Síntese enzimática de metabólitos Epoxidizados de ácidos docosahexaenóico, eicosapentaenóico e Aracidônico

Resumo

Nós apresentamos um método útil para a síntese e a purificação enzimáticas em grande escala de enantiômeros e de regioisômeros específicos dos epóxidos do ácido araquidônico (AA), do ácido docosahexaenóico (DHA), e do ácido eicosapentaenóico (EPA) com o uso de um citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).

Resumo

Os metabólitos epoxidizados de vários ácidos graxos poli-insaturado (PUFAs), denominados ácidos graxos epóxi, têm uma ampla gama de papéis na fisiologia humana. Estes metabolitos são produzidos endogenamente pela classe de enzimas do citocromo P450. Por causa de seus efeitos biológicos diversos e potentes, há um interesse considerável em estudar estes metabolitos. Determinar as funções únicas destes metabolitos no corpo é uma tarefa difícil, como os ácidos graxos epóxi deve primeiro ser obtido em quantidades significativas e com alta pureza. A obtenção de compostos de fontes naturais é muitas vezes trabalhoso, e Hidrolina de epoxida solúvel (sEH) rapidamente hidrolisar os metabolitos. Por outro lado, a obtenção desses metabólitos por meio de reações químicas é muito ineficiente, devido à dificuldade de obtenção de regioisômeros puros e enantiômeros, baixos rendimentos e purificação extensa (e cara). Aqui, nós apresentamos uma síntese enzimática eficiente de 19 (s), 20 (r)-e 16 (s), 17 (r)-ácidos epoxydocosapentaenoic (edps) de DHA através do epoxidação com BM3, uma enzima CYP450 bacteriana isolada originalmente do bacilo megaterium (que é prontamente expresso em Escherichia coli). A caracterização e a determinação da pureza são realizadas com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas (MS). Este procedimento ilustra os benefícios da síntese enzimática de metabolitos da epoxi de PUFA, e é aplicável à epoxidação de outros ácidos gordos, incluindo o ácido araquidônico (AA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA) para produzir o epoxyeicosatrienoic análogo ácidos (Eets) e ácidos ver (EEQS), respectivamente.

Introdução

Como o interesse no papel que os ácidos gordos polyinsaturados (particularmente Omega-3 e Omega-6 ácidos gordos polyinsaturados) jogam na biologia humana cresceu nos últimos anos, os investigadores tomaram a observação da escala larga de benefícios atraentes que seus metabolitos Exposição. Em particular, os metabólitos de ácidos graxos epóxi produzidos pela classe de enzimas do citocromo P450 têm sido um grande ponto de foco. Por exemplo, muitos epoxídeos de PUFA, incluindo ácidos epoxyeicosatrienoic (Eets), ácidos ver (edps) e ácidos ver (EEQS), desempenham um papel crítico na regulação da pressão arterial e inflamação^{1,2 , 3. º , 4. º , 5}. Curiosamente, os enantiômeros e regioisômeros específicos dos epoxídeos AA e EPA são conhecidos por terem efeitos variados sobre a vasoconstrição^6,7. Enquanto os efeitos fisiológicos dos enantiômeros e regioisômeros de EETs e EEQs foram documentados, pouco se sabe sobre o efeito dos ácidos epoxydocosapentaenóicos análogos (EDPs) formados a partir de DHA. O uso generalizado do óleo de peixe⁸, que é rico em EPA e DHA, também despertava o interesse na AEPD⁹. Os benefícios destes suplementos são acreditados para ser em parte devido aos metabolitos a jusante DHA (16,17-EDP e 19,20-EDP sendo o mais abundante) porque in vivo níveis de EDPs coordenar muito bem com a quantidade de DHA na dieta^{10, o 11}.

Estudar os mecanismos e alvos destes ácidos graxos epóxi por Metabolomics, biologia química, e outros métodos tem provado desafiador, em parte porque eles existem como misturas de Regio-e estéreo-isómeros, e um método de obtenção de quantidades puras do são necessários enantiômeros e regioisômeros. Os meios convencionais para sintetizar quimicamente estes compostos provaram ineficaz. O uso de peroxyacid como o ácido meta-chloroperoxybenzoic para o epoxidação tem muitas desvantagens, notàvel a falta do selectivity do epoxidação, que necessita a purificação cara e meticulosa de regioisômeros e de enantiomers individuais. A síntese total dos metabólitos de DHA e EPA é possível, mas também sofre de desvantagens que o tornam impraticável para a síntese em larga escala, como altos custos e baixos rendimentos^12,13. A produção global eficiente pode ser conseguida com síntese enzimática, pois as reações enzimáticas são Regio-e estereosseletivas¹⁴. Estudos mostram que a epoxidação enzimática de AA e EPA (com BM3) é tanto regioseletiva e enantioseletiva^15,16,17,18, mas este procedimento não foi testado com DHA, ou em um grande Escala. O objetivo geral de nosso método era escalar acima e aperfeiçoar esta epoxidação chemoenzimática para produzir ràpida quantidades significativas de ácidos gordos puros da cola Epoxy como seus enantiomers individuais. Usando o método apresentado aqui, os pesquisadores têm acesso a uma estratégia simples e rentável para a síntese de EDPs e outros metabólitos de epóxi PUFA.

