES)7,8. IPSCs humanas ter pluripotência e pode diferenciar-se em três camadas germinativas9. A presença de HLA, um fator crítico na medicina regenerativa, determina a resposta imune e a possibilidade de rejeição10. O uso de derivados de paciente iPSCs resolve os problemas de rejeição de limitação e sistema imunológico de células-fonte. CBMCs também têm surgido como uma fonte alternativa de célula para medicina regenerativa11. HLA obrigatório digitar, que ocorre durante a operação bancária CBMC, facilmente pode ser usado para pesquisa e transplante de órgãos. Além disso, homozigotos HLA-tipo iPSCs pode aplicar amplamente vários pacientes12. Um banco CBMC-iPSC é uma estratégia eficiente para terapia celular e medicina regenerativa alogênico12,13,14e romance. Neste estudo, utilizamos CBMC-iPSCs, diferenciadas em queratinócitos e fibroblastos e gerar camadas estratificadas pele 3D. Os resultados deste estudo sugerem que um organoides CBMC-iPSC-derivado de pele 3D é uma nova ferramenta de pesquisa dermatológica in vitro e in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvam animais foram realizados de acordo com a lei de bem-estar de animais de laboratório, o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, e as diretrizes e políticas para a experimentação de roedor fornecido pelo cuidado Animal institucional e Use o Comité (IACUC) da escola de medicina da Universidade Católica da Coreia. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Católica da Coreia (CUMC-2018-0191-01). O IACUC e o departamento de laboratório animais (DOLA) da Universidade Católica da Coreia, Songeui Campus credenciados as instalações de laboratório Animal de excelência de Coreia da Coreia Food and Drug Administration em 2017 e adquirida Associação para avaliação e Acreditação de acreditação total Internacional de laboratório Animal conta internacional (AAALAC) em 2018.

