Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Resumo

Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.

Resumo

Mitophagy é uma via de controle de qualidade mitocondrial essencial, que é crucial para bioenergética de células beta de Islet pancreáticas para abastecer a liberação de insulina estimulada por glicose. A avaliação da mitophagia é desafiadora e muitas vezes requer repórteres genéticos ou múltiplas técnicas complementares não facilmente utilizadas em amostras de tecido, como as ilhotas pancreáticas primárias humanas. Aqui nós demonstramos uma aproximação robusta para visualizar e quantificar a formação de complexos endógenos principais do mitofagia em ilhotas pancreatic humanas preliminares. Utilizando a técnica sensível do ensaio da ligadura da proximidade para detectar a interação dos reguladores NRDP1 e USP8 de mitofagia, nós podemos quantificar especificamente a formação de complexos mitofagia essenciais in situ. Ao acoplar essa abordagem à contracepção para o fator de transcrição PDX1, podemos quantificar complexos de mitophagia, e os fatores que podem prejudicar a mitofagia, especificamente dentro das células beta. A metodologia que descrevemos supera a necessidade de grandes quantidades de extratos celulares necessários para outros estudos de interação proteína-proteína, como a imunoprecipitação (IP) ou espectrometria de massas, e é ideal para amostras de Islet humanas preciosas geralmente não disponíveis em quantidades suficientes para estas abordagens. Além disso, esta metodologia elimina a necessidade de técnicas de triagem de fluxo para purificar as células beta de uma população de Ilhéus heterogêneo para aplicações proteicas a jusante. Assim, nós descrevemos um protocolo valioso para o visualização do mitofagia altamente-compatível para o uso em populações heterogêneas e limitadas da pilha.

Introdução

As células beta pancreáticas produzem a insulina necessária para manter a homeostase normal da glicose, e sua falha resulta no desenvolvimento de todas as formas de diabetes. As células beta mantêm uma capacidade mitocondrial robusta para gerar a energia necessária para o metabolismo da glicose de casal com liberação de insulina. Recentemente, tornou-se evidente que a manutenção da massa mitocondrial funcional é de importância crucial para a função de célula beta ideal^1,2,3. A fim de sustentar a massa mitocondrial funcional, as células beta dependem de mecanismos de controle de qualidade para remover mitocôndrias disfuncionais, danificadas ou envelhecendo⁴. Nós e outros já demonstraram que as células beta dependem de uma forma especializada de rotatividade mitocondrial, chamada autofagia mitocondrial (ou mitophagy), para manter o controle de qualidade mitocondrial em ambos os roedores e ilhotas humanos^{1, 2,5}. Infelizmente, entretanto, não havia nenhum método simples para detectar mitofagia, ou componentes mitofagia endogenamente expressados, em pilhas beta pancreatic humanas.

Nós mostramos recentemente que a regulação ascendente da mitofagia em beta Cells confia na formação de um complexo da proteína que compreende as ligases E3 CLEC16A e NRDP1 e o deubiquitinase USP8¹. NRDP1 e USP8 foram mostrados de forma independente para afetar a mitofagia através da ação no iniciador de mitofagia chave Parkin^6,7. NRDP1 alvos Parkin para ubiquitinação e degradação para desligar mitofagia⁶, e USP8 especificamente deubiquitinates K6-lig Parkin para promover seu translocação à mitocôndria⁷. A tecnologia do ensaio da ligadura da proximidade (PLA) foi um avanço recente no campo da biologia⁸da interação da proteína, permitindo o visualização de interações endógenas da proteína in situ em únicas pilhas, e não é limitada pelo material escasso da amostra. Esta metodologia é particularmente atraente para a biologia de células de Islet/beta humana, devido à escassidade da disponibilidade da amostra, aliada à necessidade de compreensão de complexos proteicos fisiologicamente relevantes dentro de tipos de células heterogêneas.

Utilizando a aproximação do PLA, nós podemos observar complexos mitofagia endógenos chaves em pilhas beta pancreatic humanas preliminares e em linhas de pilha neuronal, e demonstramos os efeitos de um ambiente antidiabetogênico na via de mitofagia¹. Em síntese, o objetivo geral deste protocolo é analisar complexos proteicos específicos de mitophagia em tecidos que não possuem material abundante, ou onde estudos convencionais de interação protéica não são possíveis.

Protocolo

O uso de ilhotas pancreáticas humanas de doadores desidentificados é através de uma isenção do Conselho de revisão institucional (IRB) e em conformidade com a política da Universidade de Michigan IRB. As ilhotas pancreáticas humanas foram fornecidas pelo NIH/NIDDK-programa integrado de distribuição de ilhotas (IIDP).

1. preparação da amostra da ilíte humana

1. Dissociação de uma única célula
   1. Cultura de amostras de ilhao humano (4000 – 6000 Islet equivalentes/10 mL Media) por pelo menos 1 dia a 37 ° c em meios de Islet pancreáticos (PIM (S)) meios suplementados com 1 mM de glutamina (PIM (G)), 100 unidades/mL antimicótico-antibiótico, 1 mM piruvato de sódio e 10% fetal bovino soro (FBS) ou soro AB humano.
   2. Use um microscópio da luz da dissecção na ampliação 3x para contar ilhotas humanas individuais da cultura. Escolha 40 ilhotas por tratamento/condição de interesse (como a glucolipotoxicidade) em tubos de 1,5 mL em suportes de ilhotas.
   3. Ilhotas do centrifugador em 400 x g por 1 minuto em 10 ° c ao sedimento.
   4. Amostras de lavagem, por breves inversão de tubos à temperatura ambiente, duas vezes com 1 mL de solução salina tamponada de fosfato (PBS) contendo 50 μM PR619 (um inibidor de deubiquitinase; para preservar as interações protéicas dependentes da ubiquitina), com centrifugação entre cada lavagem a 400 x g por 1 min a 10 ° c.
   5. Dissociar as ilhotas em células únicas com 125 μL de 0,25% de tripsina contendo 50 μM de PR619 incubando tripsina pré-aquecida (37 ° c) por 3 min com pelotas de ilhotas. Dispersar suavemente ilhotas durante este tempo com pipetagem suave periódica usando uma pipeta de 200 μl.
   6. Saciar a tripsina com 1 mL aquecido (37 ° c) PIM (S) mídia contendo 50 μM PR619, em seguida, células de sedimentos por centrifugação em 400 x g por 1 min.
   7. Células de lavagem por centrifugação a 400 x g por 1 min, duas vezes, com PBS + 50 μm PR619.
   8. Finalmente, reressuscitem as células em 150 μL de PBS contendo 50 μM PR619.
2. Aderência e fixação de células simples
   1. Após a ressuscição, gire a solução de célula para fosco, carregada, lâminas de microscópio usando um citocentrifugador em 28 x g por 10 min.
   2. Após a citocentrifugação, delinear a área celular com uma caneta hidrofóbica (ver a tabela de materiais) para minimizar os volumes de solução de anticorpos/PLA necessários. Fixe pilhas com o paraformaldeído de 4% em PBS por 15 minutos na temperatura ambiente.
      PRECAUÇÃO: o PFA é perigoso e deve ser manuseado com cuidado.
   3. Para melhores resultados, realize a coloração/PLA imediatamente, ou dentro de 24 h. Se necessário, armazene amostras em PBS a 4 ° c até manchar por não mais de 48 h.

