Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo

Resumo

O objetivo do presente protocolo é testar a capacidade de células progenitoras derivadas de tecido adiposo de perivascular humana de se diferenciar em várias linhagens de célula. Diferenciação foi comparada com as células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana, que é conhecida por se diferenciar em adipócitos, osteócito e linhagens de condrócitos.

Resumo

Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic. Adipogenic diferenciação de células progenitoras é um mecanismo importante conduzir a expansão do tecido adiposo e disfunção em resposta à obesidade. Mudanças de entendimento para o tecido adiposo de perivascular (PVAT) é, portanto, clinicamente relevantes na doença metabólica. No entanto, estudos anteriores têm sido predominantemente realizada em mouse e outro animal modelos. Este protocolo usa humana torácica PVAT amostras coletadas de pacientes submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. Tecido adiposo da aorta ascendente foi recolhido e utilizado para explantação da fração vascular do estroma. Anteriormente confirmamos a presença de células adiposas reprodutoras em PVAT humana com a capacidade de se diferenciarem em lipídios contendo adipócitos. Neste estudo, mais analisamos o potencial de diferenciação das células da fracção do estroma vascular, presumivelmente, contendo células progenitoras multi potente. Nós comparamos PVAT-derivado de células de medula óssea humana MSC para diferenciação em adipogenic, osteogênica e linhagens de chondrogenic. Após 14 dias de diferenciação, manchas específicas foram utilizadas para detectar o acúmulo de lipídios nos adipócitos (O óleo vermelho), calcificar depósitos em células osteogênicas (vermelho de alizarina), ou glicosaminoglicanos e colagénio nas células chondrogenic (Trichrome de Masson). Enquanto a medula óssea MSC eficientemente diferenciada em todas as três linhagens, PVAT-derivado de células tinham adipogenic e chondrogenic potencial, mas faltava-lhe potencial osteogênico robusto.

Introdução

Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic¹. Este tecido se expande através da hipertrofia dos adipócitos maduros e de diferenciação de novo de MSC residente de adipócitos. Tecido adiposo de perivascular (PVAT) envolve os vasos sanguíneos e regula a função vascular^2,3. Expansão de PVAT induzida pela obesidade exacerba patologias cardiovasculares. Enquanto o potencial multipotent de MSC de depósitos de tecido adiposos subcutâneos humanos têm sido bem estudadas^4,5, nenhum estudo tem explantados e avaliada a capacidade de diferenciação das células progenitoras humano PVAT-derivado, provavelmente devido a a invasividade dos contratos. Assim, o objetivo deste trabalho é fornecer uma metodologia de explantes e propagar as células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes com doença cardiovascular e testar a sua propensão para diferenciar a osteogênica, chondrogenic e adipogenic linhagens. Nossa fonte de PVAT é do local da anastomose do enxerto desvio na crescente aorta de pacientes obesos submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. PVAT recentemente isolado é enzimaticamente dissociada e a fração do estroma vascular é isolada e propagada in vitro, permitindo-nos testar, pela primeira vez, a capacidade de diferenciação de células progenitoras derivadas PVAT humana.

Usando principal culto humano PVAT do estroma vascular fração, testamos três ensaios projetados para induzir células tronco/progenitoras para diferenciar em direção adipogenic, osteogênica, ou linhagens chondrogenic. Nosso estudo prévio identificou uma população de CD73 + CD105 + e células PDGFRa + (CD140a) que podem verdadeiramente diferenciar em adipócitos⁶, apesar de sua multipotency não foi testado. PVAT regula diretamente de Tom e inflamação vascular⁷. A justificativa para testar o potencial de diferenciação dessa população celular novela é para começar a entender a influência especializada de PVAT na função vascular e mecanismos de expansão PVAT durante a obesidade. Esta metodologia melhora o nosso entendimento das funções das células progenitoras derivadas de tecido adiposo e nos permite identificar e comparar as semelhanças e diferenças de células progenitoras de fontes diferentes de tecido. Nós construímos abordagens estabelecidos e validados para isolar e diferenciando MSC no sentido de diferentes linhagens e otimizar procedimentos para maximizar a viabilidade de células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas têm aplicações amplas nos campos da haste e progenitoras célula pesquisa e tecido adiposo desenvolvimento.

Protocolo

O uso de tecidos humanos neste estudo foi avaliado e aprovado pelo institucional Review Board de Maine centro médico, e todos os funcionários receberam treinamento adequado antes da experimentação.

1. preparações

1. Fazer reserva de dissociação por reconstituir 50mg colagenase/dispase animal-free misturar eu solução com 1 mL de solução de trabalho de 1 mg/mL preparar nanopure H₂O. adicionando 49 mL de glicose alta DMEM contendo 1% w/v BSA para o reconstituído colagenase / solução de Dispase. Loja alíquotas de trabalho 5ml a-20 ° C e quente a 37 ° C, usando um antes do banho de água para usar.
2. Faça a solução antibiótica, adicionando 1 mL de solução de antibiótico/antimicótico 100 x (concentração final é 200 penicilina unidades/mL, de 200 unidades/mL Estreptomicina e de 0,5 µ g/mL fungizone) a 49 mL de HBSS e armazene no gelo.
3. Preparar a solução de gelatina (0,2% p/v), dissolvendo a gelatina de 200 mg de pele bovina em 100 mL de nanopure H₂Autoclave O. a solução para 20 min e armazenar a 4 ° C.
4. Preparar 500 mL de meio de crescimento PVAT: glicose alta DMEM/F12 com suplemento de glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, suplementado com 10% FBS e agente antimicrobiano de 100 µ g/mL (ver Tabela de materiais).
5. Preparar a mídia de indução de adipogenic 50ml: glicose alta de 40,8 mL DMEM, suplementado com mídia de crescimento 7,5 mL PVAT, 500 µ l de 100 x antibiótico/antimicótico solução (concentração final é 100 penicilina unidades/mL, 100 unidades/mL Estreptomicina e fungizone 0,25 µ g/mL), 0.5 mM IBMX (estoque de 500 mM em 0.1 M NaOH), 1 dexametasona µM (estoque de 1 mM em etanol), 5 µM rosiglitazone (estoque de 5 mM em DMSO), 33 biotina µM (estoque de 66 mM em DMSO), 100 nM insulina (200 ações µM em 0,1% de ácido acético) e o ácido pantotênico 20 µM (estoque de 100 mM H₂ Ó).
6. Preparar 50 mL de mídia de indução de controlo para a linhagem de adipogenic: glicose alta de 40,8 mL DMEM suplementado com mídia de crescimento PVAT 7,5 mL e 500 µ l de caneta-estreptococos (estoque de x 100).
7. Preparar a mídia de manutenção adipogenic 50ml: glicose alta de 41,5 mL DMEM suplementado com 7,5 mL PVAT crescimento mídia da etapa 1.3, 500 µ l pen-estreptococos (estoque de x 100), dexametasona 1 µM (estoque de 1 mM em EtOH), 33 biotina µM (estoque de 66 mM em DMSO), 100 insulina nM (200 µM ações 0,1% ac ácido ETIC) e ácido pantotênico de 20 µM (estoque de 100 mM em H₂O).
8. Preparar 500 mL de mídia de crescimento para as linhagens osteogênicas e chondrogenic: suplemento de FBS, 1 glutamina x glicose alta αMEM suplementado com 10% (ver Tabela de materiais) e 5 mL de caneta-estreptococos (estoque de x 100).
9. Preparar 50 mL de mídia de indução para a linhagem osteogênica: 50 mL de medula óssea mídia crescimento MSC suplementada com 10 nM dexametasona e β-glicerofosfato de 10 mM.
10. Preparar 50 mL de mídia de indução para a linhagem de chondrogenic: 50 mL de medula óssea mídia crescimento MSC suplementada com 100 dexametasona nM e 50 µ g/mL fosfato de sódio ascorbato-2-10 ng/mL TGFβ1. Para as condições osteogênicas e chondrogenic, a mídia de crescimento basal da medula óssea MSC irá servir como a mídia não-indução.

2. Protocolo 1: Cultura humana PVAT células da fracção do estroma Vascular

Nota: PVAT é ressecado do local da anastomose do enxerto na aorta ascendente de pacientes anestesiados submetidos a procedimentos de enxerto de bypass de artéria coronária. PVAT aórtica é colocado em um 15ml cónico contendo 10 mL gelo frio alta glicose DMEM F12 e transferido da sala de cirurgia para laboratório até 2 horas após ressecção. PVAT aórtica é tecido Descartado durante procedimento de bypass e tem sido considerado como pesquisa de sujeitos não-humanos pelo Conselho de revisão interna do Maine Medical Center.

1. Este protocolo é para um pedaço de ~ 500 mg de PVAT humana (aproximadamente 3 x 1 x 0,5 cm³). Transferi PVAT humano fresco de DMEM para um tubo cônico de 50 mL contendo 25 mL de solução antibiótica. Incube com balanço por 20 min a 4 ° C. Enquanto o PVAT em solução antibiótica, descongelar uma alíquota do buffer de dissociação a 37 ° C.
2. Adicionar 50 µ l de solução de antibiótico/antimicótico 100 x 5 mL de tampão de dissociação e esterilizar usando um filtro de seringa 0,22 µm. Adicione 1 mL de solução de gelatina para 1 bem de uma placa de 24. Um capuz de fluxo laminar, utilize Pinças esterilizadas e tesoura para transmitir PVAT da solução antibiótica para uma placa de Petri estéril. Adicionar 1 mL de tampão de dissociação previamente aquecido no tecido e picar finamente o tecido inteiro em uma pasta (sem pedaços maiores que ~ 2 x 2 mm²) usando Pinças esterilizadas e tesoura de dissecação.
3. Transferir o chorume de 1 mL a 4 mL de tampão de dissociação e incubar o tubo em seu lado em um agitador orbital de pre-aquecido a 37 ° C a 200 rpm por 1h. Depois de 1h, sem pedaços de tecido visível estará presentes, e a solução aparecerá como uma suspensão de células nublado.
4. Filtre a solução através de um filtro de célula 70 µm situado no topo de um tubo cónico de 50 mL. Lave o filtro com uma solução antibiótica 10ml adicionais para capturar o maior número de células possível. Não esprema o filtro.
5. Granule as células para 12 min a 300 x g em uma centrífuga de balde oscilante.
   Nota: Após a centrifugação, o tubo será separado em uma camada gordurosa de adipócitos, uma interfase e uma pelota. A pelota é a fração vascular do estroma contendo células endoteliais, células do sistema imunológico, as células do sangue e células progenitoras.
6. Resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS e centrifugar durante 5 min à 300 x g. Repita esta etapa para um total de 2 lavagens em HBSS. Após a lavagem final, não lise os glóbulos vermelhos. Repetidas tentativas com vários buffers comercialmente disponíveis e tempos de incubação têm levado a reduções marcadas na fixação de células progenitoras e viabilidade.
7. Aspire a gelatina da placa de 24 poços. Lave delicadamente o bem 1x com HBSS remover gelatina desacoplada.
8. Resuspenda o pellet de fração vascular do estroma com hemácias intactas em 1 mL de sementes para a gelatina-revestido e mídia de crescimento bem. Adicione FGF2 humana (resuspended em PBS suplementado com BSA de 0,01% w/v) a uma concentração final de 25 ng/mL em meio de cultura. Incube durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO₂.
9. No dia seguinte, remover mídia de crescimento e lavagem poços 5x com HBSS para remover células vermelhas do sangue e as células mortas. Adicione 1 mL de meio de crescimento fresco suplementado com 25 ng/mL FGF2.
10. Mudar a cada 48h, certificando-se de suplemento com 25 ng/mL de mídia FGF2 fresco cada vez.
11. As células tipicamente alcançar confluência 100% 7-10 dias após explant; Então células de passagem:
    1. Aspirar 2, monocamadas de mídia e lavagem de crescimento x em 1 mL HBSS. Aspire HBSS todos dos poços e adicione algumas gotas de solução de dissociação de célula.
    2. Torneira e agite a chapa várias vezes e incubar a 37 ° C com 5% de CO₂ por 5 – 7 min levantar as células. Adicionar ~ 1 mL de meio de cultura fresco para as células desanexadas e distribuir 500 µ l a 2 poços de uma placa de 24, cada contendo mídia de crescimento 500 µ l e 25 ng FGF2.
12. Continue a expandir células humanas PVAT-derivado, conforme indicado no passo anterior. Cada passagem deve ser maior do que uma divisão de 1:2. As células são passadas de 5 a 7 vezes antes de alocar para ensaios de diferenciação.

