Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para a geração espontânea de neuroesferas enriquecidas em células progenitoras neurais de neurônios chapeados de alta densidade. Durante a mesma experiência, quando os neurônios são chapeados em uma densidade mais baixa, o protocolo igualmente conduz às culturas preliminares prolongadas do neurônio de rato.

Resumo

A cultura primária do neurão é uma técnica essencial no campo da neurociência. Para obter insights mecanísticos mais profundos sobre o cérebro, é essencial ter um modelo in vitro robusto que pode ser explorado para vários estudos de neurobiologia. Embora as culturas preliminares do neurônio (isto é, culturas hippocampal a longo prazo) forneceram cientistas com modelos, não representa ainda a complexidade da rede do cérebro completamente. Na esteira dessas limitações, um novo modelo surgiu usando neuroesferas, que tem uma semelhança mais estreita com o tecido cerebral. O protocolo atual descreve o chapeamento de densidades elevadas e baixas de neurônios corticais e hippocampal misturados isolados do embrião do dia embrionário 14-16 ratos de Sprague Dawley. Isto permite a geração de neuroesferas e a cultura preliminar a longo prazo do neurônio como duas plataformas independentes para conduzir uns estudos mais adicionais. Este processo é extremamente simples e rentável, pois minimiza várias etapas e reagentes anteriormente considerados essenciais para a cultura do neurônio. Este é um protocolo robusto com requisitos mínimos que podem ser realizados com resultados alcançáveis e mais utilizados para uma diversidade de estudos relacionados à neurociência.

Introdução

O cérebro é um circuito intrincado de células neuronais e não-neuronais. Durante anos, os cientistas têm tentado obter informações sobre esta maquinaria complexa. Para isso, os neurocientistas recorreram inicialmente a várias linhagens celulares transformadas em nervo para investigações. No entanto, a incapacidade dessas linhagens de células clonais de formar conexões sinápticas fortes e axônios ou dendritos adequados mudaram o interesse científico para as culturas primárias do neurão^1,2. O aspecto mais excitante da cultura do neurônio primário é que ele cria uma oportunidade para observar e manipular os neurônios vivos³. Além disso, é menos complexa em comparação com o tecido neural, o que o torna um candidato ideal para estudar a função e o transporte de várias proteínas neuronais. Recentemente, vários desenvolvimentos nas áreas de microscopia, genômica e proteômica têm gerado novas oportunidades para os neurocientistas explorarem as culturas neurais⁴.

As culturas primárias permitiram que os neurocientistas explorem os mecanismos moleculares por trás do desenvolvimento neural, analisem várias vias de sinalização neural e desenvolvam uma compreensão mais coerente da sinsicose. Embora uma série de métodos relataram culturas de neurônios primários (principalmente a partir da origem hipocampal^5,6,7),um protocolo unificado com um meio quimicamente definido que permite a cultura de longo prazo de neurônios é ainda necessário. Entretanto, os neurônios chapeados em uma baixa densidade são observados o mais frequentemente, que não sobrevivem a longo prazo, provavelmente devido à falta do apoio trófico⁸ que é fornecido pelos neurônios adjacentes e pelas pilhas glial. Alguns métodos sugeriram até mesmo a coculturação dos neurônios primários com células gliais, onde as células gliais são usadas como uma camada de alimentador⁹. Entretanto, as pilhas glial levantam muitos problemas devido a seu overgrowth, que substituem às vezes o crescimento neuronal¹⁰. Assim, considerando os problemas acima, é necessário um protocolo de cultura neural primária mais simples e rentável, que pode ser usado tanto por neurobiólogos quanto por neuroquímicos para investigações.

Uma cultura primária de neurónios é essencialmente uma forma de cultura 2D e não representa a plasticidade, a integridade espacial ou a heterogeneidade do cérebro. Isso tem dado origem à necessidade de um modelo 3D mais crível chamado neuroesferas^11,12. As neuroesferas apresentam uma nova plataforma para os neurocientistas, com uma semelhança mais estreita com o cérebro real, in vivo¹³. As neuroesferas são aglomerados 3D não aderentes de células que são ricas em células-tronco neurais (NSCs), células progenitoras neurais (NPCs), neurônios e astrócitos. Eles são uma excelente fonte para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras neurais, que podem ser usadas para estudar a diferenciação em várias linhagens neuronais e não-neuronais. Outra vez, a variabilidade dentro das culturas da neurofera produzidas usando os protocolos previamente relatados apresenta uma barreira à formulação de um protocolo unificado da cultura da neurofera¹⁴.

Este manuscrito apresenta um protocolo em que é possível gerar ambas as plataformas 2D e 3D alternando densidades do chapeamento de pilha de uma cultura cortical e hippocampal misturada. Observa-se que dentro de 7 dias as neuroesferas livres-flutuantes são obtidas dos neurônios chapeados high-density isolados do embrião do rato de E14-E16 Sprague Dawley, que em cima da cultura mais adicional, formam pontes e interconexões através das extensões glial-como radiais. Similarmente, nos neurônios chapeados da baixa densidade, uma cultura preliminar do neurônio que possa ser mantida por até 30 dias é obtida mudando o meio da manutenção duas vezes por a semana.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de ética animal institucional do CSIR-Instituto indiano de biologia química (IICB/AEC/reunião/abr/2018/1).

