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Resumo

Este estudo apresenta um método simples e viável para avaliar a resistência não preferencial a cigarrinhas-de-dorso-branco que se alimentam de arroz em condições de laboratório. Discute-se o aprimoramento das estratégias e da composição do método atual de identificação da resistência às cigarrinhas-de-dorso-branco e marrom.

Resumo

A exploração dos recursos de germoplasma de arroz resistente a insetos e genes relacionados é a principal necessidade para o melhoramento de variedades resistentes a insetos, mas a precisão da identificação de fenótipos de arroz resistentes a insetos é uma grande dificuldade. É urgente desenvolver um novo método ou melhorar os métodos existentes para rastrear o arroz quanto à resistência a insetos. Este artigo descreve um método simples e viável para avaliar a resistência do tipo não preferencial do arroz à cigarrinha-de-dorso-branco (WBPH), Sogatella furcifera, em laboratório. A preferência de WBPHs adultos que se alimentam ou habitam em plantas de arroz em maturação é continuamente analisada por comparação de pares. As mudanças dinâmicas de WBPHs em plantas de arroz são registradas e comparadas como um índice de identificação de resistência. O método atual é simplesmente operável e facilmente observável e tem um ciclo curto. O uso deste método pode ser estendido para investigar a preferência alimentar e oviposição de hemípteros semelhantes, como a cigarrinha-marrom (BPH), Nilaparvata lugens (Stål).

Introdução

O arroz é um alimento básico para mais de um terço da população mundial, e mais de 90% do arroz é produzido e consumido na Ásia 1,2. O WBPH e o BPH são as pragas mais destrutivas do arroz e uma ameaça substancial à produção de arroz3. Do ponto de vista do custo e do meio ambiente, o melhoramento e a aplicação de arroz resistente a insetos é a abordagem mais eficaz para controlar os danos causados pelas cigarrinhas 4,5,6. Assim, a triagem de recursos de germoplasma de arroz resistente é um pré-requisito fundamental para o melhoramento de arroz resistente a insetos. A precisão na identificação do fenótipo resistente ao arroz é útil para o mapeamento fino e pesquisas funcionais adicionais de genes-alvo. No entanto, a identificação fenotípica tornou-se uma grande dificuldade devido à complexidade do mecanismo de resistência. A resistência do arroz a pragas pode ser dividida em três tipos: antibiose, tolerância e não preferência7. Cada tipo reflete um aspecto diferente do mecanismo de resistência do arroz a pragas. Atualmente, o método mais utilizado de triagem de resistência a cigarrinha é a técnica padrão de triagem de caixa de sementes (SSST), que pode ser usada para identificar rapidamente a resistência fenotípica de um grande número de plantas de arroz e obter linhagens de germoplasma resistentes candidatas em um curto espaço de tempo8.

No entanto, o método SSST reflete apenas a resistência do arroz na fase de plântula e é mais eficaz na avaliação de mecanismos de resistência do tipo tolerância. A resistência do arroz a insetos também se reflete em antibioses, como taxa de sobrevivência de ninfas, duração de ninfas e taxa de eclosão de ovos, e na não preferência, como habitat, alimentação e preferência de oviposição9. Além disso, o desempenho das mudas de arroz para resistência muitas vezes não é muito estável. Com o crescimento das plantas, a resistência tende a se tornar mais estável. Portanto, o método SSST não pode refletir completamente o nível de resistência do arroz. Além disso, a resistência do arroz a pragas varia em diferentes estágios de crescimento, e existem diferenças óbvias nos mecanismos de resistência entre mudas e plantas em maturação. Estudos têm demonstrado que plantas de arroz em maturação podem liberar metabólitos secundários voláteis para evitar a infestação por insetos-praga, que se manifestam pela não seletividade do inseto na alimentação ou oviposição na planta de arroz10,11. Este também é um tipo muito crítico de mecanismo de resistência, que desempenha um papel importante na prevenção de pragas de insetos e na garantia do rendimento do arroz na maturidade.