3. protocolo 2: Cultura medula óssea humana MSC colônias

Nota: Medula óssea humana MSC são isoladas como descrito⁸ e armazenado como cedo passagem congelada estoques em congelar mídia (70% FBS 20% basal DMEM e 10% DMSO) ~ 100.000 células/ml no líquido N₂.

1. Rapidamente, descongelar um frasco de MSC medula óssea a partir do líquido N₂ em um banho-maria a 37 ° C e a placa para um poço de uma placa de cultura de 6-poços contendo 3 mL de meio de crescimento de MSC e incubar durante uma noite a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. No dia seguinte, meios de cultura MSC de aspirar e lavar as células 3 x em 2 mL de HBSS. Na confluência de 100%, meios de crescimento de aspirar e lavar as células 3 x em 2 mL de HBSS. Adicionar solução de desprendimento 500 µ l/poço de célula e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ por 5 min. torneira a placa para garantir que todas as células são desalojados e distribuir conteúdo 2 poços de uma placa de 6 contendo 2 mL MSC crescimento meios de comunicação.
3. Expanda a medula óssea humana e MSC PVAT-derivado em paralelo para aproximadamente 5-7 passagens ou até quantidades suficientes para o teste tenha sido alcançado.

4. protocolo 3: Placa e induzir Adipogenic, osteogênica e linhagens de Chondrogenic

1. Placa de número da medula óssea e células PVAT-derivado por bem de uma placa de 12 e apropriado Replica para cada condição experimental. Para adipogenic e condições osteogênicas, ~ 200, 000 – 225.000 células/poço é necessários, para chondrogenic condições, 150.000 – 175.000 células/poço são necessários.
   Nota: Nós corremos um mínimo de N = 3 poços replicar para controle e induzido condições para cada linhagem experimental para um total de 2 independente funciona (N = total de 6 repetições).
2. Desassocie as células de tanto a população de células progenitoras PVAT humana e a população de MSC medula óssea humana usando solução de desprendimento de célula e incubação a 37 ° C e 5% de CO₂ para populações de piscina 5 min. em frascos cônicos 15ml separado. Gire o frasco para baixo a 500 x g durante 7 min para as células de Pelotas. Resuspenda em 1 mL de PBS e usar um hemocytometer para estimar o número de células.
3. As células em pratos 12-poços da placa como indicado no ponto 4.1. Fornece pratos separados para adipogenic induzido e não induzida, osteogênica e as condições para que a condição não induzida pode ser fixo em um ponto do tempo anterior sem interromper continuando a cultura da condição induzida.
4. Adicione 1,5 mL de adipogenic e indução osteogênica media a cada poço da condição induzida. Adicione 1,5 mL de adipogenic e osteogênica não-indução mídia a cada poço da condição não induzida. Começa a incubação do adipogenic e populações de células osteogênicas de induzidos e não induzida em 37 ° C e 5% de CO₂.
5. Spin para baixo o volume restante de células humanas de progenitor PVAT e medula óssea humana MSCs para 7 min a 500 x g.
6. Determine o volume necessário para Ressuspender o restante da medula óssea e células PVAT-derivado pelotas para atingir uma densidade de 100.000 células/10 µ l (10⁶ células/mL). Resuspenda pelotas do volume calculado de mídia de crescimento MSC para indução de linhagem de chondrogenic. Movimente suavemente o volume das células acima e para baixo usando uma pipeta para garantir uma distribuição homogénea.
7. Pipete uma gotícula de 10 µ l da solução concentrada de células para o centro de cada poço para formar um micromass de 100.000 células. Coloque 1 mL de estéril H₂O no poço adjacente para evitar a evaporação. Incubar as culturas micromass por 2 h a 37 ° C e 5% CO₂ para permitir que o micromass para agregar.
8. Depois de 2 horas, cuidadosamente adicionar mídia de diferenciação chondrogenic cravada com 10 ng/mL TGFβ1 humana a cada um dos poços induzida-condição. Cuidadosamente adicione 1,5 mL da mídia não-indução (meio de crescimento da medula óssea MSC) nos poços de condição não induzida. Use chapas separadas 12-poços para as induzido e não induzida condições para que a condição não induzida pode ser fixo em um ponto do tempo anterior.

5. protocolo 4: Cultura Adipogenic, osteogênica e linhagens de Chondrogenic por 14 dias

1. Cultura as condições de todas as três linhagens induzidas e não induzida por 4 dias a 37 ° C e 5% CO₂, refrescante mídia cada 2 dias. No dia 4, altere a condição de linhagem adipogenic induzido de mídia de indução aos meios de manutenção para o restante do ensaio.
2. Corrigir todas as condições não induzida em formol a 10% por 12 h. Dispose de formalina e lavar tudo fixada poços 2x em PBS para remover todos os vestígios de formol. Armazenar as placas em PBS a 4 ° C até o processamento.
3. Cultura as condições induzidas por um total de 14 dias, refrescante mídia cada 2 dias. Adicione TGFβ1 fresco em 10 ng/mL concentração final com cada atualização de mídia da indução chondrogenic. Continue a cultura da linhagem de adipogenic na adipogenic manutenção mídia e mídia de indução de linhagem osteogênica, atualizando a cada 2 dias. No dia 14, fixar condições tudo induzidas por 12 h em formol a 10% para a coloração.
4. Raspar ou despeje o micromass na condição induzida chondrogenic dentro de um estojo para a incorporação. Desidrate o micromass em uma série de banhos de álcool cada vez mais concentrado por 5 min, começando em 70%, em seguida, 80%, duas vezes em 95% e duas vezes mais em álcool absoluto. Coloque a fita em um agente de dealcoholization e então finalmente incorporar a gaveta em cera de parafina para corte e coloração.

6. protocolo 5: Coloração Adipogenic condição com óleo O vermelho

1. Prepare solução estoque de óleo vermelho O dissolvendo 350 mg de óleo vermelho em 100 mL de isopropanol 100%. Misture por 2 h com uma barra de agitação e vácuo através de um filtro de 0,2 µm. Solução de reserva pode ser armazenada no escuro à temperatura ambiente por 1 ano.
2. Prepare o óleo vermelho O solução de trabalho misturando 3 partes de solução de 2 partes diH₂0 (por exemplo, 60 mL da solução de 40 mL diH₂0). A concentração final de óleo vermelho O da solução de trabalho é de 2,1 mg/mL.
3. Remova todo fluido de poços. Lave cada bem 2x com 60% de isopropanol, certificando-se de remover completamente toda a água dos lados dos poços. 60% de isopropanol, Aspire e rapidamente adicionar solução de óleo vermelho O trabalho sem tocar as paredes dos poços para cobrir o fundo. É fundamental que este passo é feito rapidamente, assim que os poços não secar.
4. Se adicionarmos o óleo vermelho O, incube durante 10 minutos à temperatura ambiente com balanço suave.
5. Remover todo O vermelho de óleo e adicione imediatamente destilada H₂O. Wash com água destilada H₂O para 10m começar a remover desacoplado óleo vermelho O. Depois de 10 min, Aspire O vermelho de óleo e repita o procedimento de lavagem 3 x.
6. Uma vez que a lavagem é completa, adicionar PBS e as células da imagem. Armazenar as células coradas em PBS a 4 ° C.

7. protocolo 6: Coloração osteogênica condição com vermelho de alizarina

1. Remova todo fluido de cada poço. Adicionar um volume adequado de solução de mancha de vermelho de alizarina 2% a cada poço (1,5 mL por bem para uma placa de 12) e inclinar suavemente a placa lateral-lateral até que a solução cobre completamente o fundo do poço.
2. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente. Vermelho de alizarina remova os poços. Suavemente, enxágue cada poço quatro vezes com água destilada H₂O, tomando cuidado para não deslocar os cristais de cálcio. Deixe-a secar.

8. protocolo 7: A coloração tricromo Chondrogenic condição com Masson

1. Asse slides em forno seco de 60 ° C por 30 min. seções Deparaffinize e hidrato com água destilada.
   1. Para hidratar, coloque slides em três incubação do 5min com agentes de dealcoholization, seguidos de incubação do 5 min em decrescente concentrações de álcool da seguinte forma: dois em 100% (etanol absoluto) em 95% de álcool, dois em 80%, dois em 70% e, finalmente, dois em água destilada H₂O. Slides pode permanecer em H₂O enquanto fixador de Bouin está preparada.
2. Lugar de 40 mL de fixador de Bouin em uma jarra de plástico coplin microwavable (descoberta). Microondas em alta para trazer a temperatura de 55 ° C. Coloque o slide em uma solução aquecida por 20 min; deixe descansar no balcão coberto. Lavar em água corrente por 10 minutos ou até que todos da cor amarela desaparece.
3. Mancha de seções em hematoxilina de Weigert por 10 min. Lave em água corrente por 10 minutos.
4. Mancha de seções em solução de fucsina ácida escarlate do Beibrich de 10 min. lavar 3 x 10 min em água da torneira. Mordente slides em solução de ácido fosfotúngstico/fosfomolíbdico durante 10 minutos. Não enxague.
5. Coloque slides diretamente na solução azul de anilina durante 10 min. enxaguar com dois mergulhos breves na água da torneira.
6. Coloque slides em solução de ácido acético a 1% para 3 a 5 min. Lave em água da torneira por 1 min. lugar em etanol a 95% por 1 min. desidratando, conforme indicado no passo 5.4 e montagem com resina sintética.

Resultados

Isolamento da fração vascular do estroma de PVAT humana

A figura 1A mostra um diagrama esquemático da região anatômica, onde obteve-se o PVAT sobrejacente a aorta ascendente. Descrevemos anteriormente as populações de pacientes submetidos a revascularização do qual estas amostras foram derivadas⁶enxerto de bypass. A figura 1B

Discussão

Células progenitoras adiposa de diferentes depósitos variam amplamente no fenótipo e diferenciação potencial⁹. Cultivo de progenitores PVAT-derivado de um único doador paciente na indução simultânea para baixo três linhagens diferentes, adipogenic, osteogênica e chondrogenic, permite uma investigação bem controlada da capacidade deste romance pluripotentes população de células progenitoras. A metodologia descrita neste relatório pode ser usada para testar a capacidade de diferenci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G