1. pele diferenciação celular de células-tronco pluripotentes induzidas

  1. Preparação média
    Nota: Guarde todos os média a 4 ° C em um ambiente escuro por até 3 meses. Filtro médio todos usando um sistema de filtro de polietersulfona 0,22 μm antes do uso para a esterilização. Todos médio estava disponível em um volume total de 500 mL.
    1. Preparar o KDM1 (meio de diferenciação queratinócito 1). Médio (DMEM modificado águia do mix Dulbecco) / F12 médio (3:1), com 2% de soro fetal bovino (FBS), 0,3 mmol/L ácido L-ascórbico, 5 μg/mL insulina e 24 adenina µ g/mL.
    2. Preparar o KDM2 (meio de diferenciação queratinócito 2). Mix definido queratinócito soro livre médio (veja a Tabela de materiais) com 0,3 mmol/l ácido L-ascórbico, 5 μg/mL insulina e adenina de 10 μg/mL.
      Nota: Queratinócito definidos soro livre médio é otimizado para suportar o crescimento e a expansão dos queratinócitos.
    3. Preparar o KDM3 (meio de diferenciação de queratinócitos 3). Mix definidos queratinócito soro livre médio e meio livre de soro do queratinócito (1:1) consulte a Tabela de materiais para obter detalhes.
      Nota: Queratinócito soro livre médio é otimizado para o crescimento e a manutenção de queratinócitos.
    4. Preparar o FDM1 (meio de diferenciação de fibroblastos 1). Meio de mistura DMEM/F12 (3:1) com 5% FBS, 5 μg/mL insulina, adenina de 0,18 mM e 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF).
    5. Preparar o FDM2 (meio de diferenciação de fibroblastos 2). Meio de mistura DMEM/F12 (1:1) com 5% FBS e 1% não essenciais aminoácidos.
    6. Preparar o EP1 (epitelial médio 1). DMEM/F12 Mix (3:1) com 4 mM L-glutamina, 40 adenina μM, 10 transferrina μg/mL, insulina de 10 μg/mL e 0,1% FBS.
    7. Preparar o EP2 (epitelial médio 2). Misture o EP1 e 1,8 mM de cloreto de cálcio.
    8. Preparar o EP3 (epitelial médio 3, cornificação médio). Meio de mistura F12 com 4 mM L-glutamina, 40 adenina μM, 10 transferrina μg/mL, insulina de 10 μg/mL, 2% FBS e 1,8 mM de cloreto de cálcio.
  2. Geração de corpo embrionário
    1. Gere CBMC-iPSCs usando o protocolo mostrado no estudo anterior12.
    2. Pratos de cultura de casaco, usando a vitronectina. Prepare-se 5 mL para revestir um prato de 100 mm.
      1. Descongelar e ressuspender 50 μL de vitronectina 0,5 mg/mL (concentração final: 5 µ g/mL) com 5 mL de salina tampão fosfato (PBS). Adicionar a solução para os pratos e incubar a temperatura ambiente (RT) por 1 h. aspirado o material de revestimento antes do uso (para não secar).
    3. Manter as iPSCs CBMC-derivado para a vitronectina revestido 100 mm da placa e mudar o meio de iPSC (E8) diariamente a 37 ° C, com 10% de CO2.
    4. Gere corpos embrionários (EBs) usando o protocolo demonstrado em um estudo anterior15 (descrito resumidamente como segue). Expanda iPSCs, alterando o meio até que as células têm alcançado confluência de 80%. Na confluência de 80%, remover o meio e lave com PBS.
    5. Trate as células com 1 mL de ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min e colher as células usando 3 mL do meio de E8. Centrifugar as células a 250 x g por 2 min.
    6. Aspirar o sobrenadante e aplicar 5 mL de meio de E8 de células. Contar as células usando um hemocytometer e transferir 1 x 106 células para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 250 x g por 2 min.
    7. Ressuspender as células transferidas com 2,5 mL de meio de formação EB com inibidor de quinase Rho-associado (ROCK) 10 μM. 1 x 104 células (25 µ l/gota) na tampa do prato cultura noncoated usando uma pipeta de canais múltiplos de 10 – 100 μL de cair. Formulário 100 EBs de 1 x 106 células (1 x 104 células/1 EB). Vire o prato e segure a tampa da gota.
      Nota: Inibidor ROCK é necessária durante a etapa de penhora no processo de diferenciação e manutenção. Adicione o inibidor ROCK apenas na fase de agregação de EB.
    8. Incube a 37 ° C com 5% CO2 gotas para 1 dia.
    9. No dia seguinte, colher a 100 EBs e usá-los para diferenciação. Lavar a tampa da placa com meio de iPSC (meio de E8) ou PBS e colher o seu conteúdo para um tubo cónico de 50 mL. Manter o EBs em RT para 1 min para acalmá-los. Aspire o sobrenadante e ressuspender o EBs com E8 médio mantê-los em um prato de Petri de 90 milímetros até a diferenciação.
  3. Diferenciação de CBMC-iPSCs em queratinócitos
    Nota: Para um esquema da diferenciação queratinócito da CBMC-iPSCs, consulte a Figura 1A.
    1. EBs de colheita a 100 para um tubo cônico de 50 mL, com média de iPSC ou PBS. Manter em RT para 1 min assentar o EBs. Certifique-se que eles resolvem na parte inferior do tubo cónico. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o EBs com E8 médio com 1 ng/mL Proteína morfogenética óssea 4 (BMP4). Transferir o EBs para uma placa de Petri de 90 mm e mantê-los a 37 ° C com 5% de CO2 por 1 dia.
    2. Casaco de pratos de cultura, usando o colágeno tipo IV. Prepare-se 5 mL de colágeno de tipo IV para revestir um prato de 100 mm.
      1. Descongelar e ressuspender o tipo solução de colágeno IV (concentração final: 50 µ g/mL) com 0,05 N HCl. Adicione a solução para os pratos e incubar a RT por 1 h. aspirar o material de revestimento antes do uso (para não secar).
        Nota: Antes de utilizar as placas, lavar os pratos 3 x com PBS para remover qualquer ácido.
    3. Colher o EBs (etapa 1.3.1) para um tubo cónico de 50 mL e mantê-las em RT para 1 min para acalmá-los. Certifique-se que resolver na parte inferior do tubo cónico, aspirar o sobrenadante e ressuspender o EBs em 6 mL de KDM1 com inibidor ROCK 10 µM. Transferi o EBs para o prato de 100mm revestido de colágeno tipo IV.
      Nota: Adicione o inibidor ROCK apenas na fase de fixação de EB.
    4. Entre os dias 8 – 0, altere o meio de todos os outros dias para KDM1 com ácido retinoico de 3 µM (RA) e 25 ng/mL cada de BMP4 e EGF. Manter o EBs a 37 ° C com 5% de CO2.
    5. Entre os dias 9 a 12, altere o meio todos os dias para KDM2 com 3 µM RA, 25 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL EGF.
    6. Entre os dias 13 a 30, altere o meio de todos os outros dias para KDM3 com 10 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL EGF.
  4. Diferenciação de CBMC-iPSC em fibroblastos
    Nota: Para um esquema de diferenciação de fibroblastos de CBMC-iPSCs, ver Figura 2.
    1. Pratos de cultura de casaco, usando a matriz de membrana basal. Prepare-se 5 mL para revestir um prato de 100 mm.
      1. Descongelar a matriz da membrana basal (concentração final: 600 ng/mL) e diluir com meio DMEM/F12. Adicionar a solução para os pratos e incubar a 37 ° C por 30 min. aspirado o material de revestimento antes do uso (para não secar).
    2. EBs de colheita a 100 para um tubo cônico de 50 mL com uma pipeta com iPSC médio ou PBS. Manter em RT para 1 min assentar o EBs. Certifique-se de que casos são fechados na parte inferior do tubo cónico. Remova o sobrenadante.
    3. Ressuspender o EBs utilizando uma pipeta de 1.000 µ l em 6 mL de FDM1 com inibidor ROCK 10 µM. Transferir o EBs (com médio) para um prato de 100mm matriz-revestido de membrana basal e incubar a 37 ° C com 5% de CO2. Atualize o FDM1 todos os dias por 3 dias.
      Nota: Apenas adicione o inibidor ROCK na fase de fixação de EB.
    4. Adicione 0,5 nM Proteína morfogenética óssea (BMP-4) de 4 para o FDM1 entre os dias 4 e 6.
    5. No dia 7, altere o meio para FDM2 todos os dias durante 1 semana.
    6. No dia 14, adicionar 1 mL de 1 mM de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células com 3 mL de FDM2 e centrifugar a 250 x g por 2 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de FDM1.
    7. Contar as células usando um hemocytometer, Ressuspender 2 x 106 células com FDM1 médio e transferir as células para o prato noncoated. Manter as células a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias.
    8. Pratos de cultura de casaco, usando colágeno tipo I. Prepare-se 5 mL para revestir um prato de 100 mm. Diluir a solução de colágeno do tipo I (concentração final: 50 µ g/mL) em 0,02 N de ácido acético. Adicionar a solução para os pratos e incubar a RT por 1 h. aspirado o material de revestimento antes do uso (para não secar).
      Nota: Antes de utilizar as placas, lavar os pratos 3 x com PBS para remover o ácido.
    9. No dia 21, adicionar 1 mL de 1 mM de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células com 3 mL de FDM1 e centrifugar a 250 x g por 2 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de FDM1. Contar as células usando um hemocytometer e a transferência de 2 x 106 células para o tipo eu prato de colágeno-revestido 100 mm com média de FDM1. Manter as células a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias.
    10. No dia 28, adicionar 1 mL de 1 mM de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células com 3 mL de FDM1 e centrifugar a 250 x g por 2 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de FDM1. Contar as células usando um hemocytometer e transferir 2 x 106 células para um prato de noncoated com FDM1 médio. Manter a célula a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias.
      Nota: iPSC-derivado de fibroblastos proliferam como uma linhagem de células de fibroblastos primários e passagem até 10 passagens. Neste estudo, usamos fibroblastos iPSC-derivado de dois a cinco passagens para posterior análise.

