Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática

Resumo

Aqui, nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo murino clìnica relevante do cancro do fígado que recapitulando as características imunes típicas do cancro hepatocelular (HCC).

Resumo

A ausência de um modelo animal clinicamente relevante abordando as características imunes típicas do câncer hepatocelular (HCC) tem impedido significativamente a elucidação dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de estratégias imunoterapêuticas inovadoras. Para desenvolver um modelo animal ideal que recapitulando o HCC humano, os ratos masculinos imuno-competentes de C57Bl/6J recebem primeiramente uma injeção do tetracloreto de carbono (CCL₄) para induzir a fibrose do fígado, a seguir recebem hepatócitos oncogênico histològica-normais do macho novo Antígeno SV40 T (TAg)-camundongos transgênicos (MTD2) por inoculação intra-esplênica (ISPL). Andrógeno gerado em ratos machos receptores na puberdade inicia a expressão de TAg o controle de um promotor específico do fígado. Como resultado, os hepatócitos transferidos tornam-se células cancerosas e formam massas tumorais no cenário de fibrose hepática/cirrose. Este modelo novo imita a iniciação e a progressão humanas do HCC no contexto da fibrose/cirrose do fígado e reflete as características as mais típicas do HCC humano que inclui a deficiência orgânica imune.

Introdução

O câncer hepatocelular (HCC) é o tipo de câncer mais rapidamente crescente nos Estados Unidos (US)^1,2,3. Todos os anos, aproximadamente 850.000casos novos são diagnosticados^4,5 e 700.000 pacientes morrem desta doença letal^6,7,8,9,10 , tornando-se a segunda maior causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. A gerência de HCC inclui o resection cirúrgico, a transplantação, a ablação, o chemoembolization, ou terapias sistemáticas, tais como sorafenib¹¹. O diagnóstico e a gerência adiantados com resection cirúrgico ou transplantação têm o benefício total o mais elevado da sobrevivência⁴. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta-se em estágio posterior e requer manejo com ablação, Quimioembolização ou sorafenib¹². Sorafenib, um inibidor da tirosina quinase do receptor (rtki), foi aprovado pelo alimento e pela administração da droga em 2008 como a única terapia de droga sistemática disponível para tratar o HCC irressecável. Embora a droga só forneça um aumento modesto na sobrevida global, de 7,9 a 10,7 meses¹³, ele forneceu uma nova estratégia terapêutica que poderia ser utilizada para gerenciar o HCC.

Manipular o sistema imunológico para eliminar os cânceres estabelecidos é um campo de rápido crescimento na pesquisa de câncer¹⁴. Estudos imunológicos de Checkpoint têm consideravelmente avançado^{desenvolvimento de fármacos}imunoterapêuticos no tratamento do câncer^15,16. O FDA aprovou o uso de anticorpos (ABS) contra o antígeno citotóxico T-linfócito 4 (CTLA-4), a proteína de morte celular programada 1 (PD-1), e seu ligante PD-L1 para o tratamento de melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço e câncer de bexiga^{17, 18 anos} de ^{, 19} anos de ^{, 20}. ensaios clínicos de monoterapia ou terapêutica combinada com um ou vários anticorpos contra PD-1, PD-L1 ou CTLA-4 para o tratamento de HCC avançado estão em curso^21,22,23, e alguns testes mostraram resultados favoráveis. Em 2017, o FDA concedeu a aprovação acelerada para o anticorpo anti-PD-1 para tratar pacientes de HCC, que são resistência ao sorafenib, mas a taxa de resposta total desta terapia é somente 14,3%. Outras estratégias não foram traduzidas para a prática clínica neste momento^24,25. Superando a tolerância imune profunda tumor-induzida para melhorar a terapia imune do Checkpoint²⁶; prevendo a eficácia da terapia imune do Checkpoint; prevenção de acontecimentos adversos relacionados com a imunidade; Otimizando a rota de administração, dosagem e frequência; e encontrar combinações efetivas de terapias^27,28,29 todos permanecem tarefas extremamente desafiadoras.

Existem várias abordagens convencionais usadas para induzir a HCC em modelos de mouse atualmente e são utilizadas dependendo da questão de pesquisa particular do investigador³⁰. Os modelos quimicamente-induzidos do rato de HCC com compostos genotóxico imitam a malignidade ferimento-induzida. Os modelos de xenograft através da implantação ectópica ou transplantação orthotopic do de linhas de pilha de HCC são apropriados para a seleção da droga. Vários camundongos geneticamente modificados foram projetados para investigar a fisiopatologia da HCC. Camundongos transgênicos expressando genes virais, oncogenes e/ou fatores de crescimento permitem a identificação de vias envolvidas na hepatocarcinogênese. Devido às limitações inerentes, estes modelos não recapitulam as características imunes típicas consideradas no HCC humano, que impediu significativamente a elucidação dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de estratégias imunoterápicos inovativas^{14 ,15}. Recentemente, criamos um modelo murino clinicamente relevante. Este modelo novo não somente imita a iniciação e a progressão humanas de HCC mas igualmente reflete a maioria de características típicas da doença humana que inclui a deficiência orgânica imune. Caracterizamos suas características biológicas e imunológicas. Aproveitando este modelo novo, nós exploramos várias estratégias imunoterápicos para tratar HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. esta plataforma única nos permite estudar mecanismos de imunotolerância induzida por tumor e desenvolver estratégias terapêuticas de prova de conceito para HCC em direção a eventual tradução clínica.

Protocolo

Nota: todo o procedimento, incluindo os sujeitos animais foram aprovados pelo IACUC na Universidade de Missouri. Todos os camundongos receberam cuidados humanitários de acordo com os critérios delineados no "guia para o cuidado e uso de animais de laboratório". O procedimento a seguir para isolamento e inoculação celular deve ser realizado em um capô. Todos os artistas devem usar o equipamento de proteção individual padrão para o manuseio dos camundongos e tecidos.

1. indução de fibrose hepática e cirrose com injeção de IP de tetracloreto de carbono (CCl₄)

Nota: consulte a Figura 1. (CCl₄ é reagente altamente perigoso, ele deve ser segurado com cuidado e com luvas químico-resistentes desgastando)

1. Obter ratos machos C57BL/6J com seis a oito semanas de idade (ver tabela de materiais).
2. Prepare 10% CCl₄ (v/v) solução em óleo de milho em um tubo de centrífuga. Determine o volume total com base no número de camundongos a serem injetados (consulte a etapa 1,6).
3. Use a técnica adequada de manuseio de camundongos para selecionar um mouse para injeção.
4. Contenha manualmente o rato com o seu lado dorsal (abdómen) para cima.
5. Limpe o local da injeção na parede abdominal do rato esfregando com álcool 70%.
6. Injete camundongos machos C57BL/6J com 160 μL de solução de CCl₄ de 10% por injeção intraperitoneal (IP) usando uma agulha descartável de 25 gauge.
7. Assegure-se de que a agulha penetre apenas através da parede abdominal (aproximadamente 4-5 milímetros) com chanfrar-lado acima e ligeiramente angular em 15-20 graus.
8. Injectar ratos duas vezes por semana durante um total de quatro semanas-cada rato receberá um total de oito injeções.
   Nota: duas semanas após a última injeção, os camundongos tratados estão prontos para a inoculação de hepatócitos oncogênicos de ISPL de MTD2 camundongos.

2. isolando tag-hepatócitos transgênicos da linha MTD2 camundongos

Observação: consulte a tabela 1 para obter receitas de solução.

Solução de sal equilibrado de 10x Earle sem CA ou magnésio (EBSS sem CA ou magnésio)	4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 · H2o 10 g de dextrose Adicione a água a 1 litro, pH a 4,32 Passar pelo filtro
Solução 1	20 mL 10x EBSS sem CA ou mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1.5 M HEPES 10 mL de 10 mL de EGTA Adicionar água a 200 mL
Solução 2	100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M HEPES Adicione a água a 1 litro
0,75% solução de colagenase	15 mg de colagenase tipo 1 20 mL de solução 2
Meio completo	2 O RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x penicilina-estreptomicina

Tabela 1: receitas de soluções.

1. Obter linha MTD2 camundongos³⁸ para servir como a fonte de hepatócitos oncogênicos.
2. Anestesiam ratos de 5 semanas de idade MTD2 usando 2,5% de isoflurano.
   Nota: a anestesia apropriada será verificada pelo método da pitada do dedo do pé. Em resumo, usando dois dedos, dar o dedo do pé do mouse/Foot um bom aperto. Se não houver reação de abstinência, o animal é julgado profundamente o suficiente para iniciar a cirurgia.
3. Quando sedado adequadamente, coloc ratos em uma posição supina e fixe as extremidades com a fita para fornecer a exposição adequada da superfície abdominal.
4. Realize uma incisão laparotomia Midline usando tesouras ao longo do comprimento da Linea Alba grande o suficiente para fornecer uma exposição adequada do fígado.
5. Deslocar os intestinos para a esquerda para proporcionar uma melhor exposição do fígado e da Tríade Portal.
6. Dissecar acima do fígado para expor a veia cava inferior (IVC).
7. Ligate o IVC acima do fígado usando uma braçadeira da artéria.
8. Voltando à borda inferior do fígado, use uma agulha de borboleta (ver materiais) para obter acesso IV à veia porta. Fixe o cateter à mão.
9. Perfuse sucessivamente o fígado do rato usando uma seringa da injeção em 8,9 ml/min com com 15 ml da solução 1, 15 ml da solução 2 do colagenase de 0,75%, e 15 ml da solução 2 através do cateter.
10. Colha o fígado perfundidos cortando e tomando a massa de tumor de MTD2 ratos em um tubo cônico de 50 ml com 10-15 ml de PBS.
11. Remova o PBS e lave um tempo adicional com PBS; Não centrifugue nesta etapa.
12. Corte o fígado em pedaços menores usando tesouras e depois lave novamente com PBS 2x para remover o sangue restante.
13. Adicione 5 mL de meio RPMI completo ao tubo cônico e mince continuamente o fígado com tesouras para pequenas peças (< 3 mm)-o tecido deve passar suavemente por uma pipeta de 5 mL.
14. Adicione RPMI completo a um volume final de 30 mL e suspenda o fígado usando uma pipeta de 5 mL.
15. Filtre a solução mista com um filtro de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL.
16. Lave o filtro diversas vezes com RPMI completo e ajuste o volume final a 50 mL adicionando o meio adicional de RPMI.
17. Gire rapidamente a suspensão por centrifugador a um máximo de 500 rpm; uma vez que a velocidade é acelerada a 50 x g, o centrifugador deve ser parado.
18. Decantar o sobrenadante e suspender as pelotas em 20 mL de PBS.
19. Contagem de células usando trypan exclusão azul e um Hemocytometer, em seguida, ajustar a concentração celular para 2,5 x 10⁶/ml para a seguinte inoculação celular.
    Nota: o rendimento esperado de 5 gramas de tecido tumoral é de 80 milhões hepatócitos com viabilidade > 95%.