Atualmente, a identificação da resistência do arroz por não preferência ainda é um desafio. Nesse caso, duas abordagens principais são usadas atualmente. Por um lado, cigarrinha e plantas de arroz são colocadas em uma gaiola de rede de náilon quadrada12. Embora essa abordagem seja considerada relativamente eficiente para a realização de experimentos em várias linhagens de arroz simultaneamente, ela requer um espaço experimental maior e, portanto, causa algumas dificuldades de observação e contagem devido aos materiais de rede de náilon não transparentes. Por outro lado, o método do olfatômetro de tubo Y é usado em experimentos de seleção de insetos de acordo com a diferença de substâncias voláteis liberadas do arroz. Esse método facilita a observação devido ao seu recipiente de vidro14. Um dos principais fatores limitantes desse método é que ele só pode julgar o cheiro volátil e também tem um requisito estrito sobre a estanqueidade dos dispositivos experimentais e leva muito tempo.

Aqui, descrevemos um método aprimorado para avaliar a resistência do tipo não preferência da planta de arroz aos WBPHs, que é simples de operar e fácil de observar. Este método também pode ser usado para estudar o habitat, alimentação e comportamento de preferência de oviposição de BPHs e outras pragas hemípteras.

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Protocolo

1. Preparação de cigarrinhas, plantas de arroz e gaiola de cloreto de polivinila

  1. Cigarrinhas
    1. Crie WBPHs em perfilhos de uma variedade de arroz suscetível chamada Taichung Native 1 (TN1) em gaiolas à prova de insetos e deixe-os se reproduzir naturalmente por gerações. Escolha fêmeas adultas de asas longas e recém-emergidas para novos experimentos.
      NOTA: Os WBPHs foram fornecidos pelo Instituto de Genômica Agrícola de Shenzhen, Academia Chinesa de Ciências Agrícolas.
  2. Plantas de arroz
    1. Mergulhe as sementes de cada linha de arroz em água e coloque-as em uma sala climatizada com parâmetros definidos para 28 °C, 75%-80% de umidade relativa (UR) e ciclos de 14 h de luz/10 h de escuridão por 2 dias até a germinação.
    2. Semeie 30 sementes germinadas de cada linha de arroz testada uniformemente em uma caixa de sementes de plástico (20 cm [comprimento] x 15 cm [largura] x 10 cm [altura]) que é preenchida com solo de arroz a uma profundidade de 3-4 cm.
    3. Cubra as sementes com uma fina camada de solo fino e seco; Em seguida, molhe o solo seco com água.
    4. Coloque a caixa de sementes em uma gaiola à prova de insetos de 200 mesh (75 cm [comprimento] x 75 cm [largura] x 75 cm [altura]) a 28 °C, com 75% -80% de umidade relativa e um tratamento de ciclo de 14 h de luz / 10 h de escuro em uma sala climatizada. Regue todos os dias para manter o solo úmido. Continue cultivando as plantas por 7 dias, até que atinjam o estágio de duas a três folhas.
    5. Escolha 20 mudas com potencial de crescimento semelhante, transplante as mudas em vasos de plástico de 10 cm de diâmetro (uma muda por vaso) com um orifício na parte inferior.
    6. Coloque os vasos em uma gaiola à prova de insetos de 200 mesh (75 cm [comprimento] x 75 cm [largura] x 75 cm [altura]) a 28 °C, com 75%-80% de umidade relativa e um tratamento de ciclo de 14 h de luz/10 h de escuro em uma sala climatizada, com água no fundo da bandeja, por cerca de 30 dias de crescimento até atingirem o estágio de perfilhamento com um ou dois perfilhos.
    7. Apare as plantas de arroz para um leme 48 h antes de iniciar o experimento.
  3. Gaiola cilíndrica de cloreto de polivinila
    1. Obtenha cloreto de polivinila (PVC) transparente com dimensões de 120 cm x 90 cm e espessura de 0,5 mm.
    2. Transforme-o em uma estrutura cilíndrica com uma altura de 90 cm e um diâmetro de 35 cm.
    3. Use um grampeador para fixar a área de sobreposição em ambas as extremidades do cilindro. Certifique-se de que a área de sobreposição tenha cerca de 90 cm de comprimento e 10 cm de largura.
    4. Sele toda a área de sobreposição da periferia do cilindro com fita sensível à pressão.
      NOTA: Certifique-se de que a gaiola cilíndrica possa ser colocada verticalmente ao solo e que não haja espaço óbvio entre a gaiola e o solo.
    5. Corte 200 redes de náilon de malha, cada uma com dimensões de 50 cm x 50 cm; Prepare-se o suficiente para as etapas subsequentes.
    6. Obtenha elásticos adequados; Certifique-se de que o diâmetro seja de cerca de 1,5 mm e a circunferência seja de pelo menos 32 cm quando a banda estiver contraída.

2. Tratamento de insetos e arroz

  1. Coloque uma bandeja plástica redonda com um diâmetro de 28 cm e uma altura de 10 cm em um terreno plano de concreto em uma sala climatizada com configurações de parâmetros conforme descrito na etapa 1.2.6.
    NOTA: Se o piso da estufa for solo, encontre uma superfície o mais plana possível para garantir que a bandeja seja plana.
  2. Escolha dois potes de linhas de arroz diferentes (da etapa 1.2.7) e coloque-os na bandeja, lado a lado, e encha a bandeja de plástico com água suficiente.
  3. Cobrir as duas panelas de arroz de ensaio com a gaiola cilíndrica feita no passo 1.3.4.
  4. Coloque um pedaço de rede de náilon (da etapa 1.3.5) em cima da gaiola.
    NOTA: Os dois potes de arroz na gaiola podem ser usados em grupo; Repita 15 séries de cada grupo. Coloque os potes de arroz aleatoriamente na posição e direção, mas tente garantir que as folhas das duas plantas de arroz não se toquem.
  5. Use uma armadilha de sucção artesanal para coletar 40 fêmeas adultas de WBPH recém-emergidas (consulte a seção 1.1).
  6. Coloque os adultos WBPH em um tubo de vidro (com diâmetro de 2 cm e altura de 15 cm) e cubra-o com uma rolha de esponja.
  7. Levante um canto da rede de náilon (consulte a etapa 2.4).
  8. Remova a rolha de esponja do tubo de vidro e coloque o tubo na parte central da gaiola para liberar todos os WBPHs.
  9. Cubra a rede de náilon rapidamente e use um elástico para selá-la para evitar que os WBPHs escapem (Figura 1).

3. Registo e observação

  1. Observe a distribuição de WBPHs em cada planta de arroz em 3, 6, 24, 48, 72, 96 e 120 h após a infestação.
  2. Registre o número de WBPHs em diferentes plantas de arroz, incluindo bainha de folhas e folhas de todas as direções através da gaiola transparente.
    NOTA: Seja gentil durante o processo de observação para não perturbar os WBPHs.

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Resultados

Foram utilizadas três linhagens de arroz de teste neste estudo. A linha de arroz FY01 é suscetível a WBPH e usada como grupo controle. As linhagens de arroz HZ08 e HZ06 foram linhagens transgênicas nas quais o potencial gene X1 resistente a WBPH e o gene X5 foram introduzidos, respectivamente, com base no histórico de FY01. Portanto, uma comparação de resistência do arroz entre HZ08 / HZ06 e FY01 poderia revelar se o gene inserido correspondente t...

