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Resumo

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Resumo

Métodos atuais rotineiramente usados para quantificar o mRNA de oócitos e embriões incluem digital polimerase transcrição reversa reação em cadeia (dPCR), quantitativo, real-time RT-PCR (RT-qPCR) e sequenciação do ARN. Quando estas técnicas são realizadas usando um único oócito ou embrião, baixo-cópia mRNAs confiável não são detectados. Para superar este problema, oócitos ou embriões podem ser agrupados para análise; no entanto, isso muitas vezes leva a alta variabilidade entre as amostras. Neste protocolo, descrevemos o uso da fluorescência hibridação in situ (FISH) usando química de DNA ramificada. Esta técnica identifica o padrão espacial dos mRNAs em células individuais. Quando a técnica está associada a encontrar o local e software de computador de rastreamento, a abundância de mRNAs na célula também pode ser quantificada. Usando esta técnica, há reduzida variabilidade dentro de um grupo experimental e menos oócitos e embriões são necessários para detectar diferenças significativas entre os grupos experimentais. Comercialmente disponível DNA ramificado SM-kits de peixes foram otimizados para detectar mRNAs em secionado tecidos ou células aderentes em slides. No entanto, oócitos efetivamente não adere aos slides e alguns reagentes do kit foram muito duras, resultando em lise do oócito. Para evitar este Lise, várias modificações foram feitas para o kit de peixe. Especificamente, buffers de permeabilização e lavagem de oócito projetados para a imunofluorescência de oócitos e embriões substituiu os buffers de proprietários. A permeabilização, lavagens e incubação com sondas e amplificador foram realizadas em placas de 6-poços e oócitos foram colocados em slides no final do protocolo utilizando meios de montagem. Essas modificações foram capazes de superar as limitações do kit comercialmente disponível, em particular, a lise do oócito. Para precisão e reproducibly contar o número dos mRNAs em oócitos individuais, utilizou-se o software de computador. Juntos, este protocolo representa uma alternativa para PCR e sequenciamento para comparar a expressão de transcritos específicos em células únicas.

Introdução

Transcriptase reversa cadeia da polimerase (PCR) tem sido o padrão-ouro para quantificação de mRNA. Dois ensaios, digital PCR (dPCR)1 e quantitativo, real time PCR (qPCR)2 são utilizados atualmente. Das duas técnicas de PCR, dPCR tem maior sensibilidade do que qPCR, sugerindo que poderia ser usado para medir a abundância de mRNA em células únicas. No entanto, em nossas mãos, dPCR análise de mRNAs baixa abundância nas piscinas de ovócitos de 5 a 10 por cada amostra experimental produziu dados com baixa reprodutibilidade e alta variação3. Isto é provavelmente devido ao erro experimental associado a extração do RNA e transcrição reversa eficiência. A sequenciação do ARN também foi executada usando um único rato e oócitos humanos4,5. Esta técnica requer etapas de amplificação do cDNA necessárias para a geração de biblioteca que provavelmente aumenta a variabilidade dentro de um grupo experimental. Além disso, transcrições de baixa abundância podem não ser detectáveis. Embora os preços de sequenciamento caíram nos últimos anos, ainda pode ser custo proibitivo devido ao alto custo das análises de Bioinformática. Finalmente, a localização de mRNA é um processo dinâmico, com alterações espaciais, contribuindo para a proteína função6. Portanto, decidimos para adotar uma técnica que produziria medidas quantitativas precisas e reprodutíveis e localização dos mRNAs individuais em oócitos único.

DNA em cadeia ramificada acoplado a fluorescência hibridação in situ amplifica o sinal de fluorescência em vez de amplificação do RNA/cDNA permita deteção dos mRNAs único em células individuais 7,8,9. O ensaio é realizado através de uma série de hibridização e amplificação (usando DNA em cadeia ramificada) fluorescência rotulagem passos a fim de amplificar o sinal de fluorescência7. A técnica começa com ligação de pares de sonda de 18 a 25-base do oligonucleotide que são complementares a uma específica do mRNA3,8,10. Quinze a vinte pares de sonda são projetados para cada especificidade de transcrição garantindo para a transcrição do alvo. A hibridação de mRNA específico é seguida por sondas pré-amplificador e amplificador que formam uma configuração ramificada. Aproximadamente, 400 rótulo fluorophores bind para cada amplificador, resultando em um 8000-fold aumento na fluorescência permitindo a deteção de mRNAs individuais (Figura 1)11.