2. a aplicação do hiPSC-derivado de células diferenciadas

  1. Geração de organoides pele 3D
    1. Preparar neutralizado tipo eu colágeno no gelo, seguindo as recomendações do fabricante. Como a concentração final, use 3 mg/mL de colágeno tipo I (concentração das ações de tipo I colágeno é 3,47 mg/mL) e certifique-se que o volume final da mistura é de 5 mL. Calcular o volume de 10 x PBS (volume final/10 = 0,5 mL). Calcular o volume de colágeno a ser usado tipo I (volume final x concentração de colágeno final / estoque de concentração de colágeno = 5 mL x 3 mg / mL / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). Calcular o volume de 1 N de NaOH (volume de colágeno deve ser usado x 0,023 mL = 0,1 mL). Calcular o volume de dH2O (volume do volume final - volume de colágeno - de 10 x PBS - volume de 1 NaOH N = 5 mL - 4,32 mL-0,5 mL 0,1 mL = 0,08 mL). Misturar o conteúdo do tubo e mantê-lo no gelo até estar pronto para usar.
    2. Adicionar 1 mL de EDTA para os fibroblastos iPSC-derivado da etapa 1.4.10 e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células desanexadas, contar as células usando um hemocytometer e 2 x 105 células de transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 2 min e retirar o sobrenadante. Ressuspender as células de fibroblastos derivados de iPSC em 1,5 mL de FDM1 e neutralizou o tipo eu solução de colágeno (1:1).
      Nota: Misture a solução com cuidado para evitar bolhas.
    3. Coloque a inserção da membrana em uma 6-poços microplacas, transfira a mistura para a inserção e incubar a RT por 30 min.
      Nota: Não mova as placas.
    4. Depois de confirmar a gelificação, adicione 2 mL do meio para o topo da inserção e 3 mL para o fundo do poço. Incube a matriz de fibroblastos e colágeno a 37 ° C com 5% CO2 por 5-7 dias, até a gelificação é completa e não mais contratos.
    5. Após a gelificação completa, desanexar os queratinócitos iPSC-derivado (da etapa 1.3.6) usando EDTA. Adicione 1 mL de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células desanexadas, contá-los usando um hemocytometer e 1 x 106 células de transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 2 min.
    6. Remover o sobrenadante e ressuspender 1 x 106 células em 50-100 µ l de meio epitelial de baixo cálcio 1 (EP1).
    7. Aspire todos médio na matriz (veja a etapa 2.1.5) e 1 x 106 células de queratinócitos em cada camada de fibroblastos iPSC-derivado de sementes. Incube a placa a 37 ° C com 5% de CO2 por 30 min.
      Nota: Não mova a placa e não adicionar qualquer meio de penhora de queratinócitos.
    8. Adicione 2 mL de EP1 para o topo da inserção e 3 mL de EP1 para o fundo do poço.
    9. Depois de 2 dias, aspirar todos meio em placa de inserção de membrana e mudar o meio de cálcio normal EP2 para 2 dias.
    10. Depois de 2 dias, aspirar todos médio e adicionar 3 mL do meio de cornificação somente a parte inferior para gerar uma interface ar-líquido.
    11. Manter a pele 3D organoides por até 14 dias a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias. Colha a pele 3D organoides cortando a borda de inserção e usá-lo para um estudo adicional de coloração e enxerto de pele.
  2. Enxerto de pele
    1. Realizar a anestesia por inalação em camundongos NOD/scid (masculinos, 6 semanas de idade), usando um método padrão, aprovado institucionalmente. Para enxerto de pele, raspe o pelo da pele dorsal de cada rato.
    2. Remova uma seção 1 x 2 cm da pele do rato, usando tesouras curvas com fórceps.
    3. Coloque os organoides CBMC-iPSC-derivado de pele 3D para o local do defeito e sutura usando um método de gravata-sobre curativo com suturas de seda.
    4. Observar os ratos por 2 semanas e sacrificá-los para análise histológica. O protocolo de coloração foi verificado em anteriores estudos16.

Resultados

Pele é composta, na maior parte, a epiderme e a derme. Os queratinócitos são o tipo principal de células da epiderme, e fibroblastos são o tipo de célula principal da derme. O esquema de diferenciação queratinócito é mostrado na Figura 1A. CBMC-iPCSc foram mantidos em um prato vitronectina-revestido (Figura 1B). Neste estudo, nós diferenciados CBMC-iPSCs em queratinócitos e fibroblastos usando formação EB. Geramos ...

Discussão

IPSCs humanas têm sido sugeridos como uma nova alternativa para a medicina regenerativa personalizada17. IPSCs personalizados derivado de paciente refletem características de paciente que podem ser usadas para modelagem de doença, triagem de drogas e transplante autólogo18,19. O uso de derivados de paciente iPSCs também pode superar problemas relativos as células primárias, a falta de números de celular adequada e reações imunes<...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por um subsídio da Coreia saúde tecnologia R & D projeto, Ministério da saúde, bem-estar e assuntos de família, República da Coreia (H16C2177, H18C1178).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineSigmaA2786Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)STEMCELL05893EB formation
Anti-Fibronectin antibodyabcamab23750Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibodyabcamab7800Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibodyabcamab85679Stratum corneum marker
Anti-p63 antibodyabcamab124762Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibodySanta cruzsc-7558Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRICJohnson & Johnson-Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)BD354277Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK sutureAILEEESK617Skin graft
CaCl2SigmaC5670Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type IBD3542363D skin organoid
Collagen type IVSanta-cruzsc-29010Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free MediumGibco10744-019Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucoseGibco11995065Component of differentiation medium
DMEM/F12 MediumGibco11330-032Component of differentiation medium
Essential 8 mediumGibcoA1517001iPSC medium
FBS, QualifiedCorning35-015-CVComponent of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement Gibco35050061Component of differentiation medium for fibroblast
InsulinInvtrogen12585-014Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissorProfessionalPC-02.10Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free MediumGibco17005-042Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino AcidGibco1140050Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cmHIROSEHC 2265-1Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/JThe Jackson Laboratory001303Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mmHyundai MicroH10090Plastic ware
Recombinant Human BMP-4R&D314-BPComponent of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF proteinR&D236-EGComponent of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acidSigmaR2625Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100Plastic ware
TransferrinSigmaT3705Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts CorningCLS3492Plastic ware for 3D skin organoid 
VitronectinLife technologiesA14700iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloridepeprotech1293823iPSC culture

Referências

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