1. reagente e preparação dos meios

1. Solução de poli-D-lisina (PDL): Preparar soluções PDL em concentrações de 0,1 mg/mL em água desionizada e armazenar em 4 ° c até o uso.
2. Meio de dissociação: para 1 L de água desionizada estéril e filtrada, combine os seguintes componentes nas respectivas concentrações: cloreto de sódio (8 mg/mL), cloreto de potássio (0,4 mg/mL), fosfato de potássio monobásico (0, 6 mg/mL), D-glucose (1 mg/mL), fosfato de sódio dibásico (0,479 mg/mL) e 1 M de HEPES [4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazineetanoesulfonic Acid; 10 mM]. Vortex todos os componentes para ajudar a mistura adequada e armazenar em 4 ° c até o uso.
   Nota: Use o meio de dissociação em forma de gelo-frio durante a dissociação, mas à temperatura ambiente (RT) para lavagem e outros fins.
3. Meio do chapeamento: o meio do chapeamento consiste no seguinte: meio essencial mínimo (MEM) águia com solução de sal equilibrada de Earle (BSS; 88,4%), D-glicose (0,6%), soro do cavalo (10%), e penicilina/Streptomycin (1%). Combine os componentes nas respectivas proporções e realize o procedimento dentro de um capô condições estéreis.
   Nota: Utilize sempre o meio de revestimento preparado recentemente para evitar a degradação de qualquer componente.
4. Meio de manutenção: Prepare o meio de manutenção combinando o seguinte nas respectivas proporções: meio neurobasal (97%), 0,5 mM amostra de glutamina comercialmente obtida, B27 suplemento livre de soro (2%) e penicilina/estreptomicina (1%). Combine os componentes nas respectivas proporções e realize o procedimento dentro de um capô condições estéreis. Assegure-se de que todos os componentes estejam preparados recentemente.

2. preparação de coberturas

1. Pegue uma lamínula redonda de 12 mm de diâmetro e mergulhe-a em 1 M de ácido clorídrico (HCl) por 4 h.
2. Transfira os COVERSLIP na água destilada usando um par de fórceps e gire-o delicadamente para começ livrado do ácido completamente.
3. Transfira as coberturas lavadas para uma rodada adicional de limpeza em um copo contendo 100% de etanol.
4. Antes de usar os lamínulas, seque-os bem na capa laminar, mantendo-os em papel tissue.

3. preparação de placas revestidas de poli-D-lisina para a cultura do neurônio

1. Tome 2 24 placas do poço: uma para o chapeamento de alta densidade e outra para o chapeamento da baixa densidade. Abra os pacotes estéreis somente dentro da capa laminar.
2. Transfira os 12 milímetros de coberturas de vidro estéreis nas 24 placas do poço.
3. Despeje 300 μL de solução de PDL (0,1 mg/mL em água desionizada) em cada poço de modo que cubra totalmente a superfície das coberturas.
4. Enrole as placas com folha de alumínio para evitar a secagem e mantê-lo na incubadora CO₂ durante a noite.
5. No dia seguinte (antes do chapeamento), aspirar a solução PDL e lavar adequadamente com 300 μL de água desionizada estéril duas a três vezes.
6. Adicionar 200 μL de meio de revestimento recém-preparado e devolver as placas à incubadora até ao revestimento.

4. remoção e decapitação do feto

Nota: esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos embalados em folha de alumínio em autoclave a 121 ° c (15 psi) por 30 min. Isto inclui um par de tesouras Blunt-end, fórceps, fórceps fino, duas tesouras finas, e um fórceps da artéria para o procedimento inteiro.

1. Para gerar neurônios e neuroesferas, use um rato Sprague Dawley cronometrado-grávido e marque o dia com a deteção vaginal do plugue como E0.
   Nota: a cultura deve ser realizada entre E14-E16.
2. No dia da cultura, coloque uma placa de Petri de vidro estéril no gelo e encha-a com a solução fria de sal equilibrada de Hank (HBSS).
3. Anestesiam um rato grávida E14-E16 com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de 90 mg de cetamina/kg de peso corporal e 10 mg de xilazina/kg, depois sacrificam-se realizando luxação cervical.
   Nota: os ratos também podem ser eutanasiados por uma overdose de pentobarbital ou overdose de cetamina com xilazina ou diazepam.
4. Esterilize o abdômen da represa pulverizando o etanol de 70% e faça um corte em forma de V na área abdominal usando o fórceps estéril e um par de tesouras Blunt-end.
5. Tome os sacos embrionários com cuidado na placa de Petri com a solução fria de HBSS.
   Nota: não use o mesmo fórceps e tesouras que foram usados apenas para a pele, como isso irá contaminar os órgãos internos. Use um conjunto diferente de tesouras/fórceps para os órgãos internos.
6. Leve os embriões para fora dos sacos embrionários em HBSS fresco e frio.
7. Decapitar a cabeça com uma tesoura estéril.

