Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Resumo

O protocolo descreve o uso de miografia de arame para avaliar a tensão isométrica transmural de artérias mesentéricas isoladas de camundongos, com especial consideração da modulação por fatores liberados das células endoteliais e dos tecidos adiposos perivasculares.

Resumo

A responsividade do tônus vascular alterada aos estímulos fisiopatológicos contribui para o desenvolvimento de uma ampla gama de doenças cardiovasculares e metabólicas. A disfunção endotelial representa um grande culpado para a redução da vasodilatação e aumento da vasoconstrição das artérias. Tecidos adiposo (gordura) que cercam as artérias desempenham papéis importantes na regulação do relaxamento dependente do endotélio e/ou contração das células musculares lisas vasculares. As conversações cruzadas entre o endotélio e os tecidos adiposos perivasculares podem ser avaliadas ex vivo usando vasos sanguíneos montados por um sistema de miografia de arame. No entanto, devem ser estabelecidas definições ideais para as artérias derivadas de animais de diferentes espécies, idades, origens genéticas e/ou condições fisiopatológicas.

Introdução

As dilatações e constrições das artérias são alcançadas por relaxações e contrações, respectivamente, de suas células musculares lisas vasculares. As alterações na responsividade vascular das pequenas artérias contribuem para a regulação homeostática da pressão arterial por nervos autonômicos e hormônios presentes no sangue (por exemplo, catecolaminas, angiotensina II, serotonina, vasopressina). No nível local, as respostas vasculares das células musculares lisas são moduladas por sinais de ambas as células endoteliais da íntima e do tecido adiposo em torno das artérias (Figura 1).

O endotélio não é apenas uma barreira passiva, mas também serve como uma superfície para trocar sinais entre o sangue e as células musculares lisas vasculares subjacentes. Ao liberar várias substâncias vasoativas, o endotélio desempenha um papel crítico no controle local das respostas do tônus vascular¹. Por exemplo, em resposta à acetilcolina, o óxido nítrico sintase endotelial (Enos) é ativado no endotélio para produzir óxido nítrico (no), o que induz o relaxamento do músculo liso vascular subjacente ativando a guanil ciclase solúvel (SGC) ². outras substâncias vasoativas incluem os produtos de ciclooxigenases (por exemplo, prostaciclina e tromboxano a₂), lipoxigenase (por exemplo, ácidos 12-hidroxieticosatetraenoico, 12-Hete) e monooxigenases do citocromo P450 (hetes e ácidos epoxyeicosatrienoic, Eets), espécies reativas do oxigênio (ROS), e peptídeos vasoativas (por exemplo, endothelin-1 e angiotensina II), e fatores hiperpolarizante derivados do endothelium (edhf)³. Um delicado equilíbrio entre vasodilatadores derivados do endotélio e vasoconstritores mantém o Tom vasomotores local^4,5.

A disfunção endotelial caracteriza-se pelo comprometimento da vasodilatação endotélio-dependente⁶, uma marca registrada do envelhecimento vascular⁷. Com a idade, a capacidade do endotélio de promover vasodilatação é progressivamente reduzida, devido em grande parte à diminuição da biodisponibilidade do no, bem como à expressão e função anormais de eNOS no endotélio e no sGC nas células musculares lisas vasculares^{8 , 9} anos de ^{, 10}. a redução da BIODISPONIBILIDADE não potenciou a produção de vasoconstritores dependentes do endotélio^11,12. Nas artérias envelhecidas, a disfunção endotelial provoca hiperplasia nos meios de comunicação, como refletido pelos aumentos acentuados da espessura da parede, número de núcleos medial, que lembram o espessamento arterial na hipertensão e aterosclerose observada em humanos pacientes^13,14. Além disso, condições fisiopatológicas como obesidade, diabetes ou hipertensão aceleram o desenvolvimento da disfunção endotelial^15,16.

O tecido adiposo perivascular (PVAT) libera numerosas adipocinas para regular a estrutura vascular e a função¹⁷. O efeito anticontrátil do pvat é mediado por fatores relaxantes, como a adiponectina, não, o peróxido de hidrogênio e o sulfeto de hidrogênio^18,19,20. No entanto, dependendo da localização e da condição fisiopatológica, o PVAT também pode aprimorar as respostas contráctil em várias artérias²¹. As substâncias pró-contrátil produzidas pelo pvat incluem a angiotensina II, a leptina, a resistina e as Ros^22,23.  Na maioria dos estudos sobre vasos sanguíneos isolados, o PVAT tem sido considerado como um simples suporte estrutural para a vasculatura e, assim, removido durante a preparação dos segmentos de anel de vasos sanguíneos. Uma vez que a disfunção adiposa representa um fator de risco independente para hipertensão e complicações cardiovasculares associadas²⁴, o pvat em torno dos vasos sanguíneos deve ser considerado ao investigar a responsividade vascular de diferentes artérias.

Os sistemas de múltiplos fios miográficos têm sido amplamente utilizados para investigar as funções vasomotoras de uma variedade de vasos sanguíneos, incluindo as artérias aorta, mesentérica, renal, femoral, cerebral e coronária^25,26. Os protocolos aqui descritos utilizarão a miografia de arame para avaliar a responsividade vascular em artérias mesentéricas isoladas de modelos de camundongo geneticamente modificados, com foco especial na modulação por PVAT.

Protocolo

Todos os animais utilizados para o estudo a seguir foram fornecidos pela unidade de laboratório de animais da faculdade de medicina da Universidade de Hong Kong. A aprovação ética foi obtida do Comitê departamental de uso de animais de laboratório para ensino e pesquisa (CULATR, no.: 4085-16).

1. os preparativos

1. Preparação de fármacos
   1. Armazene os medicamentos apropriadamente conforme indicado na ficha de dados de segurança de material (MSDS) imediatamente após recebê-los. Dissolver as drogas em pó em forma de solventes como soluções de alta concentração de ações e, em seguida, alíquota para armazenamento a-20 ° c.
      Nota: a maioria das drogas são dissolvidas em água destilada para preparar as soluções de ações; aquecimento ou sonication pode ser necessário para algumas drogas. Se as drogas não se dissolverem completamente na água, uma gota de NaOH de 1 M pode ser adicionada, quando para drogas básicas uma gota do HCl de 1 M puder ser usada. As drogas hidrofóbicas podem ser dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) ou etanol absoluto. Nos últimos casos, a concentração final do banho (em M) deve ser sabida e os controles apropriados devem ser executados para governar para fora os efeitos dos solventes.
   2. Antes do experimento, dissolva as alíquotas de medicamentos (tabela de materiais) na solução de bicarbonato de Krebs-Ringer (Krebs) contendo 115 mm de nacl, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CAcl₂, 1,17 mm mgso₄, 1,17 mm KH₂po₄, 25 mm NaHCO_3, 11,1 mm D-glicose e 0, 1 mm EDTA, pH 7,4.
   3. Para as curvas de concentração-resposta acumuladas, prepare as ações e soluções de trabalho de diferentes fármacos por diluições seriais (tabela 1).
2. Configurando o instrumento
   1. Calibrar o transdutor de força para todos os canais antes de usar o sistema miográfico em cada dia, ou cada vez que o sistema foi movido.
      Nota: o procedimento de calibração detalhado varia consoante o modelo. Em geral, um peso de dois gramas é aplicado às mandíbulas e a força correspondente deve 9,81 ± 0,1 mN. Se a leitura estiver desligada por mais de 0,1 mN, o transdutor deve ser re-calibrado. Para o sistema utilizado no presente protocolo (ver a tabela de materiais) os valores operacionais para o transdutor de força durante a calibração devem estar entre 3000 e 3500. Se o valor do transdutor for maior ou menor, o transdutor de força deve ser substituído.
   2. Ajuste e alinhe os suportes de montagem em cada câmara. O uso contínuo e repetido da câmara do miógrafo pode causar algum desalinhamento do apoio da montagem, que precisa o ajuste ocasional antes dos experimentos para assegurar-se de que as maxilas estejam alinhadas corretamente.
      Nota: é necessária uma atenção especial ao ajustar os suportes de montagem, pois os transdutores de força são muito sensíveis e frágeis.
   3. Ligue os aquecedores e o gás (95% O₂ e 5% co₂) pelo menos 30 minutos antes do experimento para permitir que as câmaras e os amortecedores sejam aquecidos até 37 ± 0,1 ° c e equilibrados com a mistura de gás.
      1. Verifique a temperatura do termómetro para garantir a exactidão do aquecedor. A temperatura pode ser modificada para executar experimentos de resfriamento ou aquecimento. Se a temperatura não estiver correcta como definido, aplique a função offset da máquina para aumentar ou diminuir as definições para atingir a temperatura desejada.
   4. No final do experimento, limpe todas as câmaras e desligue o aquecedor, bem como o gás que corre para a instalação.
      1. Não desligue o gás antes de todo o líquido na câmara ter sido sugado para fora do sistema, caso contrário, o ácido/água destilada pode regurgitar e chegar ao órgão-câmara durante a próxima utilização.
      2. Para limpar as câmaras do myograph do fio, a maneira a mais eficaz é executar o ácido-lavagem usando uma solução diluída do ácido acético. Limpe a borda e o interior das câmaras com um cotonete de algodão.
      3. Após a lavagem, enxague cuidadosamente as câmaras com água destilada. Limpe o exterior das câmaras com um pano molhado para remover o sal seco. O etanol também pode ser usado se drogas hidrofóbicas tiverem sido usadas durante o experimento.
      4. Um exemplo do procedimento de lavagem é o seguinte. Encha as câmaras com uma solução de ácido acético a 8% e incubar durante 2 min. Use um aplicador com ponta de algodão para limpar mecanicamente a superfície da câmara de aço. Evite qualquer contato com a parte de alumínio do miografo.
      5. Aspirar o ácido acético e lavar a câmara miográfica e suporta várias vezes com água destilada e secar as superfícies usando papel absorvente ou aplicadores de ponta de algodão.
3. Dissecção dos anéis arteriais mesentéricos
   Nota: os animais utilizados para o estudo atual foram dieta de alto teor de gordura alimentados com camundongos Adipo-SIRT1 masculinos e littermates tipo selvagem como controles. Cada animal pesava aproximadamente 45 g no momento dos experimentos.
   1. Eutanizar o rato por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg).
   2. Com tesouras cirúrgicas e fórceps, realize uma laparotomia mid-line para revelar os índices abdominais.
   3. Colete a arcada mesentérica em um prato de Petri revestido de silício.
   4. Espalhe e fixe a rede mesentérica na placa de Petri para revelar a ramificação do mesenteria e da malha do tecido conjuntivo.
   5. um microscópio (10x), e com multa-tesouras e fórceps, dissecam com cuidado os tecidos conexivos circunvizinhos. Evite danificar a camada adventícia. Alternativamente, o tecido adiposo circundante pode ser mantido ao redor do vaso sanguíneo para experimento (se necessário).
   6. Usando as tesouras finas e fórceps, extirpar os ramos secundários das artérias mesentéricas no gelo-frio Krebs tampão.
      Nota: cada pesquisador deve ter seu próprio conjunto de kit de dissecção, cordas e estribos. Estas ferramentas devem ser mantidas corretamente e limpas-up cada vez após o experimento como algumas drogas são difíceis de lavar afastado e resíduos podem furar a eles.
      1. Mantenha os vasos sanguíneos no tampão frio de Krebs ao separar os tecidos conexivos circunvizinhos, incluindo PVAT. Durante o manuseio do vaso sanguíneo, seja gentil para evitar danos desnecessários ao endotélio.
      2. Se o experimento envolver o estudo do PVAT, mantenha uma esfera de 1,5 a 2 mm de diâmetro do PVAT ao redor do vaso sanguíneo. Alternativamente, as mesmas quantidades de tecidos adiposos podem ser adicionadas em cada câmara para o experimento.
   7. Opcional Retire o endotélio do vaso sanguíneo dissecado como controle para avaliar a dependência do endotélio das respostas. Para as artérias mesentéricas, retire o endotélio suavemente rolando-o sobre um estribo de arame ou um cabelo.
   8. Corte o vaso sanguíneo preparado como acima em pequenos anéis (~ 2 mm de comprimento) e colocá-los em um prato de plástico cheio de aerado (95% O₂ e 5% co₂) Krebs buffer para posterior montagem nas câmaras de um fio miografo²⁷.
   9. Transfira os anéis da embarcação em uma câmara do miógrafo coloc o microscópio. Os anéis devem ser coloc uniformente, com os estribos superiores e mais baixos paralelos. O fio de fixação (40 μm) deve ser recém-preparado, pois as drogas podem se vincular às cordas.
   10. Rosqueie o anel do vaso sanguíneo em um comprimento apropriado (2 cm) do fio e fixe-o a uma maxila da câmara de montagem parafusando para fixar a posição.
   11. Passe um segundo fio através do anel e escora para a mandíbula oposta.
   12. Com os anéis rosqueados e fixados às maxilas da câmara, monte a câmara na instalação do miógrafo e gire o parafuso do micrômetro no sentido horário para mover os fios perto de se até que a leitura da força na relação de usuário que corresponde à câmara montada seja zero ou apenas Abaixo.
       Nota: o fio anexado à mandíbula superior deve ser de comprimento mínimo para garantir que a tensão pode ser totalmente transada para o detector.
   13. Equilibrar as preparações a 37 ° c durante pelo menos 30 minutos antes da primeira aplicação da força utilizando o micrômetro regulável.
   14. Avaliar a viabilidade tecidual em 115 mM de potássio elevado (NaCl substituído por KCl em uma base molar) Krebs contendo 4,6 mm NaCl, 115 mm KCl, 2,5 mm cacl₂, 1,17 mM MGSO₄, 1,17 mm KH₂po₄, 25 mm NaHCO₃ e 11,1 mM D-glicose a pH 7,4.
       Nota: vasos isolados são considerados viáveis se a força contrátil transposta e registrada como deflexão acima da linha de base no software de registro de dados do sistema miográfico for superior a 40% do seu tom de repouso, em resposta a um agente contrátil. Se a artéria não contrair apropriadamente, então a pressão basal óptima da tensão/parede não foi ajustada corretamente ou a artéria pode ter sido danificada durante a isolação ou a montagem da embarcação.
   15. Opcional Avalie a integridade das células endoteliais aplicando a fenilefrina para induzir a contração do vaso a 50% da resposta inicial à KCl (conforme registrado pelo transdutor de força no software de gravação de dados), seguido pela adição de 1 μM de acetilcolina.
       Nota: uma boa preparação dos vasos sanguíneos é crucial para obter resultados consistentes e precisos. Uma preparação não deve ser utilizada para o experimento, quer se o teste de integridade endotelial for insatisfatório ou não responde à KCl, indicando que a função endotelial ou a contratilidade vascular do músculo liso, respectivamente, não são satisfatórias. Neste caso, a preparação deve ser substituída por um novo anel do mesmo vaso sanguíneo ou um novo vaso sanguíneo.

2. normalização para determinar a tensão inicial ideal

Nota: o procedimento de normalização permite a determinação do diâmetro interno ideal (IC) das artérias em que o vaso sanguíneo experimenta uma pressão transmural de repouso adequada (100 mmHg ou 13,3 kPa para as artérias mesentéricas) e produz o máximo ativo forças em resposta a agentes vasoativos.

1. Ligue o computador e abra o software de gravação de dados (consulte a tabela de materiais).
2. Salve o experimento como um "arquivo de dados LabChart" com um novo nome para evitar sobrescrever o arquivo de configuração original.
3. Abra a janela de configurações de normalização e defina o fator k como 1. Aceite os valores padrão para a calibração ocular (0,3, se o comprimento do vaso for desconhecido, ou 1 se o comprimento do vaso for conhecido), pressão alvo (13,3), tempo de média online (2) e tempo de atraso (60). Clique em OK para salvar as configurações.
4. Selecione canais de interesse e insira o diâmetro do fio (40 μm), pontos de extremidade do tecido (a1:0; a2: comprimento do tecido conforme medido), leitura do micrômetro inicial na janela de normalização.
5. Inicie o procedimento de normalização aplicando o primeiro estiramento passivo ao vaso sanguíneo (gire o parafuso do micrômetro no sentido anti-horário).
6. Aguarde até que a embarcação se estabilize (3 min) e insira a nova leitura do micrômetro na janela de normalização. A tensão da parede é automaticamente calculada e mostrada como um ponto no gráfico.
   Nota: o micrômetro "passos" usado durante o trecho passivo não precisa ser o mesmo. Os primeiros trechos podem ser de 20 μm cada. À medida que os trechos se aproximam da linha Isobar, as etapas podem ser reduzidas para 10 μm, 5 μm, 2 μm ou até menores. Tenha a janela principal do gráfico aberta enquanto ajusta as configurações do micrômetro — se um grande pico que excede a linha Isobar em um gráfico de comprimento/tensão (que indica pontos de pressão correspondentes a um valor pré-determinado) aparecer, reduza a tensão.
7. Após cada estiramento passivo, substitua o controle Krebs por um Krebs de alto potássio ISO-osmótico contendo 115 mM de KCl. Quando a contração atinge um planalto (cerca de 3 min), registre a força ativa (F) subtraindo a força passiva em cada trecho da força ativada por potássio. Calcule a tensão da parede assim como os valores da circunferência interna (CI).
   1. Medir a tensão ativa como a deflexão acima da linha de base. A tensão ativa (T) é calculada com base na equação F (mN) = T (mN/mm) x 2 x comprimento do vaso (mm). Os valores da circunferência interna (IC) são calculados a partir dos dados do micrômetro (IC = 205,6 μm + 2 x "Gap").
8. Remova a condição elevada do potássio substituindo com Krebs frescos. Repita a lavagem por três vezes mais de 5 min.
9. Repita os passos 2,5 a 2,8 (induzindo trechos passivos seguidos de contração ativa em turnos alternados) até que a tensão ativa comece a diminuir (Figura 2).
10. Após múltiplas rodadas de trechos alternativos, as curvas de comprimento/tensão passiva dão o valor de IC100, a circunferência interna do vaso em uma pressão transmural de 100 mmHg, como o ponto de cruzamento com a linha Isobar.
    Nota: cada valor do micrômetro durante os trechos passivos é introduzido manualmente no módulo de normalizaçãode software. O programa registra automaticamente a medida de força correspondente para gerar a curva de comprimento/tensão passiva, que dá o valor de IC100 como o ponto de cruzamento com a linha Isobar (Figura 2, painéis direito). Quanto mais próximo o último ponto é a linha Isobar, mas logo acima da melhor normalização é sem danificar os vasos. Um ponto muito acima da linha Isobar pode danificar fisicamente a embarcação montada, causando resultados não confiáveis durante o experimento.
11. Crie as curvas de comprimento/tensão ativas para determinar os valores de IC1 e calcule o fator de normalização k como a proporção de IC1/IC100, que será usada para este tipo de vaso sanguíneo em experimentos de miografia subsequentes.
    Nota: as curvas de comprimento/tensão ativas são criadas traçando os valores de IC calculados a partir dos dados do micrômetro no eixo x e tensões ativas no eixo y. O IC1 é o valor deitado dentro da região de pico do Planalto (traços vermelhos na Figura 2, painéis direito). Depois de plotar as curvas de comprimento/tensão ativas e determinar IC1, o fator de normalização k é calculado como a proporção de IC1/IC100. Com base no fator de normalização k , o IC ideal para a linha de base, denotado como IC1, mostrará na curva de comprimento/tensão passiva. O ajuste do micrômetro para este IC aparece a curva e deve ser usado para ajustar o manual para experiências subseqüentes do miografia. A tensão inicial (T) é igual à pressão alvo (PI) x IC/2 π e a força ideal (F) aplicada à embarcação é igual a T x 2 x comprimento do vaso.
12. Lave completamente para fora os Krebs elevados do potássio e equilibram os preparativos para outro 30 a 45 min. redefinir as tensões basais para "zero" para que apenas as respostas contrátil ativo será gravado durante o experimento subseqüente.

3. contrações induzidas por fenilefrina

Nota: medicamentos que podem ser selecionados para induzir as respostas vasoconstritoras incluem a norepinefrina agonista inespecífica do adrenoceptores, a fenilefrina agonista α-1 adrenoceptora seletiva, a hormona peptídica angiotensina II e a monoamina neurotransmissor 5-hydroxytryptamine. A fenilefrina é utilizada no presente protocolo para exame (tabela de materiais).

1. Prepare e monte anéis arteriais emparelhados como descrito na seção 1,3, um com PVAT intacto e outro com PVAT removido, das seções adjacentes de cada artéria para o experimento.
2. Após a normalização (descrita na seção 2), pré-contrate os segmentos arteriais com tampão elevado de Krebs do potássio adicionando a solução de 115 milímetros KCl à câmara que contem Krebs.
3. Espere a contração ao platô (3 minutos), lave para fora o potássio elevado e substitua-o com o amortecedor aerado fresco de Krebs. Repita a lavagem três vezes ao longo de 5 min.
4. Repita a estimulação de KCl e lavando três vezes e registre a resposta/tensão contrátil máxima ao KCl subtraindo a tensão da linha de base da tensão devido à estimulação de KCl.
5. Após a última contração e lavagem, reabasteça a câmara com o amortecedor Krebs morno, ventilado e permita que a artéria recupere por aproximadamente 30 minutos antes de executar a tarefa seguinte.
6. Para cada câmara, adicione quantidades cumulativas de fenilefrina (incrementos de meio log de 10^- 10 a 10^-4 M) para induzir os aumentos dependentes da concentração na tensão isométrica das preparações quiescentes.
7. Comece adicionando uma baixa concentração do agonista à câmara. Depois de permitir tempo suficiente para uma contração estável (3 – 5 min), adicione a próxima concentração. Repita as etapas com concentrações crescentes de phenylefrina.
8. Depois de adicionar a última dose de agonista (Fenilefrina), lave a droga completamente e encher a câmara com tampão Krebs fresco. Traçar as respostas dependentes da concentração como porcentagens crescentes das contrações máximas induzidas por KCl (Figura 3).
9. Opcional Para avaliar a contribuição do NO, incubar as preparações com o inibidor de NO sintase, L-NAME (10^-4 M), por 30 min antes da adição de fenilefrina. O L-NAME aprimora as contrações induzidas por fenilefrina nas preparações quiescentes das artérias mesentéricas (Figura 4).
   Nota: os inibidores ou antagonistas devem ter tempo suficiente para atingir a equilibração, geralmente 30 – 45 min (ser consistente para qualquer conjunto de experimentos).
10. Para executar uma segunda curva de concentração-resposta sequencialmente, lave a câmara completamente e repetidamente para remover todos os agonistas precedentes, até que nenhuma mudança mais adicional no Tom esteja observada.
    Nota: a experimentação paralela expõe pelo menos dois anéis obtidos do mesmo vaso sanguíneo para o agonista, um condições de controle e um na presença do (s) inibidor (es); em cada anel, a curva de concentração-resposta será realizada apenas uma vez. É preferível realizar experimentos paralelos, uma vez que isso proporciona um melhor controle para a ação da droga e a sensibilidade dos vasos sanguíneos. Experimentos seriais obtêm uma curva de concentração-resposta a um agonista em um único anel; lavá-lo, alterando as condições experimentais (por exemplo, adicionando um inibidor) e, em seguida, repetindo a curva de resposta de concentração no mesmo anel. Neste caso, os controles de tempo são necessários para mostrar que as respostas da droga não são devidas a alterações do tecido ao longo do tempo. Nunca se pode ter certeza de que o tecido está exatamente no mesmo estado após a exposição a um experimento de concentração-resposta. Tempo suficiente (pelo menos 30 – 60 min) deve ser dado para permitir que os segmentos do navio para retornar à sua tensão de repouso (basal), embora em algum caso, isso pode não ocorrer imediatamente após a dissociação do agonista de alta afinidade dos receptores. Além disso, os Krebs de alto potássio podem ser aplicados entre as curvas de concentração-resposta acumuladas para reduzir a dessensibilização²⁸. Lembre-se que a maioria dos antagonistas não pode ser lavado completamente, assim, manter a adicioná-lo para o resto do experimento.

4. relaxações/contrações dependentes do endotélio

1. Pré-contrate um segmento arterial recém-montado (conforme descrito nas etapas 3,2 a 3,5). Mais uma vez, registre a resposta/tensão contrátil máxima ao KCl subtraindo a tensão da linha de base da tensão devido à estimulação de KCl.
2. Opcional Incubar as preparações com o inibidor de NO sintase, L-NAME (10^-4 M), por 30 min antes da adição de U46619.
3. Acrescente as concentrações pré-calculadas de U46619 à câmara e permita uma contração estável e sustentada dos segmentos arteriais.
   Nota: as respostas vasodilatadoras são induzidas em artérias mesentéricas pré-contratadas para cerca de 80% das respostas máximas a 115 mM KCl. os agonistas diferentes podem ser usados para induzir a contração pela ativação de seus receptores específicos. Aqui, os segmentos de vasos sanguíneos com ou sem PVAT são pré-contratados com U46619 (1 – 3 x 10^-8 M; Tabela de materiais), um agonista do receptor do tromboxano a2, para induzir as contrações estáveis e sustentadas do músculo liso.
4. Adicionar concentrações cumulativas de acetilcolina (10^- 10 a 10^-4 M) para a câmara de órgãos. As respostas vasodilatadoras dependentes da concentração dos segmentos arteriais são apresentadas como porcentagem de respostas contrátil induzidas por U46619 (Figura 5).
   Nota: para a maior parte do experimento, a próxima concentração do agonista relaxante deve ser adicionada imediatamente quando um planalto é observado para evitar a repercussão na tensão. As respostas vasodilatadoras dependentes da concentração dos segmentos arteriais são normalizadas como percentual de respostas contrátil induzidas por U46619 para ajustar para pequenas diferenças na inervação e diâmetro entre os segmentos arteriais (Figura 5). Pequenas variabilidades na responsividade entre os anéis individuais obtidos a partir do mesmo vaso sanguíneo tornam-se mínimas quando um grupo de seis ou mais experimentos são analisados estatisticamente. Ao expressar as respostas como uma porcentagem das contrações máximas do próprio tecido individual, é adequado usar uma análise pareada (por exemplo, teste t de Student pareado) para comparar as respostas do mesmo tipo de tecidos de diferentes animais para comparar respostas de um único tecido antes e depois de uma intervenção. Ao analisar os efeitos do PVAT, a ANOVA bidirecional é usada seguida pelo teste de múltiplas comparações.
5. Depois de adicionar a dose final do agonista relaxante, retire a droga de cada câmara e reabasteça com o tampão Krebs fresco. Lave a câmara cuidadosamente com o tampão Krebs e deixe a artéria estabilizar por pelo menos 45 min antes de realizar quaisquer experimentos adicionais.

Resultados

Exame das relações comprimento/tensão para obtenção do fator de normalização k

A quantidade de estiramento aplicada a um segmento do vaso influencia a extensão da interação da actina-miosina e, consequentemente, a força ativa máxima desenvolvida. Assim, para cada tipo de vaso sanguíneo, é necessário determinar a quantidade de estiramento necessária para a força ativa máxima para estudo...

Discussão

Aparte das pilhas endothelial, os sinais derivados do PVAT jogam um papel importante na regulação da reactividade do Tom de músculo liso³⁰. O pvat saudável libera o não e o Adiponectina anti-inflammatory para exercer um efeito anticontractile nas artérias, que é perdida circunstâncias patológicas tais como a obesidade e a síndrome metabólica^31,32. Nos Estados de doença, o pvat contribui para o desenvolvimento da disfunção end...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625	Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)	Sigma-Aldrich	N5751	Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126	Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)	Enzo	BML-PG023-0001	Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 wild type mice	Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong	CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes	Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
Surgical tools