Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

Resumo

Experimentos de Microarray de ligação proteica (PBM) combinados com ensaios bioquímicos ligam as propriedades vinculativas e catalíticas da primase do DNA, uma enzima que sintetiza os primers de RNA no DNA do modelo. Este método, designado como o perfilamento do primase da elevado-taxa de transferência (HTPP), pode ser usado para revelar testes padrões DNA-Binding de uma variedade de enzimas.

Resumo

O primase do ADN sintetiza os primers curtos do RNA que iniciam a síntese do ADN de fragmentos de Okazaki na costa retardamento pela polimerase do ADN durante a replicação do ADN. A ligação de procarióticas dnaG-como primases ao ADN ocorre em uma seqüência específica do reconhecimento do trinucleotide. É um passo crucial na formação de fragmentos de Okazaki. As ferramentas bioquímicas convencionais que são usadas para determinar a seqüência do reconhecimento do ADN do primase do ADN fornecem somente a informação limitada. Usando um ensaio de ligação baseado em microarray de alta taxa de transferência e análises bioquímicas consecutivas, foi demonstrado que 1) o contexto de ligação específico (seqüências de flanqueamento do local de reconhecimento) influencia a força de ligação da primase do DNA ao seu modelo DNA, e 2) o emperramento mais forte do primase ao ADN rende uns primers mais longos do RNA, indicando o processivity mais elevado da enzima. Este método combina o ensaio da atividade de PBM e de primase e é designado como o perfilamento do primase da elevado-produção (HTPP), e permite a caracterização do reconhecimento de seqüência específico pelo primase do ADN no tempo e na escalabilidade sem precedentes.

Introdução

O HTPP faz uso da tecnologia de Microarray de ligação ao DNA combinada com a análise bioquímica (Figura 1) para identificar estatisticamente as características específicas dos modelos de DNA que afetam a atividade enzimática da PRIMASE do DNA. Portanto, a HTPP fornece uma plataforma tecnológica que facilita um salto de conhecimento no campo. As ferramentas clássicas usadas para determinar os locais do reconhecimento do primase não têm a habilidade de render a quantidade maciça de dados, visto que HTPP faz.

A PBM é uma técnica rotineiramente utilizada para determinar as preferências vinculativas dos fatores de transcrição ao DNA^1,2; Entretanto, não é apropriado para a deteção da ligação fraca/transiente das proteínas ao ADN. Ao contrário do universal PBM que fornece informações sobre a especificidade de ligação de proteínas média para todas as seqüências possíveis consistindo de oito pares de base, HTPP é baseado na biblioteca de modelos de DNA single-encalhado compreendendo elementos de seqüência única. Tais elementos de sequência de DNA envolvem dezenas de milhares de sequências genómicas curtas (poucas dezenas de BP), bem como sequências de DNA computacionalmente projetadas enriquecidas em determinados elementos de seqüência repetitiva de DNA presentes no genoma, que possuem diferentes conteúdos médios de GC . Essa abordagem de alta taxa de transferência permite a determinação de, de forma sistemática, quantitativa e orientada por hipóteses, as propriedades relacionadas à seqüência que são importantes para a vinculação de primase e sua atividade enzimática³. Em particular, a ligação importante entre as preferências de encadernação do primase-DNA, (modulada por sequências de DNA flanqueando sítios de ligação de Tri-nucleotídeo específicos) e a processividade de primase foi identificada para este sistema enzimático⁴.

A nova tecnologia foi aplicada para rever a nossa compreensão de sítios de reconhecimento de primase, mesmo para a primase de DNA T7 que tem sido extensivamente estudada⁵. Especificamente, o reexame de conceitos clássicos, tais como sítios de reconhecimento de DNA da primase de DNA T7 (que foram determinados há quase quatro décadas atrás ⁶) usando microarray de ligação de DNA de proteína (PBM) levou a uma visão sem precedentes sobre as características relacionadas com a seqüência de flanquear esses sites de reconhecimento³. Esperava-se que as sequências flanqueando o local de reconhecimento Tri-nucleotídeo de T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') será aleatório. Em vez disso, descobrimos que sequências de flanqueamento ricas em TG aumentam as chances de a primase do DNA T7 sintetizar primers de RNA mais longos, indicando um aumento na processividade.

Outros métodos que podem ser usados para estudar Propriedades de ligação de DNA de proteínas in vitro incluem o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA)⁷, DNase I footprinting⁸, ressonância de superfície-Plasmon (SPR)⁹, e blotting do sudoeste ¹⁰. These são, entretanto, métodos Low-Throughput somente aplicáveis a investigar um número pequeno de seqüências do ADN. Além disso, a precisão e a sensibilidade de algumas dessas técnicas (por exemplo, EMSA) é baixa. Por outro lado, a seleção in vitro¹¹ é uma técnica que, da mesma forma que a PBM, pode ser utilizada para a identificação de numerosas sequências vinculativas. No entanto, as sequências de baixa afinidade geralmente são excluídas na maioria das aplicações de seleção in vitro; Portanto, essa abordagem não é adequada para a obtenção de dados de vinculação comparativa para todas as seqüências disponíveis. O PBM universal^{1,2é usado} principalmente para caracterizar as especificidades vinculativas dos fatores de transcrição de procariontes e eucariontes, bem como fatores específicos (por exemplo, presença de certos ligantes, cofatores, etc.) que podem afetam essa interação¹².

HTPP expande a aplicação de PBM às enzimas de processamento do ADN combinando o poder estatístico sem precedentes da elevado-produção com a elevada precisão para fornecer a informação no contexto obrigatório da seqüência. Tais dados ainda não foram obtidos para primases e enzimas relacionadas (que têm ligação fraca/transitória ao DNA) devido a limitações técnicas acima mencionadas de outras técnicas disponíveis.

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Protocolo

1. projeto do microarray

Nota: as sondas de DNA representam sequências 36-nucleotídicas personalizadas, consistindo no local de reconhecimento para a primase de DNA T7 (GTC) localizada entre duas regiões de flanqueamento variáveis, seguidas por uma sequência de 24 nucleotídeo constante presa a uma lâmina de vidro³. Utilizou-se um formato de Microarray de 4 x 180.000, que permitiu detectar cada sequência de DNA em seis repetições, distribuídas aleatoriamente no slide.

1. Projeto da biblioteca do ADN para primases com seqüências conhecidas do Recognition
   1. Certifique-se de que cada sequência é composta por 60 nucleotídeos. Mantenha os primeiros 24 nucleotídeos constantes (para ser anexado à corrediça de vidro). As regiões variáveis devem ter a seguinte forma geral: (N)₁₆GTC (n)₁₇; onde N representa qualquer nucleotídeo desejado.
   2. Projete a região flanqueando para abordar uma pergunta científica específica (um exemplo do projeto é apresentado no seguinte texto). As regiões flanqueando podem ser projetadas conter características específicas tais como os elementos da repetição ou a simetria específica.
      Nota: criamos oito categorias de diferentes sequências de flanqueamento compostas por dois ou três nucleotídeos específicos: T e G (grupo 1); T e C (grupo 2); C e A (grupo 3); A e G (grupo 4); G, C e T (grupo 5); C, T e A (Grupo 6); G, A e T (Grupo 7); G, A e C (Grupo 8). 2.000 sequências diferentes foram projetadas para cada grupo. Cada grupo possuía subgrupos de sequências com diferentes tipos e diferentes números de repetições de sequência.
   3. Inclua um conjunto de seqüências de controle negativo (faltando o site de vinculação específica)⁴. A presença de tais sequências permite validar a ocorrência de vinculação específica no experimento.
2. Projeto da biblioteca do ADN para primases com seqüências desconhecidas do recognition
   1. Se a sequência de reconhecimento for desconhecida, crie a biblioteca de DNA selecionando as sequências (com ou sem características específicas mencionadas anteriormente) do genoma do organismo desejado (bactérias, fungos, etc.).
3. Projeto da corrediça do microarray
   1. Compre slides personalizados (por exemplo, 4x180K, AMADID #78366) de um fornecedor comercial (para obter mais detalhes, consulte a tabela de materiais). Ordene cada sequência em seis repetições, onde cada repetição deve ser anexada a um ponto selecionado aleatoriamente no slide.

2. experimento de ligação de DNA primase

Nota: no dia anterior (ou pelo menos 2 h antes) o PBM, prepare a solução de bloqueio [2% w/v leite desnatado em tampão fosfato salina (PBS)] e mexa-o em um agitador magnético. Antes de usar, filtre a solução com um filtro de 0,45 μM. Para detectar a ligação do primase às vertentes do ADN, diversas etapas devem ser executadas na seguinte ordem.

1. Procedimento de bloqueio
   1. Pre-molhe a corrediça do microarray em um frasco de Coplin com 0, 1% v/v Triton X-100 em PBS (5 minutos em 125 RPM em um rotator do laboratório).
   2. Lave brevemente a corrediça da junta (também referida como lamínula) com água e etanol e seque utilizando ar comprimido.
   3. Monte a parte inferior da câmara da hibridação de aço (câmara de PBM) com a corrediça da gaxeta que enfrenta acima (etiqueta comercial que enfrenta acima). Para obter mais detalhes sobre a montagem, consulte a tabela de materiais.
   4. Pipet solução de bloqueio (2% w/v leite desnatado em PBS) em cada câmara.
   5. Remova a corrediça do microarray do frasco de Coplin, a seguir seque o lado do não-ADN (o ADN deve estar no mesmo lado que a etiqueta da companhia) e bordas usando uma limpeza fina. Coloc lentamente o microarray na corrediça da gaxeta, evitando bolhas (etiqueta da companhia que enfrenta para baixo). Imediatamente montar e apertar o aparelho de câmara de hibridização de aço. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente (RT).
   6. Encha um prato de coloração (o prato "PBS") com 800 mL de PBS fresco. Encha um segundo prato de coloração (o prato "WASH") com 800 mL de recém-preparados 0,5% v/v Tween-20 em PBS.
   7. Desaparafuse a câmara de PBM e retire o "sanduíche" do microarray slide-COVERSLIP, tomando o cuidado para não quebrar o selo. Desmonte-o debaixo d' água no prato WASH colocando fórceps entre a corrediça e a lamínula.
   8. Agite a corrediça do microarray subaquática e transfira rapidamente a um frasco de Coplin.
   9. Lave uma vez com 0,1% v/v Tween-20 em PBS (5 min a 125 RPM em um rotador de laboratório).
   10. Lave uma vez com 0, 1% v/v Triton X-100 em PBS (2 min a 125 RPM em um rotador de laboratório).
   11. Transfira rapidamente o slide para um frasco de Coplin contendo PBS.
2. Ligação de proteínas
   1. Monte a câmara de PBM como descrito previamente (etapas 2.1.2 – 2.1.3).
   2. Mistura de ligação à proteína de pipeta contendo 5 μm T7 de DNA primase, 30 mm Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mm MgCl₂, 30 mm K-glutamato, 6 mm ditiotreitol (DTT), 65 μm de ribonucleosídeo trifosfato (rntp), 2% p/v leite desnatado, 100 ng/μL de albumina sérica bovina (BSA), 50 ng/μl DNA de testes de salmão, e 0, 2% v/v Triton X-100 (TX-100) em cada câmara da corrediça da junta (sem tocar nos lados de borracha e sem introduzir bolhas).
   3. Enxague brevemente a lâmina do microarray mergulhando-a no prato PBS, que remove o excesso de detergente da superfície das lâminas. Limpe as superfícies não-DNA do slide com uma limpeza fina.
   4. Abaixe lentamente a corrediça do microarray (virada para baixo) na corrediça da gaxeta, sendo cuidadoso impedir o escapamento de uma câmara a outra. Imediatamente montar e apertar o aparelho de câmara PBM sem introduzir bolhas. Se as bolhas se formam, elas podem ser removidas tocando suavemente a câmara de aço contra uma superfície dura.
   5. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
3. Acessório para anticorpos fluorescentes
   1. Desaparafuse a câmara de PBM e retire o "sanduíche" do microarray slide-COVERSLIP, tomando o cuidado para não quebrar o selo. Desmontar debaixo d' água no prato WASH usando fórceps. Agite a corrediça subaquática e transfira rapidamente a um frasco de Coplin que contem PBS.
   2. Monte a câmara de PBM com a corrediça da gaxeta como descrita previamente (etapas 2.1.2 – 2.1.3).
   3. Adicionar Alexa 488-conjugado anti-seu anticorpo (10 ng/μL em tampão de ligação) para o slide da junta.
   4. Enxágüe a corrediça momentaneamente mergulhando a no prato de PBS como antes, a seguir remova a corrediça de PBS lentamente, limpe a superfície do não-ADN e coloc a que enfrenta para baixo na corrediça da gaxeta.
   5. Incubar 30 min na RT no escuro (a sonda de fluorescência é sensível à luz) para reduzir o branqueamento de fotografias.
   6. Desmontar a câmara de PBM e a lamínula como antes, removendo a lamínula subaquática no prato WASH.
   7. Enxague os slides brevemente, mergulhando-os no prato PBS. Seque as lâminas com ar comprimido. Armazene no escuro em uma caixa de slide até que esteja pronto para digitalizar.
4. Digitalizando o slide do microarray
   1. Escaneie a microplaqueta usando o varredor do microarray (refira a tabela dos materiais) com excitação de 495 nanômetro e emissão de 519 nanômetro e colete a intensidade mediana da fluorescência.

3. análise de dados de Microarray

Nota: todo o processamento de dados foi realizado usando scripts escritos personalizados no MATLAB.

1. Execute o processamento de dados PBM inicial usando o valor de p do teste da soma do Rank de Wilcoxon como descrito previamente⁴.
2. Use o valor mediano da intensidade de ligação para cada sequência de DNA para análise posterior.
3. Em seguida, utilizando os valores de p ANOVA unidirecional, comparar significância estatística das diferenças observadas nas intensidades de ligação do primase-DNA obtidas para diferentes grupos de sondas de DNA, como explicado acima na seção de design da biblioteca de DNA³.

4. síntese de RNA dirigida por modelo catalisada por T7 DNA primase

1. Preparação do gel de poliacrilamida desnaturante
   1. Para preparar 100 mL de mistura de gel, combine 62,5 mL de 40% acrilamida-bisacrilamida (19:1), 42 g de ureia, 1,1 g de base de tris (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol), 0,55 g de ácido bórico, e 0,4 mL de 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) solução.
   2. Divida a mistura em alíquotas de 14 mL (a quantidade necessária para um gel de 16,5 cm x 26 cm x 0, 3 cm) e mantenha-as protegidas da luz a 4 ° c por até 1 mês.
   3. Para preparar um gel de poliacrilamida desnaturante, acrescente 4 μL de TEMED e 40 μL de persulfato de amónio a 10% a 14 mL da mistura previamente preparada, conjurá-lo e deixá-lo polimerizar durante pelo menos 2 h na RT. O gel pode ser mantido por um dia a 4 ° c.
2. Preparação da amostra
   Nota: manter os reagentes, a mistura de reacção e as amostras no gelo.
   1. Para preparar a mistura de reação necessária para dez reações combinar 11 μL de 5x buffer de atividade (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM glutamato de potássio, 50 mM MgCl₂), 5,5 μl de 2,5 mm mistura de nucleotídeo tri-fosfato (ntps), e 5,5 μL de ribonucleotídeo radiolabeled [por exemplo, ATP, (α-32P) 3000 CI/mmol].
      Nota: todos os montantes foram aumentados em 10% devido a possíveis erros de pipetagem. Os ribonucleotídeos radiolabeled devem ser diluídos de acordo com a força do sinal radioativo (a diluição inicial é geralmente 1:10 ou mais).
   2. Transfira 2 μL da mistura de reacção para dez tubos de PCR.
   3. Adicionar 1 μL de modelo de ADN de 100 μM ao tubo de PCR correspondente e girar para baixo.
   4. Adicionar 2 μL de 16 μM T7 de DNA primase, girar para baixo, misturar suavemente, e girar para baixo novamente.
   5. Incubar a reacção em RT durante 20 min.
   6. Pare a reacção adicionando 5 μL de solução de têmpera (95% de formamida, 20 mM de EDTA, 0, 5% p/v de xileno cianol e bromofenol azul), misture e gire para baixo.
3. Separação de produtos do RNA pela electroforese através do gel desnaturando do poliacrilamida e da deteção subseqüente do sinal
   1. Pré-executar o gel para 1 h (10 mA, 600 V) em 1x tampão TBE (90 mM TRIS-borato, 2 mM EDTA).
   2. Carregar até 2 μL de cada amostra e realizar eletroforese (20 mA, 1100 V) em tampão TBE 1x (90 mM TRIS-borato, 2 mM EDTA).
   3. Seque o gel para 2 h a 80 ° c um vácuo.
   4. Expor a placa da imagem latente do fósforo ao gel radioativo por algumas horas à noite, dependendo da força do sinal radioativo.
   5. Registre o sinal (luminescência fotoestimulada) usando o phosphorimager (veja a tabela de materiais).

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Resultados

Este avanço tecnológico para mapear os sítios de encadernação primase permite a obtenção de propriedades de ligação de DNA que são difíceis, se não impossíveis, de observar usando ferramentas clássicas. Mais importante, HTPP permite a revisitação da compreensão tradicional de sítios de encadernação primase. Especificamente, o HTPP revela especificidades vinculativas, além das conhecidas sequências de reconhecimento 5 '-GTC-3 ', o que leva a alterações nas atividade...

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Discussão

O método de PBM tem sido amplamente utilizado para investigar as propriedades vinculativas dos fatores de transcrição e também pode ser aplicado a enzimas de processamento de DNA, como a primase do DNA, que se ligam ao DNA com baixa afinidade. No entanto, certas modificações dos procedimentos experimentais são necessárias. A experimentação do microarray envolve diversas etapas: projeto da biblioteca do ADN, preparação da microplaqueta, emperramento do alvo da proteína, rotulagem fluorescente, e exploração....

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution	Merck	1006401000
95% formamide	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody	Qiagen	35310
Ammonuium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
Boric acid, granular	Glentham Life Sciences	GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA)	Roche	10735094001
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA microarray	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	If several slides are used
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63064-500G
Microarray Hybridization Chamber	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A)	Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Potassium glutamate	Alfa Aesar	A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S
Salmon testes DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Skim milk powder	Sigma-Aldrich	70166-500G
Staining dish	Thermo Scientific	12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Urea	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Xylene cyanol	Alfa Aesar	B21530