Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.

Resumo

O núcleo geniculado lateral é a primeira estação de retransmissão para a informação visual. Os neurônios do relé deste núcleo thalamic integram a entrada das pilhas retinal do gânglio e projetam-na ao córtice visual. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem excitação de cima para baixo do córtex. As duas principais entradas excitatórias para os neurônios de retransmissão diferem em vários aspectos. Cada neurônio do relé recebe a entrada de somente algumas sinapses retinogeniculate, que são grandes terminais com muitos locais da liberação. Isto é refletido pela excitação comparativamente forte, os neurônios do relé recebem, das pilhas retinal do gânglio. As sinapses corticogeniculate, ao contrário, são mais simples com poucos locais da liberação e uma força sináptica mais fraca. As duas sinapses também diferem em sua plasticidade sináptica de curto prazo. As sinapses retinogeniculate têm uma probabilidade elevada da liberação e apresentam conseqüentemente uma depressão a curto prazo. Ao contrário, as sinapses corticogeniculate têm uma baixa probabilidade da liberação. As fibras corticogeniculate atravessam os núcleos thalamic reticular antes de incorporar o núcleo geniculado lateral. Os diferentes locais do núcleo talâmico reticular (rostrally do núcleo geniculado lateral) e do trato óptico (ventro-lateralmente do núcleo geniculado lateral) permitem estimular as sinapses corticogeniculados ou retinogeniculados separadamente com eletrodos de estimulação extracelular. Isto faz o núcleo geniculado lateral uma área ideal do cérebro onde duas sinapses excitatórios com propriedades muito diferentes que colide no mesmo tipo da pilha, podem ser estudadas simultaneamente. Aqui, nós descrevemos um método para investigar a gravação dos neurônios do relé e para executar a análise detalhada da função retinogeniculate e corticogeniculate do sinapse em fatias agudas do cérebro. O artigo contém um protocolo passo-a-passo para a geração de fatias cerebrais agudas do núcleo geniculado lateral e etapas para a atividade de gravação de neurônios de retransmissão, estimulando o trato óptico e as fibras corticogeniculate separadamente.

Introdução

Os neurônios do relé do núcleo geniculado lateral integram e retransmitem a informação visual ao córtice visual. Esses neurônios recebem entrada excitatória de células ganglionares via sinapses retinogeniculadas, que fornecem a principal unidade excitatória para os neurônios de retransmissão. Além, os neurônios do relé recebem entradas excitatórios dos neurônios corticais através das sinapses corticogeniculate. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem entradas inibitórias de interneurônios locais e neurônios gabaérgicos do núcleo Livedo reticular thalami¹. O núcleo Livedo reticular thalami está presente como um escudo entre o tálamo e o córtex de tal forma que as fibras que projetam do córtex para o tálamo e no sentido oposto devem atravessar o núcleo Livedo reticular thalami².

As entradas de retinogeniculate e as entradas do corticogeniculate exibem propriedades sinápticasdistintas^3,4,^5,6,7,8. As entradas do retinogeniculate formam grandes terminais com os locais múltiplos da liberação^9,10. Em contrapartida, os insumos corticogeniculados exibem pequenos terminais com locais de liberação única⁷. Além disso, as sinapses retinogeniculate impulsionam eficientemente potenciais de ação de neurônios de retransmissão, apesar de constituírem apenas 5 − 10% de todas as sinapses nos neurônios de retransmissão^3,8,11. As sinapses corticogeniculate, por outro lado, servem como um modulador de transmissões retinogeniculate controlando o potencial de membrana de neurônios de relé^12,13.

Estas duas principais entradas excitatórias para retransmissão de neurônios também são funcionalmente diferentes. Uma diferença proeminente é a depressão de curto prazo das sinapses retinogeniculate e a facilitação a curto prazo de sinapses corticogeniculate^3,5,8. A plasticidade de curto prazo refere-se a um fenômeno em que a força sináptica muda quando a sinapse é repetidamente ativa dentro de um período de tempo de poucos milissegundos a vários segundos. A probabilidade de liberação sináptica é um fator importante subjacente à plasticidade de curto prazo. As sinapses, com uma baixa probabilidade de liberação inicial, exibem a facilitação a curto prazo devido ao acúmulo de CA^{2 +} na pré-síntese e, consequentemente, um aumento na probabilidade de liberação é observado após a atividade repetida. Em contraste, as sinapses com alta probabilidade de liberação geralmente exibem depressão de curto prazo devido à depleção de vesículas prontas-liberáveis¹⁴. Além disso, a dessensibilização dos receptores pós-sinápticos contribui para a plasticidade de curto prazo em algumas sinapses de alta probabilidade de liberação^8,15. A probabilidade da liberação elevada e a dessensibilização de receptores do ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) contribuem à depressão a curto prazo proeminente de sinapses retinogeniculate. Por outro lado, a probabilidade de baixa liberação está subjacente à facilitação de curto prazo de sinapses corticogeniculados.

Em camundongos, o trato óptico entra no núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) do local caudolateral, enquanto as fibras corticogeniculate entram no dLGN rostroventrally. A distância entre as duas entradas permite a investigação das propriedades individuais de duas entradas excitatórios muito diferentes que colide na mesma pilha. Aqui, nós construímos sobre e melhoramos um método previamente descrito da dissecção em que as fibras do retinogeniculate e do corticogeniculate são preservadas em fatias agudas do cérebro³. Nós, então, descrevemos a investigação electrofisiológica de neurônios do relé e a estimulação de fibras retinogeniculate e corticogeniculate com os elétrodos extracelular da estimulação. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para o enchimento de neurônios do relé com biocytin e a análise anatômica subseqüente.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo painel governamental de supervisão em experimentos com animais da Renânia-Palatinado.

1. soluções

1. Solução de dissecção
   1. Para reduzir a excitotoxicidade, prepare uma solução à base de colina para ser usado durante a dissecção como apresentado aqui (em mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 cloreto de colina, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂po₄, 0,5 CAcl₂, 7 MgCl_2, e ₂₅ de glicose. Prepare a solução de dissecção menos de 1 semana antes do experimento.
2. Solução de gravação
   1. Prepare uma solução de fluido espinhal cerebral artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO4, 2,5 KCl, 2 CAcl₂, 1 MgCl₂e 25 glicose. Adicione 50 μM D-APV e 10 μM SR 95531 Hydrobromide para bloquear receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) e GABA_a , respectivamente.
3. Solução intracelular
   1. Prepare uma solução intracelular contendo (em mM): 35 cs-gluconato, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA e 0,1 D-600 (cloridrato de metoxiverapamil). Ajuste o pH a 7,3 com CsOH. Filtre, aliquot, e armazene a solução de estoque em-20 ° c até o uso.

2. dissecção

1. Prepare duas câmaras de corte, das quais uma é preenchida com 100 mL da solução de dissecção e a outra com 100 mL de solução de gravação. Coloc os dois copos em um banho de água (° c 37) e borbulhe as soluções com o Carbogen por pelo menos 15 minutos antes da dissecção.
2. Encha uma taça de plástico com 250 mL de solução de dissecção gelada (mas não congelada) próxima. Bolha com Carbogen pelo menos 15 min antes do uso.
3. Encha um prato de Petri plástico (100 milímetros x 20 milímetros), em que a dissecção do cérebro será executada, com a solução fria da dissecção. Coloque um pedaço de papel de filtro na tampa do prato de Petri.
4. Esfrie a câmara de dissecção do vibratome.
5. Anestesie um rato com 2,5% de isoflurano, por exemplo, na gaiola do rato. Assim que o mouse não responde a uma pitada de cauda, decapitar o mouse perto da medula cervical e mergulhar a cabeça na solução de dissecção gelada na base do prato de Petri.
6. Corte a pele da cabeça do caudal ao nasal e mantenha-a lateralmente com os dedos para expor o crânio. Para tirar o forebrain, primeiro corte o crânio junto com a linha média posterior-anterior e, em seguida, corte mais duas vezes através da sutura coronal e sutura lambdóide (Figura 1a).
7. Retire o crânio entre a sutura coronal e a sutura lambdóide, de forma que o encéfalo esteja exposto. Corte o bulbo olfativo e separe o prosencéfalo do midbrain com uma lâmina fina (Figura 1b). Retire o cérebro do crânio com uma espátula fina e coloque-o sobre o papel de filtro na tampa do prato de Petri.
   Nota: as etapas 2,6 e 2,7 devem ser executadas o mais rápido possível para reduzir a morte celular.
8. Para preservar a integridade das entradas sensoriais e corticais ao dLGN na fatia do cérebro, separe os dois hemisférios com um corte parasagittal com um ângulo de 3 − 5 ° (Figura 1C,D). Seque os planos mediolateral dos dois hemisférios colocando-os no papel de filtro e cole-os no estágio de corte com um ângulo de 10 − 25 ° do plano horizontal (Figura 1e).
9. Coloque o palco no centro da bandeja de tampão de metal e despeje suavemente o resto da solução de dissecção gelada na bandeja de buffer. Execute esta etapa com cuidado desde que um derramar forte pôde remover o cérebro colado (Figura 1F).
10. Coloque a bandeja de tampão na bandeja cheia de gelo, o que ajuda a manter a temperatura baixa durante a dissecção. Cortar 250 μm fatias com uma lâmina de barbear a uma velocidade de 0,1 mm/s e uma amplitude de 1 mm.
11. Manter as fatias na câmara de retenção preenchidas com solução de dissecção oxigenada a 34 ° c durante cerca de 30 min e, em seguida, permitir que as fatias se recuperem na solução de gravação a 34 ° c por mais 30 min.
12. Após a recuperação, retire a câmara de retenção da fatia do banho de água e mantenha as fatias à temperatura ambiente (RT) até serem utilizadas em experimentos.

3. eletrofisiologia

1. Puxe pipetas utilizando capilares de vidro de borosilicato e um extrator de filamento. Manter a resistência das pipetas de gravação a 3 − 4 MΩ. Puxe as pipetas estimulantes utilizando o mesmo protocolo, mas quebre a ponta ligeiramente depois de puxar para aumentar o diâmetro. Encha as pipetas de gravação com a solução intracelular e a biocitina, enquanto preenche as pipetas estimulantes com a solução de gravação.
2. Coloque as fatias na câmara de gravação e perfuse continuamente as fatias com a solução de gravação oxigenada em RT. Verifique todas as fatias e selecione aquelas que exibem um trato óptico intacto.
3. Visualize a fatia e as pilhas com um microscópio ereto equipado com a microscopia de vídeo infravermelha do contraste da interferência diferencial (IR-DIC).
   Nota: os neurônios de retransmissão são diferenciados dos interneurônios por seu tamanho maior de soma e mais dendritos primários (ramos emergentes do soma). Os interneurônios exibem a morfologia bipolar com um soma menor.
4. Coloque a pipeta estimulante sobre a fatia antes de remendar a célula com a pipeta de gravação. Para investigar sinapses retinogeniculate, coloc a pipeta de estimulação diretamente no intervalo ótico, onde as fibras do AXON das pilhas retinal do gânglio são empacotadas (Figura 2a). Para analisar as sinapses corticogeniculados, coloque o eletrodo estimulante no núcleo Livedo reticular thalami, que é rostroventrally adjacente ao dlgn (Figura 2b).
5. Uma vez que a pipeta de gravação é imersa na solução de gravação, aplique uma etapa de tensão de 5 mV para monitorar a resistência da pipeta. Defina o potencial de retenção para 0 mV e cancele o potencial de deslocamento para que a corrente de retenção seja de 0 pA.
6. Aproxime a pilha com a pipeta da gravação ao aplicar a pressão positiva. Quando a pipeta está em contato direto com a membrana celular, liberar a pressão positiva, e definir o potencial de retenção para-70 mV. Aplique uma ligeira pressão negativa para permitir que a membrana celular se encaixe na pipeta de vidro de forma que um selo do forme (resistência > 1 gω). Compensar a capacitância da pipeta e abrir a célula por aplicação de pulsos de pressão negativa.
7. Para investigar a função sináptica, aplique 0,1 MS pulsos atuais (ca. 30 μA) através da pipeta de estimulação. Se não forem observadas Respostas sinápticas, as pipetas estimulantes poderão ter de ser substituídas. Tenha cuidado durante a colocação das pipetas estimulantes para uma posição diferente, de tal forma que a célula gravada não é perdida.
   Nota: nas gravações de exemplo mostradas na Figura 2, a plasticidade de curto prazo sináptica foi investigada estimulando o trato óptico ou as fibras corticogeniculadas duas vezes com intervalos interestímulos de 30 ms. A relação de pulso pareado (PPR) foi calculada dividindo-se a amplitude da segunda corrente pós-sináptica excitatória (EPSC) pela primeira EPSC (EPSC₂/EPSC₁). Cada protocolo de estimulação foi repetido 20 vezes. A amplitude da EPSC foi medida a partir das correntes médias das 20 varreduras. O intervalo de tempo entre cada repetição foi de pelo menos 5 s para evitar a plasticidade de curto prazo induzida pelas repetições.
8. Monitore a resistência da série continuamente aplicando um passo de tensão de 5 mV. Use somente as pilhas com a resistência da série menor de 20 MΩ para a análise.

4. rotulagem do biocytin

1. Manter a configuração de células inteiras por pelo menos 5 min para permitir a difusão de biocitina nos dendritos distais.
2. Após a gravação, retire suavemente a pipeta da célula para que o soma não seja destruído.
   Observação: se mais de uma célula é gravada em uma fatia, seus somas devem ser suficientemente longe de suas células vizinhas. Certifique-se de que os dendritos de células diferentes não interferem uns com os outros durante a imagem.
3. Prepare uma placa da cultura da pilha de 24 poços. Encha cada poço com 300 μL de paraformaldeído a 4% (PFA). Tome cuidado para não contaminar qualquer coisa com PFA que estará em contato com as fatias a serem gravadas.
4. Transfira as fatias da câmara de gravação para a placa contendo PFA com uma pipeta de borracha e fixe as fatias durante a noite. Certifique-se de que a pipeta está sempre impedida de contaminação por PFA.
   PRECAUÇÃO: Use sempre luvas e utilize um capuz químico ao manipular o PFA.
5. Após a fixação de fatias durante a noite na PFA, substitua a PFA por solução salina com tampão fosfato (PBS). Armazene as fatias em PBS a 4 ° c para processamento futuro (menos de 2 semanas).
6. Lave as fatias com PBS fresco 3 vezes (10 min cada lavagem).
7. Bloqueie sítios de ligação não específicos incubando as fatias na solução de bloqueio (0,2% de surfactante não iônico e 5% de albumina sérica bovina em PBS) por 2 h em RT em um agitador orbital.
8. Descarte a solução de bloqueio. Incubar as fatias com streptavidin-Alexa 568 diluída na solução de bloqueio (1:1000) a 4 ° c durante a noite em um agitador orbital.
9. Descarte a solução de anticorpos e lave as fatias 3 vezes com PBS por 10 min em RT em um agitador orbital. Lave as fatias com água da torneira antes de montar.
10. Coloque as fatias de um mouse em um slide de vidro. Assegure-se de que as células manchadas estejam presentes na superfície superior das fatias. Absorva a água ao redor das fatias com os tecidos e, em seguida, deixe as fatias para secar por aproximadamente 15 min.
11. Aplique duas gotas de meio de montagem em cada fatia. Monte uma lamínula no slide sem produzir bolhas de ar.
12. Guarde as fatias rotuladas a 4 ° c após a visualização com um microscópio confocal.

5. imagem latente e reconstrução celulares

1. Escaneie fatias com um microscópio confocal e use o software associado para a análise.
2. Excitar a fluorescência a 561 nm.
3. Imagem das fatias com 0,7 de abertura numérica (NA), objetivo de imersão em óleo.
4. Ajuste a célula de destino no meio da exibição e aplique uma ampliação de 2,5 vezes.
5. Renderize os conjuntos de dados z-Stack para digitalizar todo o neurônio com os seguintes parâmetros: Format = 2.550 x 2.550 pixels, Scan Frequency = 400 Hz, Z Number = 40. VOXEL tamanho foi em torno de 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
6. Semi-rastrear automaticamente os neurônios usando um software de reconstrução neuronal (por exemplo, NeuronStudio). Um exemplo de um neurônio de retransmissão rastreado em 3D é mostrado na Figura 3B.

Resultados

A preparação da fatia de dLGN contendo as vias retinogeniculada e corticogeniculado é mostrada um objetivo de 4x (Figura 2). Os axônios das células ganglionares retinianas agrupam-se no trato óptico (Figura 2). A pipeta estimulante foi colocada no trato óptico para induzir a corrente mediada por sinapse retinogeniculado (Figura 2a) e no núcleo Livedo reticular thalami para induzir a corrente ...

Discussão

Nós descrevemos um protocolo melhorado baseado em um método previamente publicado³, que permita a investigação da probabilidade elevada de sinapses retinogeniculate da liberação e da baixa probabilidade de sinapses corticogeniculate da liberação da mesma fatia. Isto é de grande importância uma vez que estas duas entradas interagem entre si para modular a transmissão do sinal visual: as entradas de retinogeniculate são a movimentação excitatórios principal de neurônios do relé, vis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261-250MG
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
choline chloride	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	Self-prepared		Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG	methoxyverapamil hydrochloride
D-APV	Biotrend	BN0085-100	NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
Forene	Abbvie	2594.00.00	isoflurane
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
High Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
Micromanipulators	Luigs & Neumann	SM7
Miroscope	Olympus	BX51
mounting medium	ThermoFisher Scientific	P36930	Prolong Gold Invitrogen
NaCl	ROTH	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
Pipette	Hilgenberg	1807502
Puller	Sutter	P-1000
razor blade	Personna	60-0138
Semiautomatic Vibratome	Leica  Biosystems	VT1200S
SR 95531 hydrobromide	Biotrend	AOB5680-10	GABAA-receptor antagonist