3. inocular os hepatócitos de camundongos MTD2 para o fígado de camundongos selvagens tipo C57BL/6J por injeção ISPL

1. A técnica asséptica deve ser utilizada em todos os procedimentos
2. Anestesiam os camundongos C57BL/6J machos tratados com CCl₄com 2,5% de isoflurano, os camundongos devem ser tratados com lubrificante ocular para evitar que os olhos SECem.
3. Preparar seringas com 200 μL de hepatócitos para injecção.
4. Quando sedado adequadamente, posicione os camundongos com o lado esquerdo para cima.
5. Raspar todo o flanco esquerdo dos camundongos, em seguida, esfregar a área, alternando entre 70% álcool e Betadine três vezes.
6. Administrar 5 mg/kg de carprofeno subcutaneouly antes da incisão cirúrgica.
7. Faça uma incisão de 1 cm no flanco esquerdo paralelo à 13^ª costela do início extremo dorsal logo abaixo do músculo da coluna vertebral.
8. Identifique o baço, então exteriorização-o usando fórceps Blunt-pointed.
9. Grampeie o baço com dois clipes de titânio de tamanho médio. Coloque ambos os clipes entre a artéria esplênica e a veia, deixe espaço entre os clipes para cortar mais tarde após a inoculação.
   Nota: o objetivo é isolar o pólo inferior do baço para reduzir o risco de semeadura.
10. Injete 200 μL (500.000) dos hepatócitos preparados no pólo inferior do baço utilizando uma agulha de 27 G.
11. Grampeie o ramo inferior do pedículo (vasos inferiores do pólo esplênico) com um clipe de tamanho médio.
12. Corte o baço entre os dois clipes colocados inicialmente.
13. Retire o pólo inferior do baço que foi injetado diretamente com células tumorais.
14. Use 3-0 Poliglactina 910 interrompendo a sutura para fechar a camada interna do músculo.
15. Use os grampos de aço esterilizados da ferida para fechar a camada exterior da pele.
    Nota: grampos de aço são preferidos sobre suturas para evitar animais mastigando suturas, deixando uma ferida escancarada.
16. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea após a sutura.
17. Coloque todos os animais em recuperação em uma almofada de aquecimento controlada por temperatura e monitore de perto até que esteja totalmente recuperado da anestesia.
18. Dê aos ratos acesso livre à água após a cirurgia. Se o rato se tornar desidratado durante a cirurgia, administre fluidos subcutâneos (< 1 mL).
19. Remova os grampos da pele em 7-10 dias post-operatively.

Resultados

Hepatócitos oncogênicos isolados de camundongos TAg-transgênicos (Figura 2) foram semeados no fígado de camundongos tipo selvagem por injeção intraesplênica (Figura 3). Os hepatócitos transplantados com sucesso e de forma confiável cresceram tumores ortotópicos de HCC (Figura 4) com antígeno específico SV40 TAg do tumor (Figura 5) no cenário de inflamação e fibrose hepática (Figura 1).

Discussão

Com este protocolo, nós estabelecemos um modelo murino de confiança e reprodutível de HCC que imita a iniciação e a progressão humanas do HCC. Clinicamente, muitos fatores de risco induzem sucessivamente lesão hepática, fibrose hepática, cirrose e a fase final da HCC. Em nosso protocolo, a injeção do IP de CCL₄ é usada para produzir primeiramente a fibrose do fígado em ratos do tipo selvagem, que permite que os hepatócitos oncogênico subseqüentes Formem os tumores no ajuste da fibrose do fígad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close