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Resumo

Este protocolo descreve um sistema de fermentação em lote-cultura in vitro de microbiota fecal humana, utilizando inulina (um prebiótico bem conhecido e um dos moduladores de microbiota mais amplamente estudados) para demonstrar o uso deste sistema na estimativa de efeitos de intervenções sobre a composição da microbiota fecal e atividades metabólicas.

Resumo

O papel emergente do microbioma intestinal em várias doenças humanas exige um avanço de novas ferramentas, técnicas e tecnologias. Tais melhorias são necessárias para decifrar a utilização de moduladores de microbioma para benefícios de saúde humana. No entanto, a triagem de grande escala e a otimização de moduladores para validar a modulação de microbioma e prever benefícios de saúde relacionados podem ser praticamente difíceis devido à necessidade de grande número de animais e/ou indivíduos humanos. Para este fim, os modelos in vitro ou ex vivo podem facilitar a triagem preliminar de moduladores de microbioma. Nisto, é otimizado e demonstrou um sistema de cultura de microbiota fecal ex vivo que pode ser usado para examinar os efeitos de várias intervenções de moduladores de microbioma intestinal, incluindo probióticos, prebióticos e outros ingredientes alimentares, além de nutracêuticos e drogas, sobre a diversidade e composição da microbiota intestinal humana. A inulina, um dos compostos prebióticos mais estudados e moduladores de microbioma, é utilizada como exemplo aqui para examinar seu efeito sobre a composição saudável da microbiota fecal e suas atividades metabólicas, como o pH fecal e os níveis fecais de ácidos orgânicos incluindo lactato e ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). O protocolo pode ser útil para estudos que visem estimar os efeitos de diferentes intervenções de moduladores nos perfis de microbiota fecal e prever seus impactos na saúde.

Introdução

A microbiota humana é uma comunidade complexa constituída por bactérias, archaea, vírus e micróbios eucarióticos1, que habitam o corpo humano internamente e externamente. Evidências recentes estabeleceram o papel fundamental da microbiota intestinal e do microbioma intestinal (toda a coleção de micróbios e seus genes encontrados no trato gastrointestinal humano) em várias doenças humanas, incluindo obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares e câncer1,2,3. Além disso, os microrganismos que vivem em nosso intestino produzem um amplo espectro de metabólitos que afetam significativamente a nossa saúde e também podem contribuir para a fisiopatologia de várias doenças, bem como uma variedade de funções metabólicas4, as mudanças 5. anormais (perturbações) na composição e na função desta população microbiana do intestino são denominadas geralmente como o "dysbiosis do intestino". Dysbiosis é associado geralmente com um estado insalubre do anfitrião e daqui pode ser diferenciado da comunidade microbiana (Homeostatic) normal associada com um estado saudável do controle do anfitrião. Padrões específicos de disbiose do microbioma intestinal são freqüentemente encontrados em várias doenças diferentes1,2,3,6,7.

A fermentação de alimentos não digeridos, particularmente os carboidratos/fibras fermentáveis, pela microbiota intestinal não só produz energia, mas também produz metabólitos divergentes, incluindo ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs), lactato, formate, dióxido de carbono, metano, hidrogênio e etanol6. Além disso, a microbiota intestinal também produz uma série de outras substâncias bioativas, tais como folato, biotina, trimetilamina-N-óxido, serotonina, triptofano, ácido gama-aminobutírico, dopamina, norepinefrina, acetilcolina, histamina, ácido desoxicólico e sulfato de 4-etilfenil. Isso ocorre principalmente através da utilização de fluxos metabólicos intrínsecos dentro do nicho hospedeiro-micróbe, que contribui em vários processos corporais, funções metabólicas e alterações epigenéticas1,8,9, a 10. No entanto, os efeitos de várias intervenções em tais produtos microbianos permanecem não kown ou incerto devido à falta de protocolos fáceis, eficientes e reprodutíveis. A composição da microbiota do intestino humano é um ecossistema extremamente complexo e diversificado, e, portanto, muitas perguntas sobre seu papel na saúde humana e patologia da doença ainda permanecem sem resposta. Os efeitos de muitos moduladores comuns do microbioma do intestino (por exemplo, probióticos, prebióticos, antibióticos, transplantação fecal e infecções) na composição e nas funções metabólicas da microbiota intestinal permanecem pela maior parte indescritível. Além disso, o exame e validação desses efeitos in vivo é difícil, especialmente porque a maioria dos nutrientes e metabólitos produzidos pela microbiota intestinal são absorvidos ou eliminados simultaneamente e rapidamente no intestino; por conseguinte, a medição da produção, da quantidade e do tratamento destes metabolitos (por exemplo, SCFAs) in vivo continua a ser um desafio prático. De fato, modelos fisiológicos como animais e sujeitos humanos são críticos para determinar o papel do microbioma intestinal e sua modulação na saúde do hospedeiro, mas estes podem não ser adequados para a triagem em grande escala de diferentes tipos de moduladores de microbiomas devido à restrições éticas, monetárias ou temporais. Para este fim, os modelos in vitro e/ou ex vivo, como a cultura da microbiota intestinal in vitro e depois a intervenção com diferentes moduladores de microbiota, podem oferecer oportunidades de poupança de tempo e dinheiro e, portanto, podem permitir a triagem preliminar ou em grande escala de vários componentes (como probióticos, prebióticos e outros compostos intervencionistas) para examinar/prever seus efeitos sobre a diversidade de microbiota fecal, composição e perfis metabólicos. Estudos que utilizam tais sistemas in vitro e ex vivo do microbioma intestinal podem facilitar a compreensão das interações hospedeiro-microbioma que contribuem para a saúde e doença do hospedeiro, podendo também levar a encontrar novas terapias que visam o microbioma a melhorar a saúde do hospedeiro e prevenir e tratar várias doenças1.

