Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O

Resumo

Uma série de métodos para determinar a taxa potencial de DNRA com base em ¹⁴NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ análises é fornecida em detalhes. NH₄⁺ é convertido em N₂O através de várias etapas e analisado usando cromatografia de gás quadrupole-espectrometria de massa.

Resumo

A importância de entender o destino do nitrato (NO₃⁻), que é a espécie N dominante transferida de ecossistemas terrestres para aquáticos, tem aumentado porque as cargas globais de nitrogênio aumentaram drasticamente após a industrialização. A redução do nitrato dissimlatório para o amônio (DNRA) e a denitrificação são processos microbianos que usam o NO₃^– para respiração. Em comparação com a denitrificação, as determinações quantitativas da atividade DNRA têm sido realizadas apenas em uma medida limitada. Isso levou a uma compreensão insuficiente da importância do DNRA no Nº₃^– transformações e os fatores reguladores desse processo. O objetivo deste artigo é fornecer um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Em suma, a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir da taxa de acumulação de amônio com rótulo ^{N 15}NH (¹⁵NH₄⁺) em ¹⁵NO₃⁻ incubação adicionada. A determinação das concentrações ¹⁴NH₄⁺ e ¹⁵NH₄⁺ descritas neste artigo é composta pelas etapas a seguir. Primeiro, o NH₄⁺ na amostra é extraído e preso em um filtro de vidro acidificado como sal de amônio. Em segundo lugar, o amônio preso é elucido e oxidado para o Nº₃^- via oxidação persulfeto. Em terceiro lugar, o NO₃⁻ é convertido para N₂O através de um N₂O reductase denitrifier deficiente. Finalmente, o N₂O convertido é analisado usando um sistema de espectrometria de gás quadrúpole previamente desenvolvido. Aplicamos este método aos sedimentos de pântanos salgados e calculamos suas potenciais taxas de DNRA, demonstrando que os procedimentos propostos permitem uma determinação simples e mais rápida em comparação com os métodos descritos anteriormente.

Introdução

A síntese artificial do fertilizante nitrogênio e sua aplicação generalizada têm perturbado muito o ciclo global de nitrogênio. Estima-se que a transferência de nitrogênio reativo de sistemas terrestres para costeiros dobrou desde o pré-industrial¹. Uma porção significativa de fertilizantes aplicados a um determinado campo é levada do solo para rios ou águas subterrâneas, principalmente como nº₃^{− 2}. Isso pode causar problemas ambientais, como a poluição da água potável, a eutrofização e a formação de hipóxia. NO₃⁻ em ambientes hídricos é removido ou retido no ecossistema através de assimilação biológica e vários processos dissimlatórios microbianos. A denitrificação e a anammox são conhecidas por serem os principais processos de remoção microbiana para o NO₃⁻. A denitrificação é a redução microbiana de produtos_N⁻ N gasoso (NO, N₂O e N₂) juntamente com a oxidação de um doador de elétrons, como substâncias orgânicas, reduzindo assim o risco dos problemas acima mencionados. A Anammox também produz N₂ a partir de NO₂⁻ e NH₄⁺; portanto, remove n inorgânico de um ecossistema. Por outro lado, a DNRA trabalha para reter n em um ecossistema; é geralmente aceito que o DNRA é realizado principalmente por bactérias fermentativas ou quimiotoautotróficas e que reduzem o dissimlatório NO₃^– à NH 4⁺₄+ biodisponente e menos móvel.

Estudos sobre DNRA têm sido realizados principalmente em ecossistemas marinhos ou estuarinos, como sedimentos oceânicos ou estuarinos e água, solo salgado ou salgado e solo de manguezal. Ecossistemas costeiros ou marinhos são importantes como reservatórios para a remoção do Nº₃^– dos ecossistemas terrestres, e em estudos anteriores o DNRA tem se mostrado contribuinte em uma gama muito ampla de NO₃⁻ remoção (0-99%)^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}. Além disso, a existência do DNRA tem sido demonstrada em uma ampla gama de ambientes, incluindo ambientes de água doce^19,solos de arroz²⁰e solos^{florestais 21}. Embora esses estudos tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente comparável à denitrificação para o NO₃⁻ remoção, os estudos que medem a atividade de DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação.

A taxa de DNRA foi avaliada ^{utilizando-se 15}técnicas de rotulagem N em conjunto com a análise de dados por meio de modelos analíticos ou numéricos. Uma solução analítica para calcular a taxa DNRA baseia-se no aumento do enriquecimento de ¹⁵N do pool NH₄⁺ após a adição de ¹⁵NO₃⁻ como rastreador. ¹⁵ N-rotulado NO₃⁻ é adicionado a uma amostra e incubado, e a taxa de DNRA pode então ser calculada a partir da concentração e da razão isótopo alterações na NH₄⁺ antes e depois de um determinado período de tempo. Neste artigo, um método para quantificar a concentração NH₄⁺ e a razão isótopos, que são necessários para calcular a taxa de DNRA, é descrito em detalhes. Basicamente, o método aqui relatado é uma combinação de várias técnicas relatadas anteriormente^{22,23,24,25,26} com modificações adicionadas a alguns procedimentos. O método é composto por uma série de cinco procedimentos componentes: (1) incubação de uma amostra ambiental com a alteração de um rastreador de isótopos estáveis, ¹⁵NO₃⁻, (2) extração e recuperação de NH₄⁺ utilizando um "procedimento de difusão" com modificações, (3) oxidação persulfato de NH₄⁺ na amostra, constituído por NH₄⁺ e ¹⁵NH₄⁺ derivados de ¹⁵NO₃⁻ via atividade DNRA, em NO₃⁻ e ¹⁵NO₃⁻, (4) posterior transformação microbiana de NO₃⁻ e ^{1 5}NO₃⁻ para N₂O isotopomers através do método denitrifier modificado, e (5) quantificação dos isotopolímeros N₂O usando cromatografia a gás espectrometria de massa (GC/MS). Na seção seguinte, primeiro, a preparação para procedimentos (2) e (4) é descrita e, posteriormente, todos os cinco procedimentos componentes são descritos detalhadamente.

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Protocolo

1. Preparação de um envelope PTFE para captura quantitativa de NH_{gasoso 3}

1. Coloque uma peça de 60 mm de fita politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de largura) em uma pequena folha de papel alumínio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamanho, limpa com etanol).
2. Ash um filtro de fibra de vidro (10 mm de diâmetro com um tamanho de poros de 2,7 μm) a 450 °C por 4h em um forno de abafa. Coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita(Figura 1a).
3. Local 20 μL de 0,9-mol/L H₂SO₄ no centro de um filtro GF/D, e dobre imediatamente a fita PTFE usando duas pinças: pinças de selo de ponta plana e pinças retas. As etapas a seguir, as etapas 1.4-1.7, são mostradas na Figura 1 e devem ser conduzidas rapidamente.
4. Gire a fita PTFE sobre o filtro GF/D na linha pontilhada mostrada na Figura 1a para formar a forma mostrada na Figura 1b.
5. Sele ambos os lados dobrando e, em seguida, pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1c). Não pressione muito forte e não arranhe a fita PTFE.
6. Dobre a extremidade aberta com a pinça e, em seguida, pressione a borda com a pinça(Figura 1d).
7. Sele a extremidade aberta pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1e). O filtro GF/D não deve ser pressionado durante este procedimento.

2. Preparando a biomassa de um denitrifier deficiente de óxido nitroso, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, para o método denitrifier

1. Reúna um estoque de 20% de glicerol de pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 em 1/4 de força triptona caldo de soja (TSB). Incubar as placas a 25 °C durante 2-3 dias.
2. Transfira uma colônia de solteiros de P. clororaphis para um pequeno tubo de ensaio contendo 5 mL de meio TSB autoclavado e cultura aerobicamente (sem tremer) por um dia a 25 °C no escuro até obter o crescimento máximo; isso será usado como a précultura.
3. Transfira 3 mL da pré-cultura para uma garrafa 1-L com rolha de borracha de silício contendo 1 L de TSB modificado autoclavado recém-preparado complementado com 10 mmol/L KNO₃²³. Incubar a garrafa enquanto agita usando um agitador em condições escuras a 25 °C. Depois de cultivar por 8h, substitua a rolha de borracha de silicone por uma tampa de parafuso e feche firmemente. Continue o cultivo em anoxia durante a noite.
4. Centrifugar a cultura a 18.800 x g por 15 min a 4 °C para obter pelotas de biomassa.
5. Lave a biomassa embalada três vezes com 30 mL da solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), para eliminar completamente o Nº₃⁻. As condições da centrifugação são as mesmas do passo 2.3.
6. Após a lavagem, suspenda a biomassa embalada com 30 mL de D-PBS(-). Use 1 mL da suspensão para determinar a densidade celular medindo OD₆₀₀. Alíquotas pipetas de 1 mL da suspensão restante em criovials estéreis contendo 0,8 mL de 45% de glicerol. Preservar os estoques de glicerol preparados a −80 °C até usar (ver seção 6).

3. Eliminação de oxigênio, nitrito e nitrato do sedimento amostral

1. Pesar 3,0 g (peso molhado) de sedimento em um frasco de vidro de 20 mL e adicionar 9,0 mL de água superficial para suspendê-lo (25% c/w chorume).
2. Sele o frasco com uma rolha de borracha butil preta (lavada com água trocada por íons e esterilizada via autoclaving) e uma tampa de alumínio.
3. Purgue a suspensão e substitua o ar do headspace por Ar (>99,99%) a 0,6 L/min por 20 min usando um coletor.
4. Substitua o gás ar headspace por ultra-puro (>99,99995%) Ele aspirando por 90 s e cobrando Ele por 30 s. Repita este procedimento quatro vezes. Coloque a pressão do gás na cabeça para 1,5 atm.
5. Incubar os frascos a 20 °C durante a noite com agitação a 150 rpm em condições escuras usando um agitador de temperatura constante para eliminar o restante do oxigênio, nitrato e nitrito na suspensão de sedimentos e gás headspace.

4. Experiência de curso de tempo para determinar a taxa de DNRA

1. Substitua o gás do espaço da cabeça por ultra-puro fresco Ele usando o mesmo procedimento que na etapa 3.5, mas sem as quatro repetições.
2. Adicione substratos rotulados e não rotulados a cada frasco de acordo com a Tabela 1 através da rolha de borracha butil usando uma seringa gastight. Purigue as soluções de substrato previamente preparadas em frascos de vidro de tamanho adequado usando he ultra-puro com a pressão do headspace definida para 1,5 atm para evitar contaminação do ar. Evite a injeção não intencional de qualquer quantidade de ar durante os procedimentos de injeção.
3. Incubar frascos a 20 °C com agitação a 150 rpm. Adicione os substratos a cada frasco de acordo com a Tabela 1 e incubar por 1h, 3 h e 5h. Após a paralisação da incubação, sujeito a suspensão de sedimentos nos frascos aos seguintes procedimentos: etapas 4.4-4.9.
4. Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl de cada frasco. Em seguida, adicione KCl (ashed a 450 °C por 4 h) à suspensão de sedimentos até uma concentração final de aproximadamente 2 mol/L para garantir a recuperação de NH₄⁺ do sedimento. Feche os frascos com uma rolha de borracha butyl e um fechamento de alumínio.
5. Agite o sedimento a 150 rpm por 1h a 4 °C em condições escuras para extrair o NH₄⁺.
6. Transfira toda a suspensão de sedimentos no frasco para um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL e centrífuga a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
7. Enxágüe a parede interna de uma seringa descartável de 10 mL recém-aberta e anexe-a a um filtro de membrana de acetato de celulose descartável recém-aberto (tamanho de poros 0,22 μm, 25 mm de diâmetro). Em seguida, enxágue o filtro de membrana com 1 mL de supernasal. Coloque a unidade de filtro de seringa enxaguada em uma garrafa de polipropileno de boca larga (PP) de 20 mL.
8. Filtre o restante sobrenante através de um filtro de membrana de acetato na garrafa PP de 20 mL. Armazene os extratos a −20 °C até uma análise mais aprofundada.

5. Captura de NH₄⁺ em 2M H₂SO₄ absorvido ao filtro GF/D no envelope PTFE e a oxidação persulfato de NH₄⁺ a NO₃⁻

1. Prepare soluções padrão de ¹⁴NH₄Cl com gradientes de concentração de 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L e 500 μmol/L. Para a análise da razão ^{de 15}N, fixar a concentração total de NH₄⁺ a 200 μmol/L e preparar as relações de isótopos de 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50, e 10:90 com soluções padrão ^{puras 14}NH₄Cl e ¹⁵NH₄Cl.
2. Transfira 30 mg de MgO (cinzas a 450 °C por 4 h) para um frasco de vidro de 20 mL e coloque o envelope PTFE no frasco.
3. Transfira 5 mL de uma amostra ou padrão para o frasco contendo o MgO e o envelope PTFE, e feche imediatamente com uma rolha de borracha de butyl cinza. Vedação com uma tampa de alumínio. Se a concentração de NH₄⁺ for esperada para exceder 500 μmol/L, diluir a amostra para abaixo de 500 μmol/L.
4. Agite os frascos a 150 rpm por 3h a 4 °C em condições escuras.
5. Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl. Tire o envelope PTFE do frasco usando pinças pontiagudas, enxágue completamente o envelope e a pinça com água trocada por íons, limpe-os com um papel de limpeza e, em seguida, coloque o envelope em um papel de limpeza fresco.
6. Abra o envelope PTFE com um par de pinças (o uso da pinça de ponta plana e ponta é recomendado) na ordem exata de ordem inversa do dobrável realizado nas etapas 1.4-1.7.
7. Segure a área periférica do filtro GF/D, onde o H₂SO₄ deve ser desvendado, com a pinça de ponta plana, e transfira-a para um tubo de ensaio de tampa de parafuso de 11 mL com uma tampa forrada com PTFE. Enxágüe as pinças com água trocada por íons e limpe-as com papel de limpeza.
8. Repita as etapas 5.5-5.7 para os envelopes restantes.
9. Adicione 1 mL de água trocada de íons a cada um dos tubos de ensaio, feche a tampa do parafuso e mantenha-a sem tremer por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente para elutar completamente o NH₄⁺ do filtro GF/D. Durante esta etapa, realize a etapa seguinte (etapa 5.10) em paralelo.
10. Prepare o reagente persulfate-oxidante (POR)^25,26.
    1. Como não pode ser armazenado, prepare a quantidade exata de POR necessária para o tratamento de um único dia de amostras.
    2. Para preparar o POR para tratar 50 amostras, despeje 100 mL de água trocada por íons em uma garrafa de tampa de parafuso de 200 mL e adicione 1,52 g de NaOH (grau de análise composto de nitrogênio), 3 g de ácido bórico e 5 g de K₂S₂O₈ (grau de análise de nitrogênio e fósforo) nessa ordem. Imediatamente após adicionar cada reagente, agite a solução até que ela seja completamente dissolvida.
    3. Se necessário, mergulhe a garrafa em água morna para ajudar na dissolução dos produtos químicos; no entanto, deve-se prestar atenção em relação à contaminação do Nº₃^– porque a água da torneira normalmente contém o Nº₃⁻.
11. Após a etapa 5.8, abra a tampa do parafuso, adicione 2 mL do reagente POR ao tubo de ensaio e feche o tubo firmemente com uma tampa de parafuso para evitar qualquer perda ou contaminação durante as etapas seguintes.
12. Coloque os tubos de ensaio em um rack, enrole-os em papel alumínio de duas camadas e autoclave-os por 1h a 121 °C. Mantenha os tubos em posição vertical durante esta etapa e evite mudanças rápidas de temperatura após o término do autoclaving.

6. Determinando o NO₃⁻ convertido a partir de NH₄⁺ pelo método denitrifier usando quadrupole GC/MS

1. Misture 100 mL de tampão fosfato estéril de 40 mmol/L (pH 7,2) e 100 mL de glicose estéril de 30 mmol/L asepticamente (fosfato de 20 mmol/L e glicose de 15 mmol/L; final).
2. Adicione um volume de 1/7,2 volume de estoque de glicerol de C. clororaphis a 200 mL da solução de glicose tamponada com fosfato em um frasco de Erlenmeyer de 300 mL, e purga com um He ultra-puro (>99,995%) fluxo por 1 h.
3. Dispense 2,0 mL da suspensão denitrifier em cada frasco de 5 mL. Tampe os frascos com uma rolha de borracha de butyl cinza e um fechamento de alumínio.
4. Substitua o ar da cabeça por he ultra-puro, aspirando por 3 minutos e carregando o He por 1 min. Coloque a pressão positiva do gás do headspace para 1,3 atm para evitar contaminação de ar não intencional.
5. Injete 1 mL de uma amostra ou padrão através da rolha de borracha butil usando uma seringa descartável de 1 mL. Note a quantidade exata da amostra injetada.
6. Incubar os frascos durante a noite a 25 °C em condições escuras.
7. Injete 0,3 mL de 6-mol/LL NaOH para parar a denitrificação e absorver o CO₂do headspace, o que de outra forma perturbará seriamente a análise N₂O por GC/MS porque o CO₂ e o N₂O têm o mesmo peso molecular.
8. Determine as quantidades de ⁴⁴N₂O, ⁴⁵N₂O e ⁴⁶N₂O no gás headspace usando quadrupole GC/MS com uma porta de injeção modificada²⁵. As condições de funcionamento utilizadas para a análise GC/MS estão mostradas na Tabela 2.

7. Análise de dados

1. Derivar a curva de calibração para o NH₄⁺ concentração da relação linear entre a concentração conhecida de ¹⁴NH₄⁺ e as intensidades de sinal medidos do total produzido ⁴⁴N₂O + ⁴⁵N₂O + ⁴⁶N₂O. Derivar a curva de calibração para o teor de ¹⁵N da relação linear entre o átomo conhecido% (ou seja,. ¹⁵N/¹⁴N+¹⁵N) e o átomo calculado% usando uma equação previamente fornecida²⁷. Calcule a concentração de ¹⁵NH₄⁺ multiplicando o total de NH₄⁺ pela razão ^{de 15}N de NH₄⁺.
2. Calcule a taxa potencial de DNRA usando equações fornecidas em outros lugares^28,,29,30.

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Resultados

Os resultados representativos apresentados neste artigo foram derivados de ¹⁵experimentos de rastreamento n de sedimentos de pântanos salgados. O pântano de sal amostrado foi recentemente criado após o Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área de Moune da cidade de Kesen-numa, na província de Miyagi, japão. Em setembro de 2017, sedimentos superficiais (0-3 cm) foram coletados em dois locais nas zonas subtidal e intertidais. Primeiro, logo após a coleta, o sedim...

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Discussão

A razão de concentração e isótopo de NH₄⁺ para a análise DNRA foi quantificada utilizando vários métodos. As concentrações e as relações de isótopos de NH₄⁺ são geralmente medidas separadamente. A concentração NH₄⁺ é tipicamente medida usando métodos colorimétricos, incluindo um autoanalyzer^4,10,15,16,

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15N-KNO3	SHOKO SCIENCE	N15-0197
15N-NH4Cl	SHOKO SCIENCE	N15-0034
20 mL PP bottle	SANPLATEC	61-3210-18	Wide-mouth
Aluminum cap	Maruemu	1307-13	No. 20, with hole
Boric acid	Wako	021-02195
Centrifuge	HITACHI	Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector	SANSIN INDUSTRIAL	IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter	ADVANTEC	25CS020AS	Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe	Termo	SS-10SZ	10 mL
Disposable syringe	Termo	SS-01T	1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)	NISSUI PHARMACEUTICAL	5913
Gastight syringe	VICI Valco Instruments	4075-15010	Series A-2, 100 µL
GC/MS	shimadzu	GCMS-QP2010ultra
GF/D	Whatman	1823-010	10 mm in diameter
Glass vial	Maruemu	0501-06	20 mL
Gray butyl rubber stopper	Maruemu	1306-03	No.20-S
H2SO4	Wako	192-04696	Guaranteed Reagent
K2S2O8	Wako	169-11891	Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl	Wako	163-03545	Guaranteed Reagent
KNO3	Wako	160-04035	Guaranteed Reagent
NaOH	Wako	191-08625	Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl	Wako	017-02995	Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube	ASONE	1-3500-22	50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 13985	Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape	Sigma-Aldrich	Z221880	25 mm in width
Reciprocating shaker	TAITEC	0000207-000	NR-10
Screw-cap test tube	IWAKI	84-0252	11 mL
PTFE-lined cap for test tube	IWAKI	84-0262
Tryptic Soy Broth	Difco Laboratories	211825