5. remoção do cérebro e dissecção do córtex com hipocampo

1. Antes de começar, encha 90 mm de placas de Petri estéreis com HBSS frios e estéreis.
2. Transfira as cabeças nos pratos estéreis usando o fórceps estéril, Blunt-terminado do curativo.
3. o estereomicroscópio, segure a cabeça da região de focas com fórceps estéril, serrilhada e remova o cérebro cortando a pele e o crânio abertos.
4. Colete todos os cérebros de embriões da mesma maneira na solução HBSS.
5. Remova todas as meninges dos hemisférios e do midbrain segurando o tronco cerebral.
6. Remova com cuidado os hemisférios intactos que lembram os tampões do cogumelo que contêm o hipocampo e o córtice.
7. Colete os hemisférios contendo córtex e hipocampo intacto em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de meio de dissociação.

6. dissociação do tecido cortical e hipocampal em neurônios únicos

1. Permitir que os tecidos recolhidos para acalmar e aspirar o meio de dissociação, deixando 5%-10% do meio nele.
2. Adicione 10 mL de meio de dissociação fresca ao tecido e repita o passo 6,1 duas vezes.
3. Adicionar 4,5 mL de meio de dissociação e 0,5 mL de 0,25% (1x) tripsina EDTA (etileno diamina tetraacetato) solução.
4. Mantenha o tecido na incubadora a 37 ° c por 20 min para que a digestão prossiga.
5. Aspirar o meio e adicionar 10 mL de dissociação e chapeamento médio consecutivamente aos tecidos digeridos.
6. Permitir que os tecidos digeridos para acalmar e aspirar o meio de dissociação. Adicione 2,5 mL de meio de chapeamento e despeje na base de um prato estéril de 90 mm.
7. Triturar os tecidos digeridos na base de canto do prato usando uma ponta de pipeta 1.000 μL para ocupar o volume mínimo.
8. Passar a suspensão celular obtida através do filtro de células de 70 μm, excluindo quaisquer pedaços de tecido.
9. Determine a densidade de células viáveis usando o método de exclusão de corante azul de Tripan e conte o número de células em um contador de célula automatizado.
   1. Para o método de exclusão de corante azul de Tripan, tome 10 μL da suspensão celular e 10 μL de 0,4% de mancha azul de Tripan, misture bem e adicione 10 μL da mistura em uma das duas câmaras fechadas das lâminas de câmara descartáveis.
   2. Insira o slide que contém a mistura no contador de células e obtenha a leitura.
      Nota: o método de exclusão de corante azul Tripan baseia-se no princípio de que as células ao vivo (devido às suas membranas intactas) excluirão o corante azul de Tripan e, portanto, mostrarão um citoplasma claro, comparado a uma célula não viável que facilmente levará o azul de Tripan e aparecerá em azul cor¹⁵.
10. Diluir o número de células obtidas para a placa 1,5 x 10⁵ células/ml para alta densidade e 20.000 células/ml para baixa densidade em dois tubos separados contendo 30 ml cada um do meio de chapeamento.
11. Aspirar o meio de chapeamento previamente adicionado de cada poço e placa 500 μL de células dispersas em meio de chapeamento em cada poço.
12. Depois que retorne as placas à incubadora em 37 ° c e a 5% CO₂ para 4 h.
13. Examine as células para a aderência o microscópio 4 h após o chapeamento.
14. Se houver aderência adequada das células em ambas as placas, substitua o meio em cada poço com 500 μL de meio de manutenção fresca e incubar a 37 ° c.
15. Cultura estes neurônios cultivados em baixa densidade por 30 dias, alterando o meio de manutenção 2x por semana.
16. Cultura as neuroesferas obtidas a partir dos neurônios chapeados de alta densidade no mesmo meio de manutenção, transferindo-os para as placas de fixação Ultrabaixa.
17. Caracterizar os neurônios e as neuroesferas por imunocoloração-los com marcadores importantes. Para Immunocytochemistry, primeiramente fixe as pilhas/neurospheres usando o formaldehyde de 4% por 30 minutos na placa própria, a seguir permeabilize as pilhas com o detergente non-ionic de 0,1% por 10 minutos.
18. Adicione anticorpos primários para ambos os neurônios (anti-Tuj1, GFAP, O4, Tau) e neuroesferas (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) em 1:300 concentrações e incubar durante a noite a 4 ° c¹⁶.
    Nota: o Tuj1 (classe III β-tubulin) e Tau são marcadores positivos para os neurônios primários, enquanto GFAP (proteína glial fibrilhar ácida) e O4 (marcador oligodendrocyte) são marcadores negativos para os neurônios primários^17,18. No caso das neuroesferas, Tuj1, GFAP e Nestin servem como marcadores positivos^19,20.
19. No dia seguinte, lave as células com PBS uma ou duas vezes e adicione anticorpos secundários apropriados em PBS a 1:600 concentrações em RT por 2 h.
    Observação: os anticorpos secundários anti-mouse ou anti-Rabbit são selecionados dependendo da espécie hospedeira do anticorpo primário adicionado. Deve ser mantido na mente que os anticorpos secundários devem ser conjugados aos derivados da fluