Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

Resumo

Nós demonstramos a cultura da único-pilha das bactérias dentro das vesículas gigantes (GVs). GVs contendo células bacterianas foram preparados pelo método de transferência de gotas e foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro para observação direta do crescimento bacteriano. Essa abordagem também pode ser adaptável a outras células.

Resumo

Nós desenvolvemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro dos vesículas gigantes (GVS). A cultura bacteriana da pilha é importante para compreender a função de pilhas bacterianas no ambiente natural. Por causa dos avanços tecnológicos, as várias funções bacterianas da pilha podem ser reveladas no nível da único-pilha dentro de um espaço confinado. Os GVs são compartimentos de microdimensões esféricos compostos por moléculas de lipídios anfífilos e podem conter vários materiais, incluindo células. Neste estudo, uma única pilha bacteriana foi encapsulada em GVs de 10 – 30 μm pelo método de transferência da gota e os GVs que contêm pilhas bacterianas foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro. Nosso método é útil para observar o crescimento em tempo real de bactérias únicas dentro de GVs. Nós cultivou pilhas de Escherichia coli (E. coli) como um modelo dentro de GVS, mas este método pode ser adaptado a outros tipos da pilha. Nosso método pode ser usado na ciência e nos campos industriais da microbiologia, da biologia, da biotecnologia, e da biologia sintética.

Introdução

A cultura de células bacterianas no nível de célula única tem recebido atenção crescente. A cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de um espaço confinado pode elucidar funções bacterianas como a variabilidade fenotípica^1,2,3,4, comportamento celular^{5, 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9}, e resistência aos antibióticos^10,11. Por causa dos avanços recentes nas técnicas da cultura, a cultura de únicas bactérias pode ser conseguida dentro de um espaço confinado, como em um poço-microplaqueta⁴, 7,8, gota de gel^12,13 , e água-em-óleo (W/s) gota^5,11. Para promover a compreensão ou a utilização de únicas pilhas bacterianas, uns desenvolvimentos técnicos mais adicionais de técnicas do cultivation são necessários.

As vesículas que imitam a membrana celular biológica são compartimentos esféricos consistindo de moléculas anfífilas e podem conter vários materiais. As vesículas são classificadas de acordo com o tamanho e incluem pequenas vesículas (SVs, diâmetro < 100 nm), grandes vesículas (LVs, < 1 μm) e vesículas gigantes (GVs, > 1 μm). SVs ou LVs são comumente usados como portadores de drogas por causa de sua afinidade com a membrana celular biológica¹⁴. Os GVS também têm sido utilizados como um sistema de reator para a construção de protocélulas¹⁵ ou células artificiais¹⁶. O encapsulamento de células biológicas em GVS foi relatado^17,18, e assim o GVS mostra potencial como um sistema de cultura celular quando combinado com o sistema de reator.

Aqui, juntamente com um vídeo de procedimentos experimentais, descrevemos como os GVs podem ser usados como novos vasos de cultura de células¹⁹. GVs contendo bactérias foram feitas pelo método de transferência de gotas²⁰ e, em seguida, foram imobilizados em uma membrana suportada em um vidro de cobertura. Utilizamos este sistema para observar o crescimento bacteriano no nível de célula única dentro de GVs em tempo real.

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Protocolo

1. preparação de GVs contendo células bacterianas pelo método de transferência de gotas

1. Prepare soluções em estoque lipídico de 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[biotinilo (polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) em clorofórmio/ solução de metanol (2/1, v/v) e armazene o estoque a-20 ° c.
2. Preparação de uma solução de óleo contendo lipídios
   1. Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (Figura 1b (i)).
   2. Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para formar um filme lipídico e colocar o filme em um dessecador por 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico (Figura 1b (II)).
      Nota: É necessário evate o solvente orgânico em uma capa das emanações.
   3. Adicionar 200 μL de óleo mineral (0,84 g/mL, tabela de materiais) ao frasco para injetáveis de vidro (Figura 1b (III)).
   4. Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e a proceda num banho Ultrassônico (120 W) durante pelo menos 1 h (Figura 1b (III)). As concentrações finais de POPC e biotina-PEG-DSPE são de 1 mM e 0, 2 mM, respectivamente.
3. Pré-cultura de células bacterianas
   1. Inocular e. coli em 1x lb médio (1 g de extrato de levedura, 2 g de triptona Bacto, e 2 g de cloreto de sódio em 200 ml de água deionizada) a partir de uma placa lb e incubar a 37 ° c por 12 – 14 h (durante a noite).
   2. Após a incubação, colete 20 μL da solução de cultura e transfira para 1,98 mL de meio fresco de 1x LB e cultive as células novamente por 2 h.
   3. Verifique a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) valor da solução pré-cultura (preparada na etapa 1.3.2). Deve ser utilizada uma solução pré-cultura de OD₆₀₀ = 1,0 – 1,5.
4. Preparação das soluções aquosas exteriores e interiores de GVs
   1. Dissolver a glicose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa exterior de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de glicose de estoque (500 mM).
   2. Diluir a solução de glicose de estoque com 1x LB médio a 200 mM (tabela 1).
   3. Dissolver a sacarose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa interna de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de sacarose (500 mM).
   4. Misture a solução pré-cultura (OD₆₀₀ = 1,0 – 1,5), a solução de sacarose (500 mm) e o meio 1x lb (tabela 1). O valor final do OD₆₀₀ da solução da cultura deve ser 0.01 – 0,015 e a concentração final da sacarose deve ser 200 milímetros.
      Nota: Tome cuidado para evitar a pressão osmótica. É necessário equilibrar a concentração entre a solução aquosa interna e externa.
5. Preparação de gotas de água-em-óleo (W/O) contendo células bacterianas
   1. Adicionar 2 μL da solução aquosa interna de GVs (preparada na etapa 1.4.4) a 50 μL da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com POPC e biotina-PEG-DSPE) em um tubo de plástico lidded 0,6 mL (Figura 1b (IV)).
   2. Emulsionar os dois componentes no tubo de plástico tocando o tubo com a mão (Figura 1b (v)).
6. Formação de GVs contendo células bacterianas
   1. Adicionar 50 μL da solução aquosa exterior de GVs (preparada no passo 1.4.2) num tubo de plástico com tampa de 1,5 mL (Figura 1b (vi)) e suavemente camada 150 μl da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com popc e biotina-Peg-dspe) na superfície do aquoso exterior solução (Figura 1b (VII)). Incubar esta amostra à temperatura ambiente (RT, 25 ° c) durante 10 – 15 min. Verifique se a interface do óleo e das soluções aquosas está plana.
   2. Adicionar 50 μL da solução de gota W/O (preparada no passo 1.5.2) na interface do óleo e solução aquosa utilizando uma pipeta (Figura 1b (VIII)).
   3. Centrifugue o tubo plástico lidded de 1,5 mL (da etapa 1.6.2) por 10 minutos em 1.600 x g em RT em um centrifugador do desktop (Figura 1b (IX)). Após a centrifugação, aspirar o óleo (camada superior) do tubo plástico lidded 1,5-mL usando uma pipeta, e coletar os GVs que contêm pilhas bacterianas (Figura 1b (x)).

2. preparação de um sistema de observação GV (sistema de cultura de células bacterianas)

1. Preparação de pequenas vesículas (SVs) para constructi ng a membrana de BICAMADA suportada
   1. Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (usando a mesma composição lipídica usada para a preparação de GV na etapa 1,1).
   2. Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para dar forma a um filme do lipido e coloc esta amostra em um exsicador para 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico.
   3. Adicionar 200 μL de glicose de 200 mM em meio de 1x LB (a solução aquosa externa de GVs) ao frasco de vidro.
   4. Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e proceda-lo em um banho ultra-sônico (120 W) para pelo menos 1 h.
   5. Prepare SVs pelo método de extrusão²¹ usando uma mini-extrusora e membrana de policarbonato com 100 nm tamanho dos poros.
2. Preparação de uma câmara artesanal
   1. Perfure um furo de 7 mm com um perfurador oco em um selo de dupla face (10 mm x 10 mm x 1 mm).
   2. Cole o selo de dupla face com o furo em um vidro de cobertura (30 mm x 40 mm, espessura 0,25 – 0,35 mm).
3. Preparação de uma membrana de BICAMADA suportada no vidro de cobertura no orifício da câmara
   1. Adicionar 30 μL da solução SV ao orifício da câmara (preparado na secção 2,2) e incubar na RT durante 30 min.
   2. Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
4. Imobilização de GVs no membrana de BICAMADA suportada no vidro da tampa no furo da câmara
   1. Introduzir 10 μL de neutravidina com a solução aquosa exterior de GVs (1 mg/mL) no orifício e incubar na RT durante 15 min.
   2. Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
   3. Adicionar todas as soluções contendo GVs (preparadas na etapa 1.6.3) no orifício da câmara e selar com um vidro de cobertura (18 mm x 18 mm, espessura 0,13 – 0,17 mm) (Figura 2b).
5. Observação microscópica do crescimento de células bacterianas dentro de GVs
   1. Defina um sistema de estágio de aquecimento microscópico com um microscópio invertido equipado com uma lente objetiva de abertura numérica de 40x/0,6 (NA) com uma longa distância de trabalho (Figura 2b).
   2. Coloque a câmara no sistema de estágio de aquecimento microscópico (Figura 2b). Incubar os GVs contendo células bacterianas na câmara a uma condição estática de 6 h a 37 ° c.
   3. Capture e registre imagens do microscópio do crescimento bacteriano da pilha dentro de GVs cada 30 minutos usando uma câmera complementar científica do semicondutor do óxido metálico (sCMOS).

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Resultados

Apresentamos um método simples para a geração de GVs contendo células bacterianas únicas utilizando o método de transferência de gotas (Figura 1). A Figura 1a mostra uma imagem esquemática da precipitação de GVS contendo bactérias. As gotas de W/O que contêm as bactérias são transferidas através da relação da óleo-água (monolayer do lipido) pela centrifugação para dar forma a GVs. A diferença de densidade en...

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Discussão

Aqui, nós descrevemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro de GVs. Este método simples envolve a formação de GVs contendo células bacterianas no nível de célula única usando o método de transferência de gotas. Comparado com outras abordagens para a obtenção de GVs contendo células bacterianas, este método tem duas vantagens: (i) é fácil de desenvolver, e (II) um pequeno volume (2 μL) da solução de amostra é necessário para preparar os GVs. O método de transfer?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bactotryptone	BD Biosciences	211705
Chloroform	Wako Pure Chemicals	032-21921
Cover glass (18 × 18 mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	custom-order	thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge	Hi-Tech Co.	ATT101	swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm)	Nitoms	T4613
Glass vial	AS ONE	6-306-01	Durham fermentation tube
Glucose	Wako Pure Chemicals	049-31165
Inverted microscope	Olympus	IX-73
Methanol	Wako Pure Chemicals	133-16771
Microscopic heating stage system	TOKAI HIT	TP-110R-100
Mineral oil	Nacalai Tesque	23334-85
Mini-extruder	Avanti Polar Lipids	610000
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Objective lens	Olympus	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes	Avanti Polar Lipids	610005	pore size 100 nm
sCMOS camera	Andor	Zyla 4.2 plus
Sodium chloride	Wako Pure Chemicals	191-01665
Sucrose	Wako Pure Chemicals	196-00015
Ultrasonic bath	AS ONE	ASU-3D
Yeast extract	BD Biosciences	212750
0.6 mL lidded plastic tube	Watson	130-806C
1.5 mL lidded plastic tube	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline	Avanti Polar Lipids	850457P	POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129P	Biotin-PEG-DSPE