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Figura 1: esquemático do protocolo SM-peixes. Sequencial hibridização da sonda específica de transcrição, ramificado DNA amplificador e fluoróforo para um destino de mRNA é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudos anteriores usando fluorescência única molécula em situ da hibridação (SM-peixe) localizada β-actina mRNAs em neurônios individuais12 e DNA de papilomavírus humano em câncer de colo uterino de células linhas7. O software de computador, encontrar o local e o programa de rastreamento identifica o sinal fluorescente punctate individual e tem sido usada com sucesso para quantificar o número de mRNAs em cada célula3,13.

Baseado nos resultados da deteção do mRNA em neurônios12, formulamos a hipótese que SM-peixe provaria uma ferramenta útil para dosar os níveis de transcrição de murino oócitos e embriões, incluindo baixa abundância mRNAs. No entanto, a técnica é otimizada para uso com pilhas fixos aderentes e formaldeído fixada parafina incorporado cortes de tecido (FFPE). Oócitos não podem aderir a um slide, mesmo quando eles são revestidos com poli-L-lisina. Além disso, eles são mais frágeis do que as células somáticas e cortes de tecido, resultando em lise celular quando submetido a alguns dos buffers de proprietários em kits comercialmente disponíveis3. Para superar estes desafios, oócitos foram fixo e manualmente transferidos entre gotas dos buffers. Além disso, os buffers de permeabilização e lavagem nos kits foram substituídos para reduzir o lysis da pilha. Sondas preconcebidas são compradas juntamente com o kit de peixe ou transcrições específicas podem ser solicitadas. Cada conjunto de sonda proprietário está disponível em um dos três canais de fluorescência (C1, C2 e C3) para permitir a multiplexação. Na experiência atual, murino oócitos foram manchadas de dual e quantificados usando uma sonda de C2 Nanog e uma sonda de C3 Pou5f1 . Estas sondas foram selecionadas com base em expressão relatado de Nanog e Pou5f1 de oócitos e embriões. Na conclusão das etapas da hibridação, oócitos foram colocados em gotas de mídia anti-desvaneça-se montagem para aplicação de lâminas histológicas. Confocal imagens foram usadas para quantificar o número de sinais fluorescentes punctate que representam os mRNAs individuais. Além de quantificar os mRNAs, imagem também mostrou a distribuição espacial do mRNA específico na célula, quais outros métodos de quantificação de RNA são incapazes de alcançar. Esta técnica provou ter baixa variabilidade dentro de um grupo experimental, permitindo o uso de um menor número de oócitos em cada grupo experimental para identificar diferenças significativas entre os grupos experimentais3.

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Protocolo

Animais procedimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Nebraska-Lincoln e institucional Cuidado Animal e todos os métodos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. Para este estudo, CD-1 consanguíneo ratos tem acesso ad libitum chow roedor normal e água; Eles foram mantidos em um 12:12 escuros: ciclo de luz.

1. preparação dos meios de comunicação necessários

  1. Para a mídia de base (OMM), adicione 100 mM NaCl, KCl de 5 mM, 0.5 mM KH2PO4e 1,7 mM CaCl2-2 H2O a 100 mL de água estéril.
    Nota: Médio OMM pode ser armazenado por até 1 mês.
  2. Para a mídia completa (OMOPS), adicionar 20 mM 3-morpholinopropane-1-sulfônico (MOPS), 1,2 mM de MgSO4-7 H2O, glicose de 0,5 mM, 6 mM L-lactato, 1mm ala-gln, taurina, 0,1 mM 1 x não aminoácidos essenciais (timina), 0,01 mM (de ácido etilenodiaminotetracético EDTA), o ácido alfa lipoico 10 µM, 10 gentamicina µ g/mL sem diluir, 21 mM 1 M NaOH, 5mm NaHCO3, 0,2 mM piruvato, 0.5 mM citrato, 4mg/mL FAF BSA para uma 01:10 diluição da OMM em água estéril para um volume total de 100 mL. Esterilize o meio com um filtro de 0,22 µM.
    Nota: OMOPS pode ser armazenado por até 1 semana.
  3. Por meio de exploração (HM) Adicione 5% de soro fetal bovino para OMOPS. Fazer 2 mL HM por rato.
  4. Para solução de hialuronidase Adicione 0,1 mg/mL de hialuronidase derivado de testículos de bovinos, a HM de 1 mL.
  5. Para o buffer de fixação combine paraformaldeído 4% em 10 mL de 1X PBS juntamente com 0,1% embrião grau polivinilpirrolidona (PVP)14.
  6. Para preparar 50 mL de tampão de lavagem (WB), adicionar 0,1% de tensoativo não-iônico e 0,1% PVP de 1X PBS14.
  7. Para preparar 10 mL de tampão de permeabilização, adicione 1% não - iónico de 1X PBS14.
    Nota: Os buffers de lavagem e permeabilização descritos acima substituem os buffers proprietários nos kits comercialmente disponíveis.

