Fotoestimulação por Femtosecond laser ativa extracellular-sinal-regulado quinase (ERK) sinalização ou eventos mitocondrial em células-alvo

Resumo

O laser de femtossegundo firmemente-focalizado pode entregar a estimulação precisa às pilhas acoplando em uma microscopia confocal permitindo a observação e a fotoestimulação tempo real. A fotoestimulação pode ativar eventos moleculares celulares, incluindo via de sinalização ERK e flashes mitocondriais de espécies reativas de oxigênio.

Resumo

O controle direto de eventos moleculares definidos celulares é importante para a ciência da vida. Recentemente, os estudos demonstraram que a estimulação do laser do femtossegundo pode simultaneamente ativar várias vias moleculares celulares da sinalização. Neste protocolo, nós mostramos que através do acoplamento do laser do femtossegundo em um microscópio confocal, as pilhas podem ser estimuladas precisamente pelo laser firmemente-focalizado. Alguns processos moleculares que podem ser observados simultaneamente são subsequentemente ativados. Nós apresentamos protocolos detalhados da fotoestimulação para ativar a via de sinalização regulada do sinal extracelular da quinase (Erk) em pilhas de Hela. Os flashes mitochondrial de espécies reactivas do oxigênio (ROS) e outros eventos mitochondrial podem igualmente ser estimulados se focalizando o pulso do laser do femtossegundo em uma determinada estrutura tubular mitochondrial. Este protocolo inclui o pré-tratamento de células antes da fotoestimulação, entregando a fotoestimulação por um flash laser femtossegundo no alvo, e observando/identificando alterações moleculares depois. Este protocolo representa uma ferramenta toda ótica para pesquisas biológicas relacionadas.

Introdução

A tecnologia de controlar moléculas de sinalização celular é uma parte importante do desenvolvimento da ciência da vida. Tradicionalmente, o método mais comumente utilizado é o tratamento bioquímico por drogas ou materiais^{biológicos 1,2,3}. Ao longo da última década, a invenção da optogenética abre uma nova era para a modulação celular de sinais moleculares. O transfection com proteínas sensíveis claras pela engenharia do gene faz a luz transformar-se uma ferramenta poderosa para modular várias atividades da proteína na pilha do alvo. Esta tecnologia tem feito avanços encorajadores, tais como excitação e inibição do sinal neural, promovendo a expressão gênica, manipulando padrões de sinais celulares, conduzindo diferentes destinos celulares e investigação patológica^{4,5 ,6,7,8,9}. No entanto, a luz só pode funcionar através da transfecting células com proteínas optogenéticas. No estágio atual, existem métodos raros que permitem a luz controlar moléculas celulares diretamente além da optogenética.

O laser de Femtosecond tem pesquisas biológicas avançadas fornecendo a excitação eficiente do multifotônica ao manter a boa segurança biológica. Através da implantação de diversas estratégias de processamento de fotos, realizou inúmeras realizações como microscopia multifóton, microcirurgias e aplicações optogenéticas multifótons^10,11,12, 12,13 ^,14,15,16. As investigações recentes mostram que a estimulação do laser do femtossegundo foi demonstrada como um método ótico altamente eficiente para induzir diretamente eventos de sinalização moleculars. Verificou-se que a irradiação de laser femtossegundo fortemente focada no retículo endoplasmático (er) é capaz de esgotar o cálcio em ER e ativar os canais de cálcio ativado por liberação de cálcio (crac) para formar sinais de cálcio nas células¹⁷. Este sinal de cálcio foto-ativado pode se espalhar entre vários tipos de células^18,19,20. Além disso, também tem a capacidade de ativar as vias de sinalização celular, como o fator nuclear de células T ativadas (NFAT) e a via de sinalização Erk^21,22. Ajustando a intensidade e a localização da exposição do laser de femtossegundo nas pilhas, por exemplo, focalizando o laser em mitocôndria, pode influenciar a morfologia mitochondrial e os eventos moleculars^{23,24, 25}. especificamente, rajadas de geração de Ros mitocondrial podem ser excitadas pela fotoestimulação, que é remarcada como flashes fluorescentes na mitocôndria (mitofcílios).

Assim, a tecnologia de fotoestimulação é de bom potencial para ser amplamente aplicada na pesquisa biológica relacionada. É igualmente uma boa possibilidade estender aplicações do laser do femtossegundo no controlo de moléculas e de funções de sinalização celulares além da microscopia. Aqui, nós fornecemos os detalhes técnicos da fotoestimulação. A fotoestimulação é conseguida acoplando um laser do femtossegundo a um microscópio confocal para fornecer a única pilha do alvo com um photoestimulação instantâneo curto. Pode iniciar a ativação de ERK eficiente e controlável na célula. Se a fotoestimulação está localizada na estrutura tubular mitocondrial, o potencial de membrana mitocondrial, morfologia, ROS e poros de transição de permeabilidade, todos podem ser controlados pela fotoestimulação. Baseado neste esquema da fotoestimulação, nós fornecemos um método detalhado de ativar a via de sinalização de ERK e de influenciar eventos mitochondrial múltiplos em pilhas de Hela. Este protocolo esclarece o processo de entregar a estimulação do laser do femtossegundo em pilhas do alvo.

O sistema da fotoestimulação é estabelecido em um microscópio confocal com um acoplamento do laser do femtossegundo nele para a estimulação simultânea e a microscopia contínua. O laser femtossegundo (comprimento de onda: 1.040 nm, taxa de repetição: 50 MHz, largura de pulso: 120 FS, potência média máxima de saída: 1 W) é dividido em duas vigas antes do acoplamento. Um é guiado através de um telescópio do relé que consiste em um par de lentes. É então diretamente refletida na abertura traseira de um objetivo (60x, N.A. = 1,2, imersão em água) para formar um foco de difração-limite (stim-A). O outro é refletido ao trajeto ótico da exploração do microscópio confocal para trabalhar como um modo da exploração do dois-fotão (stim-B). O stim-A apresenta um ponto de foco fixo no centro do campo de visão (FOV). Stim-B é uma área de exploração confocal parcial pre-projetada no FOV. Stim-A e stim-B são mostrados na Figura 1a. Uma câmera do CCD o espelho dichroic (DM) fornece a imagem latente do brilhante-campo para monitorar o foco do laser do femtossegundo.

Há alguns fundamentos cruciais para os seguintes experimentos. Neste protocolo, uma fonte do laser da fibra do femtossegundo (1040 nanômetro, 50 megahertz, 120 FS) é usada como um exemplo. Na prática, a maioria de osciladores femtossegundo comerciais podem ser usados contanto que a largura de pulso for mais curta do que 200 FS e a densidade de poder máxima deve estar acima do nível de 10¹¹ ~ 10¹² W/cm². Por exemplo, um laser de ti: Sapphire geralmente usado para microscopia multifóton é capaz de substituir o laser femtossegundo mostrado na Figura 1b. O poder do laser e alguns outros parâmetros da fotoestimulação precisam de ser ajustados porque os parâmetros óticos (largura de pulso, comprimento de onda, e taxa da repetição) variam muito em lasers diferentes do femtossegundo que induzem assim eficiências diferentes da excitação do multifotônica.

Junto com a estimulação do laser do femtossegundo, a microscopia confocal fornece a imagem latente contínua da pilha para monitorar a dinâmica molecular no tempo real em ambos os modos de stim-A e de stim-B. Ambos os esquemas de fotoestimulação (stim-A e stim-B) são controlados por um obturador mecânico com resolução de milissegundo (Figura 1).

No modo stim-a, a posição do foco do laser é fixada no centro de FOV. Um telescópio do relé é usado para assegurar o foco do laser do femtossegundo a ser localizado no plano Confocal da imagem latente ajustando a distância entre duas lentes no sentido vertical (o sentido da propagação do laser, vertical ao plano Confocal da imagem latente, como mostrado em Figura 1). Pela imagem latente do brilhante-campo da câmera do CCD, o diâmetro do foco do laser pode ser medido (~ 2 μm, Figura 2b). As durações de estimulação e os tempos de exposição são controlados por um obturador durante o processo de imagem confocal.

Na modalidade de stim-B, a área da estimulação pode pre-ser atribuída manualmente no software de controlo da imagem latente confocal a todo o formulário como a linha, o polígono, ou o círculo. O obturador é sincronizado com o processo de digitalização confocal. Abre no tempo pre-designed que é ajustado com o software de controlo da imagem latente confocal. Em seguida, a área de estimulação é digitalizada pelo laser femtossegundo como microscopia confocal. Assim, a amostra só é estimulada pelo laser femtossegundo quando o processo de digitalização confocal entra em um determinado quadro de imagem.

O sistema da fotoestimulação pode ser estabelecido em Microscópios Metalúrgicos invertidos e eretos de acordo com os assuntos do experimento. As células in vitro cultivadas em placas de Petri são melhores para trabalhar com microscópios invertidos. Animais, especialmente cérebros de animais vivos, são mais adequados com microscópios verticais. Neste estudo, tomamos o microscópio invertido como exemplo. Deve-se notar que a tampa do prato de Petri não é aberta durante todo o experimento.

Protocolo

Atenção: O protocolo apresentado a seguir envolve o uso de laser nir femtossegundo e produtos químicos tóxicos. Pague por favor a atenção a todos os danos possíveis induzidos por procedimentos da experimentação. Por favor, leia as fichas de dados de segurança de todos os produtos químicos relevantes ou outros materiais antes de usar. Por favor, siga as instruções de segurança das instalações de laser ou consultar os profissionais para orientação antes de operar a fonte de laser.