Embora os sistemas in vitro da cultura da microbiota do intestino não possam verdadeiramente replicar as condições intestinais reais, diversos laboratórios esforçou-se para desenvolver tais modelos, alguns de que foram encontrados praticáveis até certo ponto e foram usados com sucesso para diferentes finalidades. Um dos modelos recentes do intestino é o simulador do ecossistema microbiano intestinal humano, que imita todo o trato gastrointestinal humano, incluindo o estômago, intestino delgado, e diferentes regiões do cólon. No entanto, tais modelos tecnicamente complexos podem não ser acessíveis a outras instalações de pesquisa em todo o mundo. Portanto, ainda há uma necessidade crítica para o desenvolvimento de novos modelos alternativos que são relativamente simples, acessíveis e práticos para laboratórios que estudam os moduladores de microbioma e seus efeitos na microbiota intestinal e na saúde do hospedeiro. Assim, o uso de um sistema de cultura da microbiota fecal in vitro (ou ex vivo) seria útil para o estudo dos efeitos de tais intervenções11,12. Especificamente, o efeito de diferentes prebióticos sobre a capacidade de fermentação da microbiota em termos de mudanças periódicas na diversidade e composição da microbiota intestinal, o pH fecal e os níveis de metabólitos microbianos, incluindo SCFAs e lactato, podem ser estudados 13. nisto, usando inulina (um dos componentes prebióticos mais estudados) como exemplo do modulador de microbioma, é descrito um protocolo passo a passo deste sistema simples de cultura de lotes ex vivo de microbiota para demonstrar seu uso para estimar a alterações na microbiota fecal e metabólitos microbianos após a intervenção com os moduladores de microbioma.

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Protocolo

Cuidado: consulte as fichas de dados de segurança do material apropriadas e siga as instruções e diretrizes para o treinamento adequado de nível 2 de biosseguridade (BSL-2). Siga todas as etapas de cultivo de acordo com as regras padrão de biossegurança e use um gabinete BSL-2 usando condições assépticas. Além disso, amostras fecais de diferentes modelos e indivíduos humanos podem apresentar risco potencial de disseminação de doenças transmitidas por microrganismos. Procure imediatamente ajuda médica na ocorrência de qualquer lesão e infecção. Além disso, o uso de amostras de fezes humanas e animais deve ser aprovado através de comitês éticos institucionais e deve ser compatível com protocolos de uso de amostras e informações sobre o assunto.

1. preparação dos meios de cultura

  1. Preparação dos meios de cultura, preparar nove tipos de soluções de ações
    1. Solução A (1.000 mL): dissolver 5,4 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,7 g de dihidrogênio fosfato de potássio (KH2po4), 0,16 g de cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2· 2h2O), 0,12 g de cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2 · 6h2o), 0, 6 g de cloreto de manganês tetrahydrate (MNCL2· 4h2O), 0, 6 g de cloreto de sulfatodecobalto hexahidratado (cocl2· 6h2o) e 5,4 g de sulfato de amônio (NH4)2so4, em água desionizada para fazer volume total de 1.000 mL.
    2. Solução B (1.000 mL): dissolver 2,7 g de fosfato de hidrogênio de potássio (K2HPO4) em água desionizada para fazer volume total de 1000 mL.
    3. Solução mineral de traço (1.000 mL): dissolver 500 mg de etilenodiamina-tetraacetato dihidratado (na2EDTA), 200 mg de sulfato ferroso heptahidrato (FeSO4· 7h2O), 10 mg de sulfato de zinco heptahidrato (znso4 • 7H2o), 3 mg de cloreto de manganês (II) tetrahidratado (MNCL2· 4h2o), 30 mg de ácido fosfórico (H3PO4), 20 mg de cocl2· 6h2o, 1 mg de cloreto de cóprico di-hidratado (CL2 • 2H2o), 2 mg de cloreto de níquel (II) hexahidrato (nicl2· 6h2o) e 3 mg de molibdato de sódio dihidratado (na2Moo4· 2h2o) em água desionizada para fazer volume total para 1.000 ml.
      Nota: Esta solução é sensível à luz, portanto, garantir a ser armazenado em escuro/preto ou alumínio envolto tubos/garrafas.
    4. Solução de vitamina solúvel em água (1.000 mL): dissolver 100 mg de cloridrato de tiamina (Thiamin-HCl), 100 mg de ácido D-pantotênico, 100 mg de niacina, 100 mg de piridoxina, 5 mg de ácido P-aminobenzoico e 0,25 mg de vitamina B12 em água desionizada para fazer volume total para 1.000 mL.
    5. Folato: solução de biotina (1.000 mL): dissolver 10 mg de ácido fólico, 2 mg de D-biotina e 100 mg de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) em água desionizada para fazer volume total de 1.000 ml.
    6. Solução de riboflavina (1.000 mL): dissolver 10 mg de riboflavina em 5 mM HEPES (1,19 g/L) solução para fazer volume total de 1.000 mL.
    7. Solução de hemina (10 mL): dissolver 5.000 mg de hemina em solução de hidróxido de sódio a 10 mM (NaOH) (0,4 g/L) para tornar o volume total de 10 mL.
    8. Mistura de ácidos graxos de cadeia curta (10 ml): combine 2,5 ml de N-valerato, 2,5 ml de isovalerato, 2,5 ml de isobutirato e 2,5 ml: DL-α-metilbutirato.
      Nota: Esta solução é recomendada usar-se na capa das emanações para evitar o cheiro e os fumos.
    9. Resazurin (1.000 mL): dissolver 1 g de resazurina em água desionizada e fazer volume total para 1.000 mL.
  2. Meio utilizado para fermentação anaeróbia in vitro
    1. Para preparar esta mídia, misture 330 mL de solução A, 330 mL de solução B, 10 mL de solução mineral de traço, 20 mL de solução de vitamina solúvel em água, 5 mL de folato: solução de biotina, 5 mL de solução de riboflavina; 2,5 mL de solução de Hemin, 0,4 mL de mistura de ácidos graxos de cadeia curta, 1 mL de resazurin, 0,5 g de extrato de levedura, 4 g de carbonato de sódio (na2co3), 0,5 g de cisteína HCL-H2O e 0,5 g de Trypticase, e adicionar 296,1 ml de água destilada.
    2. Verifique o pH e certifique-se que é em torno de 7,0, se não, ajustar o pH com 1 N HCl ou 1 N NaOH. Esterilizar por vácuo filtrando a mídia usando um filtro de garrafa a estação de trabalho asséptica.
    3. Alternativamente, misture todos os componentes (excepto as soluções da vitamina e do hemina) e autoclave em 121 ° c por 20 minutos e deixe-o refrigerar para baixo à temperatura ambiente. Simultaneamente, filtrar-esterilizar as soluções de vitamina e hemina usando filtros de membrana de 0,22 μm e adicioná-los à mídia autoclavada e arrefecida antes de dispensar.

2. preparação da câmara anaeróbia e material requerido

  1. Manter todos os materiais, soluções e ferramentas necessárias para o experimento de fermentação dentro da câmara anaeróbia pelo menos 48 h antes do início do experimento, para garantir que qualquer oxigênio residual associado a ferramentas e oxigênio solúvel em buffers/soluções seja removido e todos os materiais são aclimatizados às condições anaeróbias ajustadas.
    Nota: Materiais necessários dentro da câmara anaeróbia (48 h antes do experimento para começar): (i) meios de fermentação; II) solução anaeróbia (preparada de acordo com a secção 4,1), (III) vortexer, (IV) balança de pesagem, (v) panos de queijo de musselina, (vi) tesoura, (VII) funil, (VIII) 1,5, 2,0, 15, 50 mL tubos, (IX) pipetador (2, 20, 200 e 1.000 μL) e pontas de Pipet compatíveis, (x) pistola Pipet e pipetas (5 e 10 mL), (XI) tecidos de papel, (XII) marcadores, (XIII) tubo de stands para diferentes tubos, (XIV) caixa de resíduos, (XV) O2 indicador e (xvi) 70% spray de etanol garrafa (desinfetante).

3. preparação de tubos e fibras

  1. Peso 300 mg de inulina e transferência para um tubo de 50 mL seguido pela adição asséptica de 26 mL de meios de fermentação já preparados e armazenados na câmara anaeróbia. Prepare um tubo em branco para cada tipo de amostra fecal e tubo (s) experimental (de acordo com o número de compostos que estão sendo testados), em triplicado.
  2. Deixe estes tubos dentro da câmara anaeróbia por cerca de 24 h para permitir a hidratação das amostras antes de iniciar o experimento de fermentação. Assegure-se de que a temperatura do tubo seja 37 ° c no momento da inoculação, portanto, traga os tubos na incubadora dentro da câmara anaeróbia.

4. preparação do Ininoculto

  1. Solução de diluição anaeróbia (pelo menos 48 h antes do experimento de fermentação): dissolver 5 g de NaCl, 2 g de glicose e 0,3 g de cisteína-HCl em água desionizada e fazer volume total para 1.000 mL. Autoclave e armazená-lo dentro da câmara anaeróbia pelo menos 48 h antes do uso.
  2. Preparo do inônio fecal (no dia do experimento de fermentação): pesar 5 g de amostra fecal fresca em um tubo cônico de 50 mL, adicionar solução de diluição anaeróbia para um volume final de 50 mL (1:10 w/v) e Vortex por 15 min ou até completamente homogeneizado. Filtre a mistura homogeneizada através de 4 camadas de gaze estéril (autoclavada) e use-a imediatamente para inoculação nos tubos contendo meios de comunicação.
    Nota: As amostras fecais de um grupo de indivíduos podem ser agrupadas se o objetivo experimental é comparar o efeito de um determinado composto/ingrediente em geral saudável versus microbiota fecal doente em General.

5. fermentação e amostragem

  1. Prepare os tubos de acordo com a seção 4,2 e inocule os tubos em branco/controle e experimentais com 4 mL de inocular fecal diluído e filtrado. Incubar os tubos inoculados a 37 ° c dentro da câmara anaeróbia. Agitar os tubos uma vez a cada hora, invertendo suavemente para re-suspender as fibras e inum.
  2. Colete amostras com a frequência necessária, por exemplo, por hora para 0, 3, 6, 9 e 24 h durante a fermentação, tomando uma amostra de alíquota de 2 mL para fora em um tubo de 2 mL a partir dos respectivos tubos fermentantes.
  3. Medir o pH das alíquotas utilizando um medidor de pH laboratorial (inserindo diretamente o eletrodo de pH na amostra); Centrifugue a amostra restante a 14.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Congele imediatamente o sobrenadante e a pelota no nitrogênio líquido, e após a congelação da pressão, armazene o sobrenadante para a análise de scfas e a pelota para a análise do microbioma em-80 ° c.

6. ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) e quantificação de lactato

Nota: Os scfas e o lactato no sobrenadante da cultura do microbioma podem ser medidos exatamente de acordo com os métodos detalhados em outros lugares13,14,15,16.

  1. Momentaneamente, descongele os sobrenadantes congelados da pressão obtidos na seção 5 das amostras do controle e do tratamento no gelo e realizam todas as etapas processando mais adicionais no gelo. Filtre o sobrenadante através de um filtro de membrana de 0,45 μm e use as amostras sem células para medir as concentrações de SCFAs e lactato usando o sistema de HPLC com detector DAD a 210 nm, equipado com uma coluna HPX-87H. Use injetar volume de 10 μL para cada amostra e use H2so4 (0, 5 N) para eluir a coluna a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min a 35 ° c.

7. análise de Microbiome fecal

Nota: Realizar análise de microbioma seguindo os métodos e pipeline detalhados em outro lugar7,13,14,17.

  1. Momentaneamente, extraia o ADN genomic de aproximadamente 200 mgs de pelotas fecais da pasta usando um jogo fecal da extração do ADN13.
  2. Amplificar a região hipervariável do gene de rRNA bacteriano 16S usando os primers de código de barras de acordo com o método descrito em outros13, usando as sequências de primer como descrito no protocolo de projeto de Microbiome da terra18.
  3. Purificar os amplicões resultantes com grânulos de purificação magnética e quantificar por picogreen ou um método equivalente. Pool os produtos purificados do PCR na concentração e na seqüência iguais do molar em um Sequencer13.
  4. Processe as sequências resultantes para a de-multiplexação, filtragem de qualidade e agrupamento, atribuição taxonômica e rarefação, e análises a jusante usando o software de insights quantitativos em ecologia microbiana (QIIME) de acordo com os métodos descritos por Caporaso et al.19.

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Resultados

O protocolo é utilizado para demonstrar o efeito de um prebiótico específico (i.e., inulina sobre a composição da microbiota e atividades metabólicas em termos de alterações no pH fecal e a concentração de lactato e SCFAs nas fezes de indivíduos saudáveis humanos ao longo diferentes pontos de tempo após o tratamento com inulina). O pH fecal, os níveis fecais de lactato e SCFAs (Figura 1) e a composição da microbiota (figura

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Discussão

O modelo de fermentação fecal in vitro aqui apresentado é um modelo simples de lote único para aproximar os efeitos de diferentes substratos e cepas microbianas (por exemplo, prebióticos e probióticos) sobre a composição da microbiota fecal humana, bem como sua atividades metabólicas em termos de pH fecal e níveis de SCFAs. Os resultados aqui apresentados demonstram que a inoculação da inulina diminui o pH fecal e aumenta significativamente os níveis de SCFAs e lactato em espécimes fecais tratados com inuli...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem com gratidão o apoio ao financiamento do centro de diabetes, obesidade e metabolismo e o centro de ciência clínica e translacional, a escola de medicina Wake Forest, o departamento de financiamento da defesa (número Grant: W81XWH-18-1-0118), a cadeira Kermit Glenn Phillips II em medicina cardiovascular; os institutos nacionais de saúde financiaram Claude D. Pepper mais velhos americanos centro (financiado por P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e o centro de ciência clínica e translacional (unidade de pesquisa clínica, financiado por UL1TR001420), também é reconhecido felizmente. Agradecemos também aos voluntários por fornecer amostras fecais, e nossos outros membros do laboratório por suas ajudas técnicas durante este experimento.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)Sigma-Aldrich217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGIC2388Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O)Sigma-AldrichC3306Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O)Sigma-Aldrich255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O)Acros organics2063450000Toxic, Irritating
Cysteine-HClSigma-AldrichC121800
D-biotinSigma-AldrichB4501
D-Pantothenic acidAlfa AesarA16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)Biorad1610729
DL-α-methylbutyrateSigma-AldrichW271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O)Sigma-AldrichF8263Toxic
Folic acidAlfa AesarJ62937
GlucoseSigma-AldrichG8270
HeminSigma-AldrichH9039
HepesAlfa AesarA14777
IsobutyrateAlfa AesarL04038
IsovalerateAlfa AesarA18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O)Sigma-AldrichM8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O)Sigma-Aldrich221279
Niacin (Nicotinic acid)Sigma-AldrichN4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O)Alfa AesarA14366Toxic
N-valerateSigma-Aldrich240370
P-aminobenzoic acidMP China102569Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4)Sigma-AldrichP5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)Sigma-AldrichP5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)Sigma-Aldrich1551128
PyridoxineAlfa AesarA12041
ResazurinSigma-AldrichR7017
RiboflavinAlfa AesarA11764
Sodium carbonate (Na2CO3)Sigma-Aldrich1613757
Sodium chloride (NaCl)Fisher BioReagents7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ChemicalsS320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O)Acros organics206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)Acros organics148991000
TrypticaseBD Biosciences211921
Vitamin B12Sigma-AldrichV2876
Yeast extractSigma-Aldrich70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O)Sigma-AldrichZ0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beadsAgencourt
Anaerobic chamber with incubatoreForma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filterCorning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencerMiseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kitQiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeterInVitrogen
VortexThermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC systemWaters Corporation

Referências

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