2. recolha de ovócitos ovulados dos ratos fêmeas

  1. Preparação:
    1. Estimular os ratos fêmeas em 5-8 semanas de idade com uma injeção intraperitoneal (IP) de 5 IU equinos gonadotrofina coriônica (eCG) seguida de 5 IU gonadotrofina coriônica humana (hCG) 44-48 h mais tarde15,16.
    2. Manter pratos de Petri 35mm, contendo 2 mL de HM em uma placa de aquecimento de 37 ° C. Pipete uma, gota de 100 µ l de HM contendo hialuronidase diluída, seguido de três, gotas de 50 µ l de HM sem hialuronidase em um prato de petri de 60 mm. Coloque placas contendo gotas sobre a 37 ° C de aquecimento da placa antes da utilização.
      Nota: As gotas de hialuronidase devem ser feitas antes da dissecação de cada par de oviduto para evitar a evaporação e concentração dos componentes da HM com ou sem hialuronidase.
  2. Eutanásia em ratos, 16 h após a injeção do IP do hCG, utilizar isoflurano sobredosagem seguido por deslocamento cervical.
  3. Limpe o mouse usando etanol a 70%. Expor na cavidade abdominal e visualizar o trato reprodutivo feminino. Segure o ovário com pinça e retire os ligamentos uterinos e o excesso de tecido adiposo ao redor do ovário. Corte do oviduto, do útero e coloque o par de ovário-oviduto no HM quente no prato de 35 mm.
  4. Remova o ovário e qualquer tecido adiposo circundante. Rasgo na ampola inchada de oviduto usando uma agulha de calibre 27 de ½ polegada. Empurre o oviduto no site do rasgo e os complexos de célula-oócito cumulus (COCs) serão expulso. Transferência de oócitos ovulated, que se presume ser em metáfase II (MII) da meiose, para a entrega de 100 μL contendo mídia HM com hialuronidase usando uma pipeta de boca (Figura 2).

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Figura 2 : Peças da pipeta de boca usado para transferência de oócitos. (A) boca da parte (B) 0.22, 4mm filtro (C) tubulação (D) 1000 μL pipeta ponta aspiradora (E) 9" pipeta Pasteur. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Pipete os complexos de célula cumulus-oócito MII acima e para baixo na hialuronidase contendo HM com a pipeta de boca para desalojar as células do cumulus. Cada oócito de transferência, uma vez que eles são desprovidos de células do cumulus para uma lavagem soltar HM contendo apenas usando a pipeta de boca. Repita isto para cada gota de lavagem. Não transferência de oócitos fragmentada ou transparente15.
    Nota: É importante transferir os oócitos de cada gota no prato com 35mm como HM pouco quanto possível. Isto é verdadeiro para cada transferência no protocolo. Os oócitos MII não devem permanecer na hialuronidase contendo meio de HM para mais de um minuto.

3. SM-peixe de coloração de ovócitos

  1. Resolver os oócitos em um poço individual de uma placa de 6 contendo 500 µ l de tampão de fixação. Mergulhe 20 oócitos ou menos no poço. Incube durante 20 min à temperatura ambiente.
    Nota: Cada passo de coloração SM-peixe ocorre dentro de um poço individual em uma placa 6-poço cónico. Certifique-se de que os oócitos são completamente submerso nos buffers e não flutuando em cima do buffer. Cada passo deve ser realizada com 20 oócitos ou menos em cada poço.
  2. Transferência de ovócitos fixos para 500 μL de tampão de lavagem (WB descrito na etapa 1.6) por 10 min cada. Repita 2 vezes mais.
  3. Incube os oócitos no buffer de permeabilização por 30 min à temperatura ambiente.
    Nota: O buffer de permeabilização descrito na etapa 1.7 substitui o buffer de permeabilização de decoro.
    1. Reunir conjuntos de sonda e rapidamente girá-los para baixo em um microcentrifuge. Aquecer cada sonda definida por 10 min em um banho de água a 40 ° C ou incubadora. Esfriar até a temperatura de quarto.
      Nota: Esta etapa deve ser executada durante a incubação de permeabilização
  4. Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente.
  5. Transferência de ovócitos de 80 μL de Protease III Buffer (disponível a partir do kit), que é diluído 1:8 em 1X PBS, por 30 min à temperatura ambiente.
    Nota: O volume de 80 µ l adequadamente cobre o fundo de um poço individual em uma placa de 6.
  6. Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente.
  7. Diluir os conjuntos de sonda aquecida para Nanog, Pou5f1 e DapB (um gene de controlo negativo), 01:50 no diluente de sonda. Incubar os oócitos em 80 μL da sonda específicos de transcrição por 2 horas a 40° C.
    Nota: Cada conjunto de sonda proprietário está disponível em um dos três canais de fluorescência (C1, C2 e C3). As sondas Nanog e Pou5f1 foram marcadas com C2 e C3, respectivamente.
  8. Aquecer o proprietário, 1 amplificador (1 AMP), amplificador 2 (AMP2), amplificador 3 (AMP3) e amplificador 4-fluorescência (AMP 4-FL) à temperatura ambiente.
    Nota: Esta etapa deve ser executada durante a incubação sonda de transcrição específicos de 2 horas.
  9. Transferência de oócitos para 500 μL de WB e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  10. Incube os oócitos sequencialmente nos buffers de amplificação.
    1. Incube os oócitos em 80 µ l de AMP1 durante 30 min em oócitos de transferência de 40° c a 500 µ l de WB, durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    2. Incubar os oócitos em 80 µ l de AMP2 por 15 min a 40 ° C. Transferência de ovócitos a 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente.
    3. Incubar os oócitos em 80 µ l de AMP3 por 30 min a 40 ° C. Transferência de ovócitos a 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente.
      Nota: O restante do protocolo é realizado no escuro porque AMP-FL contém o fluoróforo. Quando se trabalha sob o microscópio de dissecação, reduza a luz, tanto quanto possível.
    4. Adicionar oócitos de 80 μL de AMP4-FL 15 min a 40° C.
      Nota: AMP4-FL é fornecido como alternativa de reserva-A (Alt-A), Alt-B ou Alt-C. Selecione o buffer de AMP4-FL dependente na qual emissão de comprimento de onda é desejado.
  11. Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente. Incube os oócitos em 80 µ l de DAPI por 20 min em temperatura ambiente. Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 5 min à temperatura ambiente.
  12. Pipete 12 µ l de mídia anti-fading montagem no centro de um slide sem adição de bolhas para o reagente. Transferir oócitos com como pouco WB quanto possível para a mídia de montagem e uma lamela.
    1. Lamela em um ângulo de inclinação e lenta e suavemente, coloque sobre o líquido no slide. Evite pressionar a lamela muito duro para impedir a distorção dos oócitos e introdução de bolhas.
    2. Armazene os slides em uma caixa escura para secar durante a noite em temperatura ambiente. Revesti as bordas dos slides em esmaltes claros para selar a lamela.
  13. Use um microscópio padrão para encontrar oócitos sobre o slide e o círculo com um marcador permanente.
    Nota: Este passo não é obrigatório, mas melhora a localização oócitos no slide. Para melhores resultados, slides de imagem dentro de 1 a 5 dias como o sinal fluorescente começará a desvanecer-se.

4. processamento de imagem

  1. Imagem 3-dimensional oócitos, utilizando microscopia confocal de passo de z.
    Nota: Para analisar com precisão as imagens, cada passo de z deve ser 1,0 µm/fatia.
  2. Salve imagens confocal como um comprimido nd2 ou individuais. Arquivos TIFF para cada oócito. Ambos os tipos de imagem são compatíveis com o programa de processamento de imagem open source, Fiji.
  3. Baixe e instale o software de Fiji de acesso aberto (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    1. Arraste arquivos nd2 em Fiji e escolha hyperstack. Se imagens confocal foram salvos como. Arquivos TIFF pule para a etapa 4.4.
      Nota: Quando o arquivo de nd2 é Descartado em Fiji o dropdown hyperstack deve aparecer automaticamente.
    2. Clique na guia imagem , selecione a core clique em Canais de Split para separar os canais fluorescentes do arquivo nd2.
    3. Gere individuais. Arquivos TIFF para cada z-fatia do oócito em cada canal fluorescente. Clique na guia imagem , selecione Stackse clique em pilha de imagens. Clique na guia imagem , selecione o tipoe clique em Cor RGB para converter cada fatia de z para uma imagem de cor RGB individual.
      Nota: A cor do RGB é artificial e pode ser escolhido como desejado para cada comprimento de onda de emissão.
    4. Salve cada imagem convertida como. Arquivo TIFF. Coloque imagens de um oócito único para cada canal fluorescente em uma nova pasta para evitar confusão durante a costura (etapa 4.3).
  4. Normalize a cada um. Imagem TIFF para Pou5f1 e Nanog usando imagens de controlo negativo (DapB).
    Nota: A normalização é executada usando um programa de edição de fotos. Certifique-se de remover os mesmos níveis de fluorescência de fundo de cada imagem do controle.
  5. Abra cada normalizado. Arquivo TIFF em Fiji para costurar todos os z-fatias para cada oócito em cada comprimento de onda.
    1. Clique na guia de Plugins , selecione costurae clique na Grade/coleção (Figura 3A). Selecione Imagens sequenciais do menu drop-down e clique Okey (Figura 3B).
    2. Procure o diretório e selecione a pasta que contém todas as imagens de z-fatia para um oócito individual em um comprimento de onda (ver passo 4.3.4). Clique Okey.
    3. Mova o controle deslizante na parte inferior da imagem costurada para o canal de cor apropriada para o comprimento de onda utilizado e criar a imagem final de costurados RGB clicando em imagem, selecionar o tipoe clique em Cor RGB.
      Nota: Esta imagem será usada para quantificação de fluorescência descrita na etapa 4.6 abaixo.
  6. Converta a imagem costurada para 32-bit máxima imagens projetadas. Clique na imagem, selecione o tipoe clique em 32-bit (Figura 3). Salve esta imagem como um novo. Arquivo TIFF.

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Figura 3 : Costura juntos de imagens confocal z-series de ovócitos. (A) Screenshot mostrando a ferramenta grade/coleção de plug-in em Fiji que foi usado para produzir imagens compostas do oócito. (B) imagens sequenciais usa sobreposição de fluorescência entre sequencial. Arquivos TIFF para gerar uma imagem composta. (C) a imagem composta foi salvo como um 32-bit. Arquivo TIFF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Baixe e instale o local encontrando e programa de rastreamento13, que está disponível no site para D.R. Larson, um investigador no nacional institutos de saúde Instituto Nacional de câncer (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Baixe e instale a máquina virtual de acesso livre para o sistema operacional no idioma (IDL) interativa de dados que é necessário para executar o programa de rastreamento (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf) e encontrar o lugar.
  2. Abra a imagem de 32 bits, costurada, que foi gerada na etapa 4.6 (Figura 4A), no local encontrando e programa de rastreamento. Selecione o menu suspenso localizar e clique em Localizar (Figura 4B), que irá calcular as números manchas encontradas na imagem.
    Nota: Cada ponto contado representa um mRNA individuais. Configurações de limite de banda pass e fóton são mostradas na captura de tela (Figura 4B). Para este protocolo, utilizou-se o padrão para cada configuração de limiar. Representante positivo e manchas de fundo são mostradas (Figura 4).

figure-protocol-15195
Figura 4 : Quantificação dos mRNAs utilizando Spot Finder e rastreamento. (A) z-série Individual imagens foram costuradas conforme descrito na Figura 3 e salvo como um máximo de 32-bit projectado. Arquivo TIFF. (B) imagem composta foi inaugurada em Spot Finder e rastreamento. Localizar foi usada para contar as manchas fluorescentes (caixa vermelha). Limite de banda pass e fóton são indicadas pela caixa azul. (C) a seta azul aponta para um sinal positivo (acima do limiar). A seta branca mostra uma fluorescente ponto abaixo do limiar e, portanto, não contados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Após a conclusão do protocolo, o resultado será imagens individuais de confocal z-series (Figura 4A e Figura 5), imagens costuradas (Figura 4), e contagens de mRNA (Figura 4B). Quando é executada a multiplexação, haverá também mescladas imagens mostrando o rótulo para dois diferentes mRNAs (

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Discussão

Uma série de pequenas etapas durante o protocolo irá garantir sucesso fluorescência e contagens exatas dos mRNAs. Em primeiro lugar, o protocolo deve ser realizado imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Observe que o PVP é adicionado para o buffer de fixação paraformaldeído 4% para evitar oócitos grudem uns aos outros. Nós achamos que é necessário realizar o experimento imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Qualquer atraso resulta em um muito menor sinal de fluorescência que res...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar

Agradecimentos

Agradecemos o Dr. Daniel R. Larson por sua generosa ajuda com a instalação e utilização do local encontrando e programa de rastreamento 13 e o apoio técnico da Universidade de Nebraska Lincoln microscopia núcleo para a imagem de microscopia confocal. Este estudo representa uma contribuição da Universidade da divisão de pesquisa agrícola de Nebraska, Lincoln, Nebraska e foi apoiado por fundos de hachura UNL (NEB-26-206/adesão número-232435 e NEB-26-231/adesão número-1013511).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-α-Lipoic acidSigma-AldrichT1395Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty AcidMP Biomedicals, LLC199899FAF BSA
BD 10mL TB SyringeBecton, Dickinson and Company30965910 mL syringe
BD PrecisionGlide NeedleBecton, Dickinson and Company30510927 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC7902CaCl2-2H2O
Citric acidSigma-AldrichC2404Citrate
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG6152Glucose
Disodium phosphateNa2HPO4
Easy Grip Petri DishFalcon Corning35100835 mm dish
Edetate DisodiumAvantor8994-01EDTA
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine SerumAtlanta biologicalsS10250FBS
Gentamicin Reagent Solutiongibco15710-064Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)gibco35050-061Glutamax
Gold Seal Micro SlidesGold Seal303925 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' SerumSigmaG4877eCG
hCG recombinantNHPPAFP8456AhCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine TestesSigma-AldrichH3884Hyaluronidase
Jewelers Style ForcepsIntegra17-305XForceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid MP Biomedicals, LLC190228L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM2773MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino AcidsCorning 25-025-ClNEAA
Microscope Cover GlassFisher Scientific12-542-C25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501891-C2Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501611-C3Pou5f1 Probe
MOPSSigma-AldrichM3183
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterileMillex-GPSLGP033RS0.22 um filters
PolyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP0930PVP
Potassium chlorideSigma-Aldrich60128KCl
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich60218KH2PO4
Prolong Gold antifade reagentinvitrogenP36934Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPIAdvanced Cell Diagnostics320858DAPI
RNAscope FL AMP 1Advanced Cell Diagnostics320852Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2Advanced Cell Diagnostics320853Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3Advanced Cell Diagnostics320854Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT AAdvanced Cell Diagnostics320855Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT BAdvanced Cell Diagnostics320856Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT CAdvanced Cell Diagnostics320857Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents KitAdvanced Cell Diagnostics320851FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics320871Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive ControlAdvanced Cell Diagnostics320881Positive Control
RNAscope Probe DiluentAdvanced Cell Diagnostics300041Probe Diluent
RNAscope Protease IIIAdvanced Cell Diagnositics322337Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics322340FISH Protease Kit
RNAscope Protease IVAdvanced Cell Diagnostics322336Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30GComponent Supply Co.NE-301PL-50blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6297NaHCO3
Sodium chlorideSigma-AldrichS6191NaCl
Sodium hydroxideSigma-Aldrich306576NaOH
Sodium pyruvate, >= 99%Sigma-AldrichP5280Pyruvate
Solution 6 Well DishAgtechincD186 well dish
TaurineSigma-AldrichT8691Taurine
Tissue Culture DishFalcon Corning35300260 mm dish
Triton X-100Sigma-AldrichX100Triton X-100

Referências

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930(2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4(2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459(2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, Elsevier Inc. (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855(2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15(2003).

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