Protocolo

Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de utilizar os produtos químicos listados.

1. expressão do selvagem-tipo BM3

1. Inocular pBS-BM3 transfected DH5α E. coli (uma doação generosa de Dr. F. Ann Walker) em 5 ml de caldo lb estéril com 0,5 mg de ampicilina adicionado em um tubo de cultura de 20 ml.
2. Incubar a cultura celular em uma coqueteleira a 37 ° c por 24 h a 200 rpm. Adicione a cultura de partida durante a noite (5 mL) e 100 mg de ampicilina a 1 L de caldo LB estéril em um frasco de Fernbach ou Erlenmeyer. Agitar a 37 ° c por 6 h a 200 rpm, depois a 30 ° c por 18 h a 200 rpm.
3. Colete e centrifugue a cultura celular a 4 ° c por 10 min a 1.000 x g. Descarte o sobrenadante e armazene a pelota da pilha em-78 ° c até a purificação da enzima.
   Nota: o sobrenadante pode ser quimicamente esterilizado por tratamento com lixívia ou esterilizado usando uma autoclave e, em seguida, derramado para baixo do dreno.

2. purificação de BM3.

1. Lise celular
   1. Descongelar o pellet de células no gelo e ressuscita em 40 mL de tampão de solubilização gelada (4 ° c) (Tris de 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil de 0, 1 mM (PMSF;), EDTA de 0, 1 mM; pH 7,8).
      Cuidado: PMSF é tóxico pelo contato.
   2. Quando no gelo, proceda as pilhas por 1 minuto com um homogeneizador ultra-sônico (ajuste 10 do poder da saída, dever 100%), seguido por uma ruptura de 1 minuto no gelo a fim lyse as pilhas. Repita este procedimento 6 vezes. Centrifugue o lisado da pilha em 4 ° c por 30 minutos em 11.000 x g aos restos da pilha da pelota.
2. Cromatografia de afinidade
   1. Prepare uma coluna de cromatografia de troca aniónica forte (ver tabela de materiais; diâmetro: 2,8 cm x 6 cm, volume da coluna: 37 ml) por lavagem com 5 volumes de coluna (CV) de tampão a (10 mm Tris, pH 7,8) a 4 ° c.
   2. Adicione os lisados de células à coluna equilibrada e lave a coluna com 3 CV de tampão frio a. elute o BM3 lavando a coluna com tampão frio B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
   3. Colete a fração eluente marrom-avermelhada. Se a proteína não estiver sendo usada imediatamente, misture-a com um volume igual de glicerol e congelamento de flash com nitrogênio líquido. Armazene a solução congelada em-78 ° c.

3. epoxidação de DHA por BM3

1. Prepare a reacção adicionando 0,308 g (0,940 mmol) de DHA em 18,8 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) a 2 L de tampão de reacção de agitação (fosfato de potássio de 0,12 M, 5 mM MgCl₂, pH 7,4) juntamente com 20 nm da enzima BM3 descongelada. A concentração enzimática pode ser determinada pelo método de ensaio espectral de monóxido de carbono/ditionita¹⁹.
2. Enquanto a solução está mexendo, comece a reação adicionando 1 equivalente de NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido, sal de tetrassódico, 0,808 g, 0,940 mmol) dissolvido em tampão de reação. Mexa a reação por 30 min enquanto borbulhando ar através da mistura de reação com um balão cheio de ar anexado a uma seringa e agulha.
3. Utilizando um espectrofotômetro (ver tabela de materiais), verifique a absorvância da mistura de reacção a 340 nm para determinar se o NADPH está esgotado. Se não houver absorvância remanescente indicando o consumo de NADPH, a reação está completa.
   Nota: normalmente, a reacção é concluída após 30 min.
4. Saciar a mistura de reacção adicionando lentamente 1 M de ácido oxálico, Dropwise, até que o pH da solução atinja 4.

4. extração de AEPD

1. Extraia a solução tampão extinto com 2 L de éter dietílico (anidro, sem peróxido) 3 vezes. Colete a camada de éter (6 L) e seque com sulfato de magnésio anidro (MgSO₄).
2. Filtre o MgSO₄ da solução e concentre a camada de éter seco em um evaporador rotativo para produzir o resíduo bruto da EDP.
3. Purificar o resíduo por cromatografia em coluna flash (um cartucho de sílica 40 g é suficiente). Comece em 10% acetato de etilo (etoac) em hexanos e rampa até 60% etoac em hexanos mais de 22 min.
   Nota: três picos principais são obtidos e recolhidos, eluição na ordem de 1. DHA não reagido; 2. mistura de isómeros EDP; e 3. di-epoxida (produtos de oxidação normal (ver Figura 1)).
4. Combine as frações e concentre-as no evaporador rotativo. A partir deste exemplo, 0, 74 g, (24%) de DHA não reagido, 0,151 g (47%) dos isómeros da EDP, e 0, 76 g, (22%) de di-epoxida foram obtidos.

5. esterificação de AEPD, separação de 16 (s), 17 (r)-e 19 (s), 20 (r)-EDP e saponificação de ésteres

Cuidado: o Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazometano) é muito tóxico pelo contato e pela inalação. Use somente em uma capa das emanações com o equipamento protetor pessoal apropriado.

1. Diluir os epóxidos (0,151 g, 0,435 mmol) em um balão de fundo redondo ou um pequeno frasco para injetáveis com 2 ml de metanol anidro (MeOH) e 3 ml de tolueno anidro, adicione uma barra de agitação e adicione TMS-diazometano (1,2 equivalentes molar, ou 0,26 ml de uma solução de 2 M em hexanes) Argon.
2. Aguarde 10 min e adicione TMS-diazometano adicional (0, 50 mL) até que uma cor amarela pálida permaneça.
3. Após 30 min, concentre cuidadosamente a mistura usando o evaporador rotativo e purifique o resíduo por cromatografia em coluna flash. Elute com 4% etoac em hexanos (usando uma coluna de gel de sílica 40 g ou cartucho) por 22 min. Neste exemplo, 19, 20-éster metílico de EDP (0,116 g, 74%) e 16, 17-éster metílico de EDP (0, 29 g, 19%), foram obtidos como óleos claros (rendimento total, 93%).
4. Recolher as frações contendo os regioisómeros de éster metílico purificados. 19 (s), 20 (R)-elutos do éster metílico de EDP primeiramente, seguidos por 16 (s), 17 (R)-éster metílico de EDP.
5. Se qualquer fração mista permanecer (contendo ambos os isómeros; pode ser avaliada por cromatografia em camada delgada (TLC) em 8:1 hexano/EtOAc e manchada com permanganato de potássio (KMnO₄)), recromatógrafo-los com o mesmo sistema de solvente como antes.
6. Concentrar as frações contendo os regioisómeros individuais.
   Nota: neste ponto, a identidade e a pureza podem ser avaliadas por RMN (usando CDCl₃ como o solvente; ver a legenda para a Figura 2).
7. Para converter os regioisómeros de éster metílico de EDP individuais nas suas formas de ácido, diluir o éster EDP em THF: Water (aproximadamente 0,7 mL/0,1 mmol de éster). Adicionar 2 M aquosa LiOH (3 equivalentes molar) e mexa durante a noite.
   Nota: a completude da reacção pode ser avaliada por TLC, utilizando 3:1 hexanes/EtOAc, manchando com KMnO₄; o produto tem um fator de retenção de ~ 0,3.
8. Saciar a reação lentamente com ácido fórmico, até que o pH da mistura atinja 3-4. Adicionar água e acetato de etila (1-2 mL/0.100 mmol de éster) e separar as camadas. Extraia a camada de água com EtOAc (3 x 5 mL), lave com solução de salmoura saturada (NaCl) e seque a camada EtOAc sobre o sulfato de sódio anidro (na₂so₄).
9. Concentre a solução de acetato de etila utilizando um evaporador rotativo, adicione hexanos (10 ml) e concentre-se novamente. Repita duas vezes para remover azeotropicamente o ácido fórmico residual. Purify o resíduo pela cromatografia de coluna instantânea, farmacológicos com 10-30% etoac sobre 15 minutos.
10. Concentre as frações desejadas e seque em vacuo para pagar o ácido purificado.
    Nota: nesta fase, a pureza enantiomérica pode ser avaliada (por HPLC quiral, ver as legendas para a Figura 3 - Figura 4 para coluna e condições). A pureza química pode ser avaliada por CLAE C18 (achiral) (ver tabela de materiais e referência 14).

Resultados

O cromatograma de coluna flash (realizado usando um sistema automatizado de purificação de flash como descrito abaixo) obtido após a purificação da mistura bruta de epoxidação enzimática é mostrado na Figura 1. Após a esterificação e separação dos regioisómeros, foram obtidos 16 (s) puros, 17 (r)-EDP e 19 (s), 20 (r)-ésteres metílicos de EDP. Tipicamente, eles estão presentes em uma proporção aproximada ...

Discussão

Apresentamos aqui um método operacionalmente simples e econômico para a preparação dos dois metabólitos epoxídicos mais abundantes de DHA-19, 20 e 16,17-EDP. Estes ácidos graxos epóxi podem ser preparados em altamente enantiopure (como seu S, R-isómeros) forma usando selvagem-tipo BM3 enzima. Vários pontos críticos que podem ser usados para solução de problemas, e a extensão do nosso método para a preparação de metabólitos epóxi enantiopure de AA e EPA, são descritos abaixo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer