Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Resumo

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Resumo

Métodos baseados em recombinação homóloga para modificar genes têm promovido significativamente a pesquisa biológica. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMMs) são um método rigoroso para estudar o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Nosso laboratório desenvolveu vários GEMMs de câncer de próstata (PCa) que não possuem expressão de um ou vários genes supressores de tumor usando o sistema de recombinase CRE-loxP específico do site e um promotor específico da próstata. Neste artigo, nós descrevemos nosso método para o necropsia destes gemms do PCA, focalizando primeiramente na dissecção de tumores da próstata do rato. Novos métodos desenvolvidos ao longo da última década facilitaram a cultura de células derivadas de epitelial para modelar sistemas de órgãos in vitro em três dimensões. Nós igualmente detalham um método da cultura da pilha 3D para gerar organóides do tumor dos gemms do PCA do rato. A pesquisa de câncer pré-clínico tem sido dominada pela cultura de células 2D e por modelos de xenoenxertos derivados de células derivadas ou derivadas de pacientes. Estes métodos não têm microambiente tumoral, uma limitação do uso dessas técnicas em estudos pré-clínicos. Os GEMMs são mais fisiologicamente relevantes para a compreensão da tumorigênese e progressão do câncer. A cultura organóide tumoral é um sistema modelo in vitro que recapitula a arquitetura tumoral e as características da linhagem celular. Além, os métodos da cultura da pilha 3D permitem o crescimento de pilhas normais para a comparação às culturas da pilha do tumor, raramente possível usando técnicas da cultura da pilha 2D. Em combinação, o uso de GEMMs e cultura de células 3D em estudos pré-clínicos tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da biologia do câncer.

Introdução

Desde o final da década de 1980, a capacidade de alterar genes por recombinação homóloga tem avançado muito o estudo dos sistemas biológicos¹. Os sistemas inducible, tissue-, ou Cell-specific do promotor e recombinases local-específicos, tais como CRE-loxp, têm estudos genéticos avançados facilitando o controle sobre modificações genéticas ambos temporally e espacialmente^2,3, a ⁴. A combinação dessas estratégias genéticas criou uma ampla gama de sistemas experimentais de modelos^5,6,7.

Modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) são uma ferramenta integral para avaliar como genes individuais ou grupos de genes afetam o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Na pesquisa pré-clínica de câncer, os GEMMs são o método mais rigoroso e fisiologicamente relevante para estudar o desenvolvimento, progressão e tratamento do câncer⁸. Nosso laboratório especializa-se em gerar e caracterizar GEMMs do cancro.

O câncer não-cutâneo mais altamente diagnosticado entre os homens nos Estados Unidos é o câncer de próstata (PCa). A maioria dos pacientes com PCa tem doença de baixo risco e alta probabilidade de sobrevida, mas as taxas de sobrevida diminuem drasticamente quando a doença é diagnosticada em estágios avançados ou se a terapia hormonal direcionada induz progressão a PCa agressivo, não curável subtipos^9,10. Nosso laboratório desenvolveu GEMMs que utilizam alelos floxed de um ou mais genes supressores de tumor. Recombinação e perda da expressão gênica do supressor tumoral ocorre especificamente na próstata porque introduzimos um transgene com CRE recombinase downstream do promotor probasin ativado apenas em células epiteliais da próstata^{11, 12}. We igualmente criaram nossos gemms para conter um transgene do repórter de CRE chamado MT/mg, que induz a expressão fluorescente da proteína do tomate nas pilhas que faltam CRE e a expressão fluorescente verde da proteína (GFP) nas pilhas com CRE¹³. Enquanto a apresentação deste método e nossos resultados representativos mostram GEMMs que estudamos em nosso laboratório, este protocolo pode ser usado para gerar organóides de câncer de próstata a partir de qualquer modelo de mouse. Entretanto, como discutido em detalhe em nossa seção representativa dos resultados, nós observamos que determinadas características do tumor são ideais para a geração do organoid do cancro de próstata.

Na última década, novos métodos de cultivo de células de tecidos de origem epitelial levaram a avanços significativos em nossa capacidade de modelar sistemas de órgãos in vitro^14,15. O termo "cultura de células 3D" tem sido atribuído às técnicas envolvidas no estabelecimento e manutenção de organóides, que podem ser geralmente definidos como estruturas feitas de células que montam a arquitetura secundária impulsionada por linhagem de células específicas de órgãos características¹⁶. Estes novos métodos são distintos da cultura de células 2D clássicas em que as pilhas não necessitam de transformação ou imortalização para o crescimento a longo prazo; assim, as culturas 3D de pilhas normais podem ser comparadas às pilhas doentes. Isto é particularmente valioso na pesquisa do cancro onde as culturas normais do controle de pilha não estiveram tipicamente disponíveis. Além disso, organóides espontaneamente formam arquiteturas secundárias de tecidos com tipos de células adequadamente diferenciados, tornando-os um sistema de melhor modelo para entender o câncer in vitro do que as linhas de células 2D¹⁷. Nosso laboratório criou linhas organóides 3D da questão tumoral isolada de nossos PCa GEMMs para complementar nossos dados in vivo e realizar experimentos que não seriam viáveis em GEMMs.

Neste artigo, nós apresentamos protocolos escritos e visuais para o necropsia completo de gemms do PCA, incluindo a dissecção de lóbulos distintos da próstata do rato e de Lesões metastáticas. Nós descrevemos e mostramos um método passo a passo para gerar organóides dos tumores da próstata do rato baseados em um protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organóides do tecido epithelial da próstata do rato normal¹⁸.

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Protocolo

Os procedimentos animais aqui descritos foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) no departamento de recursos de animais de laboratório, centro de câncer abrangente do Parque Roswell, Buffalo, Nova York.

Nota: Camundongos machos a serem dissecados para isolar proestados ou tumores de próstata para a geração de organóides devem ter pelo menos atingido a idade da maturidade sexual — cerca de 8-10 semanas de idade. Idades específicas de camundongos podem variar entre os estudos. Alguns fatores a considerar ao escolher a idade incluem mudanças dependentes da idade em populações da pilha da próstata, expressão idade-dependente de transgenes promotor-conduzidos específicos de CRE, e taxa de progressão do tumor da próstata em um GEMM particular.

1. dissecção e imagem latente do rato ProstateTumor e de tumores metastáticos

1. Preparações
   1. Obtenha as ferramentas de dissecção estéreis necessárias. Área da dissecção do estágio na superfície estéril limpa com uma régua de 15 cm, contrapeso da precisão, contrapeso analítico, frasco do pulverizador com etanol 70%, salino phospho-tamponado (PBS), e toalhas de papel.
   2. Preparação de soluções fixativas para órgãos e ossos viscerais que não devem ser utilizados para a geração organóide
      1. Para órgãos viscerais: Prepare 4% paraformaldeído (PFA) em PBS. Para um rato, fazer 20 mL de 4% PFA, alíquota em 2 15 mL tubos cônicos e manter à temperatura ambiente até o uso.
      2. Para ossos longos: alíquota 10 mL de formalina tamponada neutra pré-feita de 10% (NBF) em 1 15 mL de tubo cônico e manter à temperatura ambiente até o uso.
   3. Obtenha pratos não tratados de 10 cm e encha com PBS não estéril — estes servirão como recipientes temporários para órgãos durante a dissecção fina usando um microscópio de dissecção.
      Nota: Ferramentas estéreis são usadas para dissecação de tecidos para a geração de organóides. Ferramentas não estéreis são usadas para a incisão inicial e dissecção dos membros posteriores.
2. Eutanásia e incisão inicial
   1. Eutanizar o rato por CO₂ asfixia usando um 2,0 L/min taxa de fluxo para 5 min. Retire o rato da gaiola e realize a deslocação cervical. Use o equilíbrio de precisão para medir o peso corporal e o registro do mouse.
   2. Coloque o mouse sobre uma toalha de papel e Oriente sobre a superfície de dissecção ventral lado acima com a cabeça do mouse voltada para longe do investigador. Afixe o rato à placa esticando para fora seus membros e perfurando cada um dos patas dianteiras e patas traseiras com uma agulha descartável.
   3. Usando uma garrafa de spray, apagar a pele do mouse com 70% de etanol. Usando tesouras de dissecção não estéreis e fórceps reto, aperte logo acima do pênis do mouse e faça uma pequena incisão através da pele apenas.
   4. Continue a incisão Midline até o pescoço do mouse através da pele apenas. Faça incisões bilaterais a partir do ponto da incisão inicial através do plano ventral do mouse através da pele apenas.
   5. Segure a pele e puxe-a cuidadosamente para longe da pele do rato. Fixar a pele ao tabuleiro para permitir o acesso às cavidades abdominal e torácica.
3. Extração do sistema urogenital masculino en Bloc
   1. Usando tesouras estéreis da dissecção e fórceps reto, corte com cuidado através da pele aproximadamente 0,75 cm acima do recto. Continuar a incisão Midline até a caixa torácica sem perturbar quaisquer órgãos na cavidade abdominal. Retire cuidadosamente a pele e fixe-a na placa para expor toda a cavidade abdominal.
      Nota: Não permita que esses instrumentos toquem a parte externa do mouse ou qualquer superfície na área de preparo, pois esses tecidos serão usados para gerar organóides.
   2. Dissecar o sistema urogenital e outros órgãos de acordo com o diagrama na Figura 1a, com números indicando a ordem em que os órgãos serão removidos do mouse.
   3. Encontre a bexiga, em seguida, segure a almofada de gordura para a esquerda ou direita e puxe para cima para expor o testículo. Cuidadosamente dissecar o testículo do resto da região urogenital e colocar de lado. Faça o mesmo procedimento do outro lado.
      Nota: Conseguir a qualidade óptima do tecido e a caracterização detalhada do tumor de tumores da próstata exigem que a região urogenital inteira esteja removida do bloco¹⁹do en do rato. Recomenda-se que a região urogenital seja removida primeiro (Figura 1a).
   4. Segure a bexiga e puxe cuidadosamente para que a região urogenital levante em conjunto, expondo a uretra embaixo. Enquanto segurando a bexiga, orientar a tesoura para que eles estão contra a parte inferior da próstata dorsal e cortar a uretra. A região urogenital inteira liberará então da cavidade abdominal.
   5. Coloque a região urogenital em um prato de 10 cm preenchido com PBS. Se ainda estiver cheio de urina, drenar a bexiga fazendo uma pequena incisão. Usando o equilíbrio analítico, pesar o sistema urogenital e registro.
4. Extração de linfonodos pélvicos, baço, fígado, rim, pulmão, tíbia e fêmur
   1. A remoção do sistema urogenital expõe os linfonodos pélvicos, posicionados logo atrás do sistema urogenital (Figura 1a) e em ambos os lados da coluna vertebral. Os linfonodos só serão visíveis se contiverem Lesões metastáticas ou se houver inflamação local. Oriente o fórceps reto debaixo do nó de linfa e puxe-o acima para remover o nó de linfa. Faça o mesmo procedimento do outro lado.
   2. Segure o reto com o fórceps reto e corte. Puxe o reto para desvendar todo o cólon e intestino delgado, procurando lesões metastáticas nos linfonodos mesentéricos. Quando o íleo inteiro é removido, continue a puxar o duodeno para expor o estômago. Corte o esôfago para remover completamente o estômago e descartar. Se forem observadas lesões metastáticas nos linfonodos, dissecem-se cuidadosamente do intestino e armazenem-se em um prato de 10 cm de PBS.
   3. Expor e remover o estômago puxará o baço do lado dorsal do abdômen (Figura 1a). Retire o baço e coloque em 4% PFA. O baço serve como um controle de coloração para hemotoxylin como é altamente celular.
      Nota: Os tecidos viscerais que não devem ser utilizados para a geração organoide serão fixados durante a noite em 4% de PFA, lavados com PBS e, em seguida, colocados em etanol a 70%.
   4. Retire o fígado na parte superior do abdômen (Figura 1a). Baseado na carga metastática no fígado, os lóbulos individuais podem ser dissecados, ou o fígado inteiro pode ser removido cortando com cuidado ao longo do diafragma. (Não cortar através do diafragma neste momento). Coloque o fígado em um prato de 10 cm de PBS.
   5. A remoção do fígado irá expor totalmente os rins em ambos os lados da coluna vertebral (Figura 1a). Retire os rins — juntamente com os linfonodos renais, se os nódulos tiverem Lesões metastáticas — colocando a pinça reta embaixo do rim e puxando para cima. Faça o mesmo procedimento para o outro lado.
   6. Para expor a cavidade torácica, corte com cuidado o diafragma ao longo da nervgaiola. Perfurar o diafragma irá liberar a pressão negativa na cavidade torácica e expor o coração e os pulmões (Figura 1a).
   7. Segure o esterno e puxe para cima para abrir a cavidade torácica ainda mais. Observar a face ventral da cavidade torácica ao longo da costela para lesões metastáticas nos linfonodos torácicos e dissecar, se presente.
   8. Enquanto ainda segurando o esterno, cortar a caixa torácica ventral para acessar o coração e os pulmões. Segure o coração, puxe para cima e corte debaixo dos pulmões. Para remover completamente o coração e os pulmões en Bloc, corte todos os vasos sanguíneos anteriores e a traquéia. Coloque o tecido em PBS e Retire cuidadosamente o coração sem danificar o tecido pulmonar ou lesões pulmonares metastáticas.
   9. Tome o fórceps reto não-estéril e tesouras de dissecação e corte a perna traseira na cabeça do fêmur. Segure cuidadosamente o fêmur e retire a perna traseira da pele.
   10. Coloque a perna traseira em uma toalha de papel e segure a pata traseira. Use a lâmina de navalha única borda para sucata/cortar todos os músculos e tecido conjuntivo da tíbia e do fêmur. Retire o fêmur da tíbia cortando o posterior à patela e retire a tíbia removendo a pata traseira. Coloque a tíbia e o fêmur em 10% NBF. Faça o mesmo procedimento do outro lado.
       Nota: Para as finalidades de examinar os ossos longos do rato para lesões metastáticas, a fíbula não precisa de estar intacta. Os ossos longos serão fixados em 10% NBF por uma semana, então descalcificados usando solução neutra de EDTA²⁰. Após três semanas, os ossos serão transferidos para 70% de etanol.
   11. Depois de remover os membros posteriores, tome um corte de orelha ou cauda para genotipagem futura. Descarte a carcaça do mouse e todo o tecido que não deve ser fixado ou usado para a geração organóide.
5. Dissecção do tumor da próstata
   Nota: A dissecção de lobos da próstata do rato pode somente ser conseguida usando um microscópio de dissecação¹⁹. Entretanto, a carga do tumor da próstata pode ser tão elevada que os lóbulos individuais não podem ser distinguidos, e a dissecção pode ser realizada sem um microscópio. Não obstante, o protocolo completo para a dissecção de lóbulos individuais da próstata é descrito abaixo.
   1. Coloc a região urogenital em um prato de 10 cm de PBS um microscópio de dissecação e Oriente o lado ventral acima com a bexiga e as vesículas seminais que enfrentam afastado do investigador. Toda a manipulação da região urogenital deve ser feita usando instrumentos estéreis.
   2. Avalie o phenotype geral do tumor da próstata-mais provável, um tumor líquido-enchido ou contínuo será observado em PCa GEMMs (Figura 2a, B).
      Nota: Os tumores cheios de fluidos estão frequentemente localizados na região anterior da próstata (Figura 2a). Os tumores cheios fluidos são compo do tecido primeiramente conexivo com componentes epithelial escasso-assim estes tumores não são ideais para a geração organoid por causa do baixo número de pilhas epithelial do tumor, como será discutido nos resultados representativos Seção.
   3. Se os tumores cheios de fluido estão presentes, picar um pequeno buraco no tumor. Coloque a região urogenital em um novo prato de 10 cm de PBS.
   4. Pegue um par de fórceps reto na mão não dominante e fórceps curvo na mão dominante. Vire a região urogenital para a sua face dorsal. Procure a região proximal da próstata (Figura 1B), que pode ser identificada pela cor rosa/vermelha da uretra. Segure a uretra e segure firme para manipular o tecido urogenital com o fórceps curvo.
      Nota: Durante a dissecção da próstata, sempre tome nota da localização da bexiga, pois esta é a maneira mais simples de localizar os lóbulos de próstata individuais (Figura 1B).
6. Remoção de tecido não prostático da região urogenital
   1. Ainda na face dorsal da região urogenital, encontrar a base da vesícula seminal. Retire cuidadosamente a vesícula seminal e descarte. Realize o mesmo procedimento no lado oposto.
      Nota: Evite perfurar o vesicle seminal, como aquele liberará o líquido secretora pegajoso e opaco que interfere com a dissecção da próstata. Se a vesícula seminal for puncionada, transfira a região urogenital remanescente para um novo prato de 10 cm com PBS fresco.
   2. Remover e descartar o ducto deferente e tanto gorduroso e tecido conjuntivo possível usando o lado curvo do fórceps.
   3. Enquanto ainda segurando firmemente a uretra/região proximal da próstata, use um par de tesouras finas e pontiagudas para remover a bexiga da uretra.
7. Isolação de lóbulos individuais da próstata
   1. Localize a próstata anterior (Figura 1B). Assegure-se de prender firmemente a região proximal da próstata/uretra com o fórceps reto. Retire a região anterior da próstata, agarrando diretamente o tecido com o lado curvo do fórceps e puxando-o firmemente para longe da bexiga e do resto da próstata. Coloque o tecido em PBS.
      Nota: Para todas as regiões prostáticas, podem ser necessárias tesouras de dissecação para remover o tecido, dependendo do tamanho do tumor.
   2. Localize a região ventral da próstata (Figura 1B). Remova a região ventral da próstata da mesma maneira que na etapa 1.5.7.
   3. Neste ponto da dissecção, apenas as regiões da próstata lateral e dorsal devem estar presentes, enquanto a região proximal da próstata ainda está sendo apreendido pelo fórceps reto. Avaliar as regiões da próstata lateral e dorsal (Figura 1B). Se a região lateral pode ser distinguida da região dorsal, retire a região da próstata lateral, conforme descrito na etapa 1.5.7. Faça o mesmo procedimento no lado oposto.
   4. Retire a região dorsal da próstata, conforme descrito no passo 1.5.7. Coloc a região proximal da próstata em 4% PFA, porque sua estrutura dentro do tecido muscular da uretra fá-la inadequada para a geração organoid.

2. geração de organóides 3D do tecido do tumor da próstata

Nota: A Figura 3 mostra uma descrição pictórica do procedimento para a geração de organóides tumorais.

1. Preparação
   1. Prepare os meios organóides da próstata do rato de acordo com Drost et al.¹⁸ com as seguintes alterações. Use meio condicionado em vez de proteínas recombinantes para Noggin e R-Spondin e use uma concentração final de 1% (v/v), em vez de 10%, tanto para Noggin-e R-Spondin-condicionado médio.
      Nota: HEK293 células estavelmente transfected com HA-mouse Noggin-FC ou HA-mouse Rspo1-FC são usados para produzir Noggin-ou R-Spondin-condicionado médio, respectivamente. Estas linhas celulares foram um presente do laboratório Calvin Kuo na Universidade de Stanford.
   2. Prepare a solução da digestão em um tubo de 15 ml diluindo a colagenase II de 20 mg/ml com meios avançados de DMEM/F12 (+ + +) a uma concentração final de 5 mg/ml. Adicionar Y-27632 inibidor da rocha à solução de colagenase II numa concentração final de 10 μm.
      Nota: A proporção de tampão de digestão para tecido é de 1 mL a 50 mg, que utilizamos de acordo com Drost et al.¹⁸.
2. Mincing e digestão do tecido do tumor
   1. Na capa da cultura da pilha, coloque o tecido do tumor da próstata em um prato de cultura estéril de 10 cm, dissecar e descartar o tecido necrótico.
   2. Mince o tecido restante do tumor da próstata em 1 milímetro³ cubos prendendo as partes do tecido com o fórceps curvado estéril e cortando com tesouras da dissecção.
   3. Coloc as partes trituradas do tumor no tubo de 15 mL com o amortecedor da digestão escavando os acima com o lado curvado do fórceps. Digerir o tecido tumoral a 37 ° c com agitação para 1,5 a 2 h. verificar o progresso da digestão a cada 20 min.
      Nota: Neste momento, tirar pelo menos 2 mL de matriz de-20 ° c de armazenamento e descongelar no gelo. 1 mL de alíquotas de matriz levará aproximadamente 3 h para descongelar.
   4. Após a digestão do tecido, tubo de centrífuga em 175 x g para 5 min a 4 ° c para formar um pellet celular.
   5. Retire o sobrenadante, movimente o tubo para afrouxar o pellet celular, e ressuscitam o pellet celular em 1 mL de pré-aquecido tripsina suplementado com 10 μM Y-27632 rocha inibidor. Coloque o tubo em um banho de água de 37 ° c por 5 min.
   6. Após a incubação, pipeta para cima e para baixo 5 vezes com uma ponta padrão de P1000. Retorne o tubo ao banho de água de 37 ° c para um outro minuto 5 e repita a etapa 2.2.6.
      Nota: Neste momento no procedimento, aqueça um prato estéril da cultura da pilha de 6 poços põr o em uma incubadora de 55 ° c.
3. Contagem de células e ressuspensão em matriz
   1. Lave as células adicionando 9 mL de frio AdDMEM/F12 (+ + +) e Centrifugue o tubo a 175 x g por 5 min a 4 ° c.
   2. Após a centrifugação, retire o sobrenadante, movimente o tubo para soltar o pellet e lave as células novamente adicionando 10 mL de AdDMEM/F12 a frio (+ + +). Centrifugue o tubo a 175 x g durante 5 min a 4 ° c.
   3. Após a centrifugação, retire o sobrenadante, deslize o tubo para afrouxar o pellet, ressuscitem as células em 1 ml de ADDMEM/F12 (+ + +), e contar o número de células usando um hemocitômetro de acordo com o procedimento padrão.
   4. As domos de sete a oito cabem em um poço de um prato de 6 poços quando os organóides são chapeados na matriz através de uma forma gota-sábia. Aproximadamente 200 μL de matriz produzirá 7-8 domos. Decidir quantos poços de organóides são necessários para fins experimentais futuros e calcular o volume de matriz necessária. Em seguida, calcule o volume de solução contendo células necessária para ter uma concentração final de 1,0 x 10⁶ células/ml de matriz.
   5. Depois de contar as células, centrifugue a 175 x g durante 5 min a 4 ° c. Retire o sobrenadante, mexa o tubo para afrouxar o pellet, e ressuscitam as células em volume de matriz calculada na etapa 2.3.4.
      Nota: A matriz permanece na forma líquida apenas a 4 ° c; manter tubos de matrizes e soluções de células-matriz no gelo em todos os momentos.
4. Cúpulas da matriz do chapeamento e aplicação dos meios
   1. Misture a solução da matriz-pilha com um Pipet P200 distribuir uniformente as pilhas sem introduzir bolhas. Retire o prato de cultura de 6 poços da incubadora de 55 ° c.
   2. Cuidadosamente pipeta 200 μL de solução de célula matriz e rapidamente soltar a solução em um poço para criar domos.
   3. Repita o passo 2.4.2. até que o volume da solução da matriz-pilha esteja gasto. Permita que as abóbadas se solidifique à temperatura ambiente durante 2 min.
   4. Vire o prato de 6 poços de cabeça para baixo e coloque o prato em uma incubadora de 37 ° c para continuar a solidificação por 20 min.
   5. Após a incubação, adicione 2 mL de mídia organoide da próstata do mouse a cada poço. Adicione o andrógeno sintético R1881 a cada poço para uma concentração final de 1 nM e o inibidor da rocha Y-27632 a uma concentração final de 10 μM. Misture cuidadosamente e coloque a placa numa incubadora de 37 ° c para cultivo.
      Nota: A mídia de cultura organóide precisa ser suplementada com 10 μM de inibidor de rocha Y-27632 por apenas 1 semana após a geração de organóides.

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Resultados

As imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar líquido-enchido da próstata na região anterior da próstata são mostradas na Figura 2a. Ao contrário, Figura 2B, mostra imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar contínuo da próstata para que as regiões individuais da próstata sejam indistinguíveis. As imagens de dissecção fluorescente mostram o mesm...

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Discussão

Etapas críticas dentro do protocolo para a dissecção do tumor da próstata e a geração organoid
A remoção do tecido da não-próstata e a dissecção fina do tumor da próstata do rato são cruciais para a geração óptima de organóides do cancro desde que as pilhas epithelial da não-próstata e as pilhas epithelial normais da próstata gerarão organóides. Para tumores de próstata sólidos especificamente, é crucial isolar áreas de tumor viável para remover a contaminação com tecido ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles	Becton Dickinson	Z192430
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
Analytical balance	Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Dissecting Board	Thermo-Fisher	36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10	Manufactured by Trevigen	Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory	Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutamine (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetyl-L-Cysteine	Sigma	A9165
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Precision balance	Mettler Toledo	30216561
Scalpel #23	World Precision Instruments	504176
Scalpel Handle #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Single-edge carbon razor blade	Fisherbrand	12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight	World Precision Instruments	14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated	World Precision Instruments	15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (Rock Inhibitor)	APExBIO	A3008