1. preparação experimental

1. Configurando o sistema de fotoestimulação
   Nota: O sistema consiste em um laser do femtossegundo e em um laser (na escala visível para a excitação da fluorescência) que digitaliza o microscópio confocal. Na Figura 1, um laser de fibra femtossegundo (1.040 nm, 50 MHz, 120 FS, 1 W) é usado para acoplamento. Os parâmetros não são fixos ou necessários. Pode ser substituída por um ti: laser de safira ou outros osciladores femtossegundo comerciais na gama nir.
   1. Sintonize o laser femtossegundo e o microscópio confocal.
      Nota: Por favor, defina o poder do laser femtossegundo em um nível baixo (~ 50 MW) no processo de ajuste do caminho óptico.
   2. Use espelhos Refletivos (RM1 e RM2 mostrados na Figura 1b) para direcionar o feixe de laser femtossegundo através de um obturador mecânico. Abra o obturador.
   3. Definir um divisor de feixe 50/50 (BS, Figura 1b) para dividir o feixe de laser femtossegundo em duas vigas separadas (feixe de transmissão e feixe de reflexão). Orientar RM2 e BS para fazer o feixe de laser femtossegundo coincidir com o feixe de laser de digitalização.
      Nota: (1) uma íris de referência (Iris 1, Figura 1b) atrás do espelho dicróico de passagem longa (DM, 700 nm de comprimento de onda de corte, Figura 1b) é usada para posicionar o caminho do laser de digitalização. (2) o sistema só pode funcionar no modo stim-A ou stim-B, respectivamente. Para o modo stim-a, o BS pode ser removido. Para o stim-B, o BS pode ser substituído por um RM.
   4. Ajuste um telescópio do relé que consiste em um par de lentes para expandir a largura do feixe da transmissão, que é consistem com a abertura traseira do objetivo.
      Nota: (1) a íris de referência 2 e 3 (Figura 1b) está definida para Colime o feixe de laser femtossegundo (Figura 1b). (2) a ampliação do telescópio do relé depende do diâmetro original do feixe de laser do femtossegundo e do diâmetro da abertura traseira do objetivo.
   5. Orientar RMs (RM 3-5, Figura 1b) para alinhar o feixe expandido no microscópio. Orientar RM 4 e RM 5 para ajustar o foco do laser femtossegundo para o centro de FOV.
   6. Meça a eficiência da transmissão do objetivo do laser do femtossegundo.
      Nota: Por favor, medir a potência do laser em stim-A e stim-B, respectivamente, devido aos diferentes caminhos de penetração do laser nesses dois modos. Usará o poder na amostra para ilustrar procedimentos relacionados da experimentação abaixo.
   7. Sintonize o obturador, o laser femtossegundo e o microscópio confocal até que as experiências comecem.
      Nota: Nos experimentos a seguir, stim-A e stim-B não funcionam juntos. Se estiver usando stim-a, o feixe de laser femtossegundo de stim-B precisa ser bloqueado. Por outro lado, o feixe de stim-A deve ser bloqueado se o sistema funciona no modo stim-B.
2. Prepare o meio de cultura: a glicose elevada do meio de Eagle (DMEM) de Dulbecco modificada com soro bovino fetal de 10% (FBS).
3. Prepare o plasmídeo de DNA ERK2-GFP, plasmídeo de DNA de mito-GFP e matriz mitocondrial-segmentação por plasmídeo de DNA de proteína fluorescente amarela circularmente permuted (MT-cpYFP). Mantenha os plasmímids a-20 ° c até o uso.
4. Prepare a tetrametilrodamina (TMRM, 100 μM) e a polietilenimina (PEI 1 mg/mL). Mantenha-os em-20 ° c até o uso.
5. Prepare 5% paraformaldehyde, 0,5% Triton X-100, anti-eIF4E (fator 4E da iniciação da tradução eukaryotic), anticorpo (fósforo S209, 1 mg/mL), anticorpo de anti-Bax (1 mg/mL), anticorpo do anti-cytochrome C (1 mg/mL), anticorpo secundário (anti-coelho IgG H & L, Alexa fluor 488, 1 mg/mL) e 1% BSA com 0,1% Tween20. Manter estes reagentes a 4 ° c até à utilização.
6. Prepare materiais estéreis: garrafas de cultura celular, placas de Petri com fundo de corrediça de vidro (Figura 3a), pratos com fundo de vidro, uma grade de localização de célula impressa de 500 μm (Figura 3B, para localizar as células fotoestimuladas), 1,5 ml e 10 ml de tubos, e 1 mL, 100 μL e 10 μL de pipetas e pontas.
7. Prepare o equipamento de laboratório padrão da cultura de pilha: uma incubadora da cultura de pilha ajustada em 5% CO₂ e 37 ° c, e um armário de segurança biológico.

2. cultura e Transfection da pilha

Nota: Célula de Hela (linha celular derivada de células cancerosas do colo do útero tiradas em 8 de fevereiro de 1951 de Henrietta carece)²⁶ é usado como um exemplo neste protocolo.

1. Passagem da pilha
   1. Remova o meio de cultura da garrafa de cultura de célula que contém células suficientes.
   2. Lave o frasco com 2 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Retire o PBS.
   3. Adicione 1 mL de tripsina lentamente e bata levemente na garrafa. Coloque a garrafa de volta na incubadora e incubar as células 3 min a 37 ° c.
   4. Remova a tripsina. Adicionar 2-3 mL de meio de cultura. Pipeta o meio várias vezes para ajudar as células a desanexar. Transfira o meio com células para um tubo de 10 mL.
   5. Tome 10 μL da amostra do tubo para contagem de células.
   6. Semente ~ 25.000 células em um prato de Petri (Figura 3a) e adicionar meio de cultura até 1 ml.
   7. Põr o prato contido pilhas para trás na incubadora. Incubar as células 24 h a 37 ° c antes da transfecção.
2. Transfection da pilha
   1. Use 0,5 μg de plasmídeo de DNA (ERK2-GFP, mito-GFP ou MT-cpYFP) para transfecção por prato. Adicionar 0,5 μg de plasmídeo e 2,5 μg de PEI em 50 μL de DMEM num tubo de 1,5 mL. Incubar mídia mista 10 min à temperatura ambiente.
   2. Tome o prato com as células da incubadora. Substitua o meio de cultura por 1 mL de DMEM.
   3. Adicionar DNA/PEI mídia mista para as células gota a gota. Coloque as células de volta na incubadora.
   4. Incubar as células 3 h a 37 ° c e substitua a mídia mista DMEM DNA/PEI com 1 mL de meio de cultura.
   5. Incubar células transfectadas 24 h a 37 ° c antes dos experimentos de fotoestimulação.

3. ativação de ERK2 por fotoestimulação de Femtosecond laser

1. Gire sobre o laser do femtossegundo e assegure-se de que o obturador esteja fechado.
2. Gire sobre o microscópio confocal da laser-exploração e abra o software do microscópio. Ajuste o laser da excitação em 488 nanômetro. Definir o nível de potência de 488 nm laser em 0,1 mW. Defina o tamanho da imagem como 512 x 512 pixels. Defina o tempo de intervalo de cada pixel como 2,4 μs. Defina o intervalo de tempo entre dois quadros em 6 s para minimizar o fotobranqueamento e fotodanos nas células. Conjunto de quadros de imagem total em torno de 300 quadros para fornecer ~ 30 min microscopia contínua em um experimento individual.
   Nota: O intervalo de dois quadros adjacentes, quadros de imagem total e tempo de imagem de microscopia contínua pode ser ajustado de acordo com as necessidades experimentais. Se um experimento individual durar mais de 2 h, por favor, defina o sistema de incubação CO₂ (mostrado na Figura 4) para microscópio como presente na etapa 3,3 para fornecer o ambiente de 5% co₂ e 37 ° c para manter a viabilidade celular. Se um experimento individual é limitado dentro de 2 h, o sistema de incubação CO₂ não é necessário.
3. Gire sobre o sistema da incubação do CO₂ , gire sobre todo o calefator e ajuste a temperatura de trabalho em 37 ° c. Aguarde até que a temperatura sobe para 37 ° c e concentração de CO₂ até 5%. Coloque o estágio da incubadora no estágio do microscópio como mostrado na figura 4a.
4. Prepare células HeLa transfected com ERK2-GFP conforme descrito na etapa 2.
   Nota: Em um experimento individual, o esquema stim-A ou stim-B é aplicado para entregar fotoestimulação às células. A etapa 3,5 e 3,6 apresentam etapas detalhadas stim-A e stim-B respectivamente.
5. Entregando A estimulação do laser do femtossegundo em pilhas do alvo usando o modo de stim-A
   Nota: Antes do procedimento de fotoestimulação, assegure-se de que o diâmetro do foco é de cerca de 2 μm. Esse processo é descrito na etapa 3.5.1 e 3.5.2.
   1. Tome o prato que contem as pilhas transfected com ERK2-GFP da incubadora e põr o prato sobre o estágio do microscópio.
   2. Inicie o modo de digitalização rápida através do software de funcionamento do microscópio. Sintonize o objetivo de adquirir imagens fluorescentes claras das células. Pare a digitalização rápida. Mude para o modo de imagem de campo brilhante pela Câmara CCD (Figura 2a). Abra o obturador e ajuste a distância entre duas lentes do telescópio do relé para assegurar o diâmetro do foco do laser do femtossegundo para ser ~ 2 μm (Figura 2b). Feche o obturador para completar o ajuste.
      Nota: Uma seta de referência pode ser rotulada para indicar o foco do laser (Figura 2). Entretanto, uma seta de referência também pode ser definida no centro da janela de imagem fluorescente para indicar a posição do foco do laser femtossegundo.
   3. Defina o poder do laser femtossegundo em 15-40 MW (810 nm, 65 FS, 80 MHz), ou 20-60 MW (1040 nm, 120 FS, 50 MHz) na amostra. Definir o tempo de abertura do obturador em 0,05-0,2 s.
   4. Use o modo de digitalização rápida para selecionar uma célula de destino bem expressa ERK2-GFP.
   5. Mova o estágio para localizar a área do citosol da célula alvo selecionada no centro do FOV imagens de campo brilhante da câmera CCD (Figura 2a).
   6. Clique na parte inferior inicial para iniciar o progresso da imagem de microscopia contínua.
   7. Abra o obturador em qualquer slot de tempo pré-definido para entregar a estimulação do laser femtossegundo projetada na etapa 3.5.3 na célula alvo.
      Nota: (1) a fotoestimulação pode ser realizada a qualquer momento na seqüência de microscopia confocal controlada pelo obturador. (2) a fotoestimulação pode ser entregue por várias vezes na mesma posição durante a sequência de microscopia confocal.
   8. Aguarde até que o processo de imagem seja concluído. Salve os dados de imagem para análise de dados adicionais.
6. Entregando a estimulação do laser do femtossegundo em pilhas do alvo usando o modo de stim-B
   1. Defina o poder do laser femtossegundo em 15-40 MW (810 nm), 20-60 MW (1040 nm) na amostra.
   2. Tome o prato contendo células transfected com ERK2-GFP da incubadora e colocá-lo na fase de microscópio.
   3. Use o modo de digitalização rápida para selecionar uma célula de destino bem expressa ERK2-GFP.
   4. Defina o processo de imagem confocal como etapa 3,2. Defina um quadro de digitalização especial como o quadro de estimulação no processo de imagem. Defina o parâmetro do quadro de simulação.
      1. Defina uma região de digitalização (2 x 2-3 x 3 μm²) na área do citosol próxima ao núcleo na célula alvo.
      2. Ajuste o tempo total da exploração em 0.1-0.2 s. Sincronize o obturador do laser do femtossegundo com a exploração confocal de acordo com a área predefinida da fotoestimulação, que é aberta somente quando a exploração do laser cai no quadro da estimulação e fecha-se imediatamente quando Sai.
         Nota: (1) a região do photostimulaion pode ser ajustada a todo o tamanho. (2) a fotoestimulação pode ser realizada em qualquer slot de tempo predefinido na sequência de microscopia confocal. (3) a fotoestimulação pode ser realizada por várias vezes nas mesmas ou diferentes áreas pré-definidas no FOV nessa seqüência de microscopia confocal.
   5. Clique na parte inferior inicial para iniciar o progresso da imagem de microscopia contínua.
   6. Aguarde até que o processo de imagem seja concluído. Salve os dados de imagem para análise de dados adicionais.
7. Desligue o laser femtossegundo e o microscópio confocal após o experimento.

4. ativação de eIF4E (substrato de ERK) por Femtosecond simulação a laser

1. Preparação da pilha de Hela
   1. Seguir os passos 2.1.1-2.1.5.
   2. Semente ~ 20.000 células em uma placa de Petri com grades de localização de células (Figura 3B) para localizar as células fotoestimuladas. Adicione meio de cultura até 1 mL.
   3. Coloque o prato com as células de volta na incubadora. Incubar as células 24 h a 37 ° c antes do tratamento com laser femtossegundo.
2. Gire sobre o laser do femtossegundo e assegure-se de que o obturador esteja fechado.
3. Gire sobre o microscópio confocal da laser-exploração e abra o software do microscópio.
4. Prepare o sistema de incubação CO₂ como declaração na etapa 3,3.
5. Entregando A estimulação do laser do femtossegundo em pilhas do alvo usando o modo de stim-A
   1. Defina o poder do laser femtossegundo em 15-40 MW (810 nm), 20-60 MW (1.040 nm) na amostra. Definir o tempo de abertura do obturador em 0,05-0,2 s.
   2. Tome o prato com as células da incubadora e montá-lo na incubadora CO₂ no estágio do microscópio.
   3. Mova o objetivo na direção vertical para localizar o plano de imagem imagens de campo brilhante da câmera CCD. Mova o estágio de amostra na direção horizontal para garantir que nenhuma célula localiza no centro do FOV. Abra o obturador e ajuste a distância entre duas lentes do telescópio do relé para assegurar o diâmetro do foco do laser do femtossegundo em ~ 2 μm. Feche o obturador para completar o ajuste.
   4. Mova o estágio do microscópio para selecionar aleatoriamente 5 ~ 10 grades. Pode ser indicada e localizada pelas grades na parte inferior dos pratos de Petri a imagem latente do brilhante-campo da câmera do CCD. Marque/Registre as coordenadas das grades selecionadas no prato.
   5. Estimular todas as células localizadas nas grades selecionadas uma a uma manualmente imagem de campo brilhante da câmera CCD.
6. Coloque o prato de volta na incubadora. Incubar as células 24 h a 37 ° c antes da microscopia de imunofluorescência. Desligue o laser femtossegundo e o microscópio confocal após o procedimento do photostimualtion.
7. Microscopia de imunofluorescência de eIF4E fosforilada em células com fotoestimulação para confirmação da ativação de ERK
   1. Tome o prato que contem pilhas com tratamento da fotoestimulação na etapa 4,5 fora da incubadora. Remova o meio de cultura. Lave as células com PBS uma vez. Remover PBS.
   2. Adicionar 1 mL de paraformaldeído a 5% (4 ° c) no prato. Fixar as células com 5% paraformaldeído por 10 min. Retire o tampão paraformaldeído. Lave as células com PBS por 5 min duas vezes. Remover PBS.
   3. Adicionar 1 mL de 0,5% Triton X-100 no prato. Incubar as células 15 min à temperatura ambiente. Remova o buffer Triton X-100. Lave as células com PBS por 5 min duas vezes. Remover PBS.
   4. Adicione 1 mL de tampão de BSA de 1% no prato. Incubar as células 30 min à temperatura ambiente. Remova o buffer de BSA.
   5. Diluir o anticorpo eIF4E (fósforo S209) em 1 mL de PBS com 1% de BSA para uma concentração final de 1 μg/mL. Adicione o buffer no prato. Incubar as células para 10-12 h a 4 ° c. Remova o buffer.
   6. Lave as células com PBS por 5 min duas vezes. Remover PBS.
   7. Diluir o anticorpo secundário anti-Rabbit IgG H & L em 1 mL de PBS com 1% de BSA para uma concentração final de 2 μg/mL. Adicione o buffer no prato. Incubar as células 2 h à temperatura ambiente. Remova o buffer.
   8. Lave as células com PBS. Remover PBS.
   9. Adicione 1 mL de PBS no prato.
   10. Gire sobre o microscópio confocal da exploração do laser. Abra o software do microscópio. Ajuste o laser da excitação em 488 nanômetro. Definir o nível de potência de 488 nm laser em 0,1 mW. Defina o tamanho da imagem como 512 x 512 pixels. Defina o tempo de intervalo de cada pixel como 2,4 μs.
   11. Coloque o prato com células de coloração imunofluorescentes no estágio do microscópio. Localize as caixas selecionadas imagem de campo brilhante da câmera CCD.
   12. Iniciar a digitalização confocal de um único quadro. Guarde as imagens fluorescentes das células de fotoestimulação.
   13. Mova o palco aleatoriamente para localizar áreas sem estimulação a laser femtossegundo. Iniciar a digitalização confocal de um único quadro. Excepto as imagens fluorescentes de nenhumas pilhas da estimulação como dados do controle.
8. Desligue o microscópio confocal após o experimento.

5. ativação de Mitofcílios e outros eventos mitocondrial por fotoestimulação

Nota: Para observar a dinâmica morfológica mitocondrial, as células de Hela são transfectadas com mito-GFP na etapa 5,1 para indicar fluorescentamente as mitocôndrias. Para observar mitofcílios, as células de Hela são transfectadas com MT-cpYFP na etapa 5,1.

1. Prepare células HeLa transfected com mito-GFP ou MT-cpYFP seguinte passo 2.
2. Gire sobre o laser do femtossegundo e assegure-se de que o obturador esteja fechado.
3. Gire sobre o microscópio confocal da laser-exploração. Ajuste o laser da excitação em 488 nanômetro. Definir o nível de potência de 488 nm laser em 0,1 mW. Defina o tamanho da imagem como 512 x 512 pixels. Defina o tempo total de imagem de cada quadro como 2,2 s. defina o intervalo de tempo entre dois quadros em 0 s. definir quadros de imagem total como 200 quadros para fornecer ~ 440 s microscopia contínua em um experimento individual.
   Nota: O intervalo de dois quadros adjacentes, quadros de imagem total e tempo de imagem de microscopia contínua pode ser ajustado de acordo com as necessidades experimentais.
4. Prepare o sistema de incubação CO₂ conforme descrito na etapa 3,3, se necessário.
5. Entregando a estimulação do laser do femtossegundo na mitocódrion do alvo usando o modo de stim-a
   1. Tome o prato contendo células transfected com mito-GFP ou MT-cpYFP da incubadora e colocar o prato na fase de microscópio.
   2. Verifique o estado do laser femtossegundo como passo 3.5.2. Assegure-se de que o foco do laser do femtossegundo esteja localizado no centro do FOV. Defina uma seta de referência no centro da janela de imagem fluorescente para indicar a posição do foco.
   3. Defina o poder do laser femtossegundo em 5-30 MW (810 nm), 10-40 MW (1040 nm) na amostra. Definir o tempo de abertura do obturador em 0,05-0,1 s.
   4. Use o modo de digitalização rápida para selecionar uma célula alvo bem expressa mito-GFP ou MT-cpYFP.
   5. Selecione uma mitocrodrion aleatoriamente na célula alvo como o assunto experimental. Mova o estágio do microscópio a fim localizar a estrutura tubular mitochondrial do alvo no centro de FOV (indique pela seta da referência) pelo modo de exploração rápido.
   6. Clique na parte inferior inicial para iniciar o progresso da imagem de microscopia contínua.
   7. Abra o obturador em todo o tempo Pre-defined para entregar a estimulação do laser do femtossegundo projetada na etapa 5.5.3 na estrutura tubular mitochondrial do alvo.
      Nota: (1) a exposição do laser do femtossegundo na estrutura tubular mitochondrial pode ser controlada pelo obturador a qualquer hora durante a microscopia confocal. (2) realize somente uma exposição do femtossegundo-laser em um experimento porque uma estimulação do laser do femtossegundo pode perturbar o status mitochondrial durante um longo período.
   8. Aguarde até que o processo de imagem seja concluído. Salve os dados de imagem para análise de dados adicionais.
6. Desligue o laser femtossegundo e o microscópio confocal após o experimento.

6. oscilação do potencial de membrana mitocondrial em mitocôndria alvo em células de Hela pela estimulação do laser de Femtosecond

1. Prepare as células HeLa seguindo os passos 2.1.1-2.1.6.
2. Incubar as células por 24 h a 37 ° c antes do experimento.
3. Prepare a solução de coloração TMRM: diluir o TMRM em 1 mL de DMEM com 10% de FBS para uma concentração final de 100 nM.
4. Tome o prato com as células preparadas na etapa 5.2.1 e 5.2.2 fora da incubadora. Remova o meio de cultura. Adicione a solução de coloração TMRM preparada na etapa 6,3 no prato. Mancha por 15-20 min a 37 ° c na incubadora. Retire a solução de coloração. Lave as células com PBS uma vez. Adicione 1 mL de meio de cultura no prato.
5. Gire sobre o laser do femtossegundo e assegure-se de que o obturador esteja fechado.
6. Gire sobre o microscópio confocal da laser-exploração. Abra o software do microscópio. Ajuste o laser da excitação em 532 nanômetro. Definir o nível de potência de 532 nm laser em 0,1 mW. Definir o tamanho da imagem como 512 x 512 pixels e tempo de geração de quadros em 2,2 s. defina o intervalo de tempo entre dois quadros em 0 s. definir quadros de imagem total como 200 quadros para fornecer ~ 440 s microscopia contínua em um experimento individual.
   Nota: O intervalo de dois quadros adjacentes, quadros de imagem total e tempo de imagem de microscopia contínua pode ser ajustado de acordo com as necessidades experimentais.
7. Prepare o sistema de incubação CO₂ descrito na etapa 3,3, se necessário.
8. Use o modo stim-a para entregar a estimulação do laser femtossegundo na mitocódrion alvo. Siga os passos 5.5.1-5.5.8 para concluir o experimento.
   Nota: Na etapa 6,8, selecione uma mitocrodrion que está bem manchada com TMRM como a mitocrídrion alvo.
9. Desligue o laser femtossegundo e o microscópio confocal após o experimento.

7. alterações de Bax e citocromo C na mitocôndria alvo em células de Hela por estimulação a laser Femtosecond

Nota: Neste experimento, sementes das células em placas de Petri com grades de localização celular (Figura 3B) para localizar a célula que é tratada pelo laser femtossegundo. Manchar as células com tmrm para localizar as mitocódrias que é selecionado para ser estimulado pelo laser femtossegundo.

1. Prepare as células HeLa em uma placa de Petri com grades de localização de células (Figura 3B), conforme descrito na etapa 4,1.
2. Manchar as células com TMRM conforme descrito nas etapas 6,3 e 6,4.
3. Gire sobre o laser do femtossegundo e assegure-se de que o obturador esteja fechado.
4. Gire sobre o microscópio confocal da laser-exploração. Abra o software do microscópio. Ajuste o laser da excitação em 532 nanômetro. Definir o nível de potência de 532 nm laser em 0,1 mW. Definir o tamanho da imagem como 512 x 512 pixels e tempo de geração de quadros em 2,2 s. defina o intervalo de tempo entre dois quadros em 0 s. definir quadros de imagem total como 50 quadros para fornecer ~ 110 s microscopia contínua em um experimento individual.
5. Entregando a estimulação do laser do femtossegundo na mitocódrion do alvo usando o modo de stim-a
   1. Defina o poder do laser femtossegundo em 5-30 MW (810 nm), 10-40 MW (1040 nm) na amostra. Definir o tempo de abertura do obturador em 0,05-0,1 s.
   2. Tome o prato que contem as pilhas manchadas com da incubadora e põr o prato sobre o estágio do microscópio.
   3. Use o modo de digitalização rápida para selecionar a célula de destino que está bem manchada com TMRM.
   4. Mova o estágio a fim localizar a estrutura tubular mitochondrial do alvo no centro de FOV usando a modalidade rápida da exploração. Marque a coordenada da grade que a célula selecionada está localizada em imagens de campo brilhante.
   5. Clique na parte inferior inicial para iniciar o progresso da imagem de microscopia contínua.
   6. Abra o obturador em todo o tempo Pre-defined do progresso da imagem latente da microscopia manualmente para entregar a estimulação do laser do femtossegundo projetada na etapa 7.5.1 na estrutura tubular mitochondrial do alvo.
   7. Aguarde até que o processo de imagem seja concluído. Marque a mitocódria selecionada que é simulada pelo laser femtossegundo. Salve os dados de imagem para análise de dados adicionais.
   8. Desligue o laser femtossegundo e o microscópio confocal após o experimento. Prepare a microscopia da imunofluorescência de Bax ou de citocromo C nas pilhas da experimentação.
6. Microscopia de imunofluorescência de Bax ou citocromo C no femtossegundo laser mitocrídrion tratada.
   1. Tome o prato do estágio do microscópio.
   2. A coloração imunofluorescente completa de Bax ou citocromo C segue as etapas 4.7.1-4.7.9.
      Nota: Use anti-Bax ou anti-citocromo C em vez de anti-eIF4E na etapa 4.7.5 para terminar a coloração imunofluorescente de Bax ou citocromo C na etapa 7.6.2.
   3. Gire sobre o microscópio confocal da laser-exploração e abra o software do microscópio. Ajuste o laser da excitação em 488 nanômetro e em 532 nanômetro. Definir o nível de potência de 488 nm e 532 nm laser em 0,1 mW. Definir tamanho de imagem como 512 x 512 pixels e tempo de geração de quadros em 2,2 s.
   4. Coloque o prato com células de coloração imunofluorescentes no estágio do microscópio. Localize a grade selecionada imagem de campo brilhante da câmera CCD. Localize a célula que é tratada pelo laser femtossegundo.
   5. Iniciar a digitalização confocal de um único quadro. Localize a mitocrídria que é estimulada pelo laser femtossegundo. Guarde o quadro fluorescente da célula de fotoestimulação para uma análise mais aprofundada dos dados.
7. Desligue o microscópio confocal após o experimento.

Resultados

A fotoestimulação pode ser realizada simultaneamente juntamente com a microscopia de varredura confocal contínua. A fotoestimulação pode começar em qualquer slot de tempo pré-definido na sequência de microscopia confocal de lapso temporal. A microscopia confocal pode monitorar moléculas celulares pela imagem latente fluorescente. As respostas moleculares à fotoestimulação e outras dinâmicas podem ser identificadas desta forma. Teoricamente, se ERK for ativado, será o movimen...

Discussão

Nós demonstramos uma estratégia da fotoestimulação combinando um laser do femtossegundo com um sistema confocal do microscópio da exploração do laser. A fotoestimulação pode funcionar diretamente como uma microscopia do dois-fotão definindo stim-B conformemente. Nós fornecemos um protocolo detalhado para utilizar um flash curto do laser do femtossegundo para provocar a sinalização de ERK ou os mitofcílios em pilhas do alvo. Os diferentes modos de estimulação podem ser realizados de acordo com diferentes f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus
Femtosecond laser	Fianium
CO2 incubation system	Olympus	MIU-IBC
Petri dish	NEST	801002
Petri dish with imprinted grid	Ibidi	81148
ERK-GFP	addgene	37145	A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP			A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP	Invitrogen	C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM)	Invitrogen	T668	Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Aldrich	9002-98-6	Dilute in PBS
Paraformaldehyde	Solarbio	P8430	Dilute in PBS
Triton X-100	Solarbio	T8200	Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Dilute in PBS
Tween20	Sigma-Aldrich	9005-64-5
anti-eIF4E antibody	abcam	ab76256
anti-Bax antibody	abcam	ab53154
anti-cytochrome C antibody	abcam	ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488)	abcam	ab150077