2. imunoistoquímica

1. Bloqueio
   1. Lave as células duas vezes com 1X PBS por 5 min à temperatura ambiente.
   2. Solução de célula de bloco, para eliminar a coloração de fundo, com 10% de soro de burro em PBS contendo 0,3% de detergente (ver a tabela de materiais) por 1 h à temperatura ambiente.
2. Mancha
   1. Incubar células com anticorpos primários de camundongo ou coelho contra USP8 (1:250) e NRDP1 (1:250) respectivamente (ver a tabela de materiais) diluída em soro fisiológico tamponado de fosfato com detergente (PBT, ver tabela de materiais), a 4 ° c durante a noite, para detectam a sinalização complexa do mitofagia através do PLA.
   2. Coincubar células com um marcador específico para a identificação de células beta que não foi levantada no rato ou coelho de modo a não interferir com o sinal PLA. Neste caso, incubar células com anti-cabra PDX1 (1:500) em PBT. Incubar todos os anticorpos primários durante a noite a 4 ° c, usando filme plástico em cima da solução para evitar a evaporação.

3. ensaio de ligadura de proximidade

1. Sonda PLA e contratura
   1. Prepare a solução de sonda PLA de acordo com as instruções do fabricante, ou seja, fazer 20 μL de solução de sonda por amostra, preparando uma concentração final de 1:5 solução de ambos os anti-rato e anti-Rabbit solução de sonda em PBT, e incubando por 20 min no quarto Temperatura.
   2. Após a incubação durante a noite, lave as células duas vezes com 1X PBS por 5 min cada, em um rocker.
   3. Pouco antes da incubação com solução de sonda, adicione Cy5 secundária em uma concentração final de 1:600 à solução de sonda (para detecção de PDX1 endógena). Adicionar 20 μL de solução de sonda a cada condição celular, cubra suavemente com filme plástico e incubar a 37 ° c por 1 h.
2. Ligadura
   1. Lave as células duas vezes, à temperatura ambiente, com o buffer A (ver a tabela de materiais para a receita) por 5 min cada, em um rocker.
   2. Prepare a solução de ligadura (parte dos reagentes de detecção, consulte a tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Para isso, diluir o estoque de ligadura (5x) 1:5 em água tratada com pirocarbonato de dietilo (DEPC). Imediatamente antes da incubação adicionar 0, 25 U/mL ligase. Adicionar 20 μL de solução de ligadura às células. Cubra com filme plástico e incubar a 37 ° c por 30 min.
3. Amplificação
   1. Lave as células duas vezes à temperatura ambiente com o tampão A durante 2 min cada.
   2. Faça a solução da amplificação (parte dos reagentes da deteção, veja a tabela de materiais) de acordo com instruções do fabricante. Diluir o tampão de amplificação (5x) 1:5 em água tratada com DEPC e manter-se no escuro até ao uso. Adicione uma diluição 1:80 da polimerase (parte dos reagentes de detecção, consulte a tabela de materiais) à solução imediatamente antes de adicionar a solução às células.
   3. Adicionar 20 μL de solução de amplificação às células. Cubra com filme plástico e coloque no escuro a 37 ° c para entre 1 h 40 min a 2 h para o sinal máximo.
4. Preparação para a imagem
   1. Lave as células duas vezes com o buffer B (veja a tabela de materiais para a receita) por 10 min à temperatura ambiente, em um rocker.
   2. Finalmente, lave as células uma vez em 0.01 x buffer B, por 2 min à temperatura ambiente em um rocker.
   3. Monte as amostras adicionando uma gota de suportes de montagem contendo 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e colocando cuidadosamente uma lamínula sobre as amostras usando uma lâmina de bisturi para pressionar as bolhas formadas. Fechamentos do selo usando o lustrador de prego desobstruído em torno das bordas.
   4. Amostras de imagem em um microscópio capaz de capturar múltiplos planos focais, como um microscópio confocal de varredura a laser, ou um microscópio de fluorescência invertido com capacidades de desvolução, tendo pelo menos 9 imagens de plano focal diferentes.
      1. Capture imagens com ampliação de 100x, com aproximadamente 0,45 mm de altura de pilha z. Captura PLA em 550 de excitação nm, 570 emissão de nm; contra-mancha em 650 de excitação nm, 670 emissão de nm; e DAPI em 405 de excitação nm, 450 emissão de nm.
   5. Para garantir sinais de fundo de imagem de fluorescência e luz perdida são minimizados para análise a jusante de eventos de PLA (especialmente em microscópios Widefield), imagens de processo utilizando um algoritmo de desvolução bidimensional (vizinho mais próximo) através de um software de processamento de imagem padrão de escolha.
      Nota: para Olympus usar CellSens, Nikon usar NIS-Elements, Leica usar LAS X, Zeiss-ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens software, bem como vários plugins disponíveis através de Image-J. Para análise, o número total de interações em todas as pilhas z deve ser analisado usando o software Image-J, garantindo que apenas as células positivas PDX-1 sejam analisadas (seção 3,5).
5. Quantificação das interações do PLA
   1. Abra o aplicativo de software livre Image-J e abra a imagem PLA. Comece a partir da primeira imagem PLA em foco acentuada.
   2. Clique na guia imagem e selecione ajustare, em seguida, limite (Figura 1a). Ajuste o limiar para remover todos os sinais de PLA não específicos, anote o ajuste do limiar e tente mantê-lo consistente ao longo da análise.
   3. Clique na guia processo e selecione binárioe, em seguida, faça binário (Figura 1b). Use a imagem binária para medir as partículas, clicando na guia "Analyze" e pressionando analisar partículas (Figura 1C).
   4. Para análise, certifique-se de que as configurações são as seguintes: size = 0 – Infinity, circularidade = 0 – 1.0, show = contornos, caixas de seleção para resultados de exibiçãoe resultados claros (Figura 1D). Clique em OK. Anote o número de partículas analisadas em uma planilha que denota a amostra e a posição da pilha z.
   5. Repita as etapas 3.5.2 – 3.5.4 até que todas as pilhas z em foco para a amostra tenham sido analisadas. Soma o número total de partículas para a amostra na planilha para quantificar o número total de interações.

Resultados

Realizamos experimentos iniciais na linha de células beta pancreáticas MIN6 e na linha de células de neuroblastoma SH-SY5Y SH-SY5Y, para otimizar e confirmar tanto a especificidade dos anticorpos quanto as interações protéicas visualizadas. As pilhas de MIN6 foram chapeadas em COVERSLIP em 30.000 Cells/mL e deixadas para aderir para 48 h, as pilhas SH-SY5Y foram chapeadas em COVERSLIP em 15.000 Cells/mL e deixadas para aderir para 24 h. O protocolo PLA foi então seguido como acima,...

Discussão

Aqui nós descrevemos uma abordagem simples e eficiente para usar NRDP1: USP8 PLA em tecidos/células de interesse para quantificar a formação de complexos de mitofagia upstream. Nós confirmamos previamente a formação do complexo do mitofagia de CLEC16A-NRDP1-USP8 em pilhas beta pancreatic por diversas metodologias, incluindo experimentos da coimunoprecipitação, estudos Cell-Free da interação, e in vitro assim como o Cell-Based ensaios de ubiquitinação e demonstraram como esse complexo impulsiona o fluxo mitof...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Block solution	Homemade		Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer A	Homemade		To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer B	Homemade		To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat	Jackson Labs	705-175-147
Detection Reagents Red	Sigma- Aldrich	DU092008-100RXN	Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS	Sigma- Aldrich	DU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS	Sigma- Aldrich	DU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MIN6 pancreatic cell line	Gift from D. Stoffers		Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)	Sigma- Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm			Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton)	Homemade		To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X)	Life Technologies	15140-122
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) Human AB serum	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) media	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Life Technologies (Molecular Probes)	P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
SH-SY5Y cells	Gift from L. Satin		Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X)	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Water for RNA work (DEPC water)	Fisher Scientific	BP361-1L