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Discussão

As plantas de arroz em maturação liberam metabólitos secundários voláteis para controlar pragas de insetos ou reduzir a capacidade de acasalamento dessas pragas (como em WBPHs) por meio de uma estrutura física especial na superfície da bainha foliar, que é um mecanismo chave de resistência13. Nas plantas de arroz, a não preferência não está relacionada apenas à alimentação, mas também ao habitat e ao acasalamento. No entanto, os estudos atuais tê...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores são gratos ao Dr. Lang Yang por alimentar as cigarrinhas de dorso branco e cultivar arroz. Este trabalho foi apoiado por Fundos Especiais para o Desenvolvimento Industrial do Novo Distrito de Dapeng, Cidade de Shenzhen (Grant No. KY20180216 e KY20180115).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
climate-controlled roomNingbo Jiangnan Instrument FactorySZJYS2013temperature, relative humidity, photoperiod control
glass tube with sponge stopper//diameter 2 cm and height 15 cm
handmade suction trap///
insect-proof cage //200-mesh, (L × W × H, 75 × 75 × 75 cm)
Nylon net//200 mesh
paddy soil///
plastic seed box // (L × W × H, 20 × 15 × 10 cm)
plastic seed pot//10-cm-diameter
plastic tray// (D × H, 28  × 10 cm)
rice seed of FY01 line//60 seeds
rice seed of HZ06 line//30 seeds
rice seed of HZ08 line//30 seeds
rice seed of TN1 variety//many
Rubber band//diameter is 1.5 mm, and the circumference is 32 cm
scotch tape///
SPSS Statistics 19.0IBM Corporation/statistical data analysis
stapler///
transparent PVC //120 cm × 90 cm dimensions and thickness of 0.5 mm

Referências

  1. Du, B., et al. Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. , (2009).
  2. Khush, G. S. Strategies for increasing the yield potential of cereals: case of rice as an example. Plant Breeding. 132 (5), 433-436 (2013).
  3. Heong, K. L., Hardy, B. Breeding for resistance to planthoppers in rice. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research . 401-409 (2009).
  4. Han, Y., Wu, C., Yang, L., Zhang, D., Xiao, Y. Resistance to Nilaparvata lugens in rice lines introgressed with the resistance genes Bph14 and Bph15 and related resistance types. PLoS One. 13 (6), e0198630(2018).
  5. Arora, R., Sandhu, S. Advances in Breeding for Resistance to Hoppers in Rice. Breeding Insect Resistant Crops for Sustainable Agriculture. , Springer. Singapore. 101-130 (2017).
  6. Sarao, P. S., et al. Donors for resistance to brown planthopper Nilaparvata lugens (Stål) from wild rice species. Rice Science. 23 (4), 219-224 (2016).
  7. Horgan, F. Mechanisms of resistance: a major gap in understanding planthopper-rice interactions. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. Heong, K. L., Hardy, B. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research. 281-302 (2009).
  8. He, J., et al. High-resolution mapping of brown planthopper (BPH) resistance gene Bph27 (t) in rice (Oryza sativa L). Molecular Breeding. 31 (3), 549-557 (2013).
  9. Ling, Y., Weilin, Z. Genetic and biochemical mechanisms of rice resistance to planthopper. Plant Cell Reports. 35 (8), 1559-1572 (2016).
  10. Qi, J., et al. The chloroplast-localized phospholipases D α4 and α5 regulate herbivore-induced direct and indirect defenses in rice. Plant Physiology. , 111(2011).
  11. Qiu, Y., Guo, J., Jing, S., Zhu, L., He, G. High-resolution mapping of the brown planthopper resistance gene Bph6 in rice and characterizing its resistance in the 9311 and Nipponbare near isogenic backgrounds. Theoretical and Applied Genetics. 121 (8), 1601-1611 (2010).
  12. Liu, Y., et al. A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice. Nature Biotechnology. 33 (3), 301(2015).
  13. Lou, Y., et al. Differences in induced volatile emissions among rice varieties result in differential attraction and parasitism of Nilaparvata lugens eggs by the parasitoid Anagrus nilaparvatae in the field. Journal of Chemical Ecology. 32 (11), 2375(2006).
  14. Da Silva, A. G., et al. Non-preference for oviposition and antibiosis in bean cultivars to Bemisia tabaci biotype B (Hemiptera: Aleyrodidae). Revista Colombiana de Entomologia. 40 (1), 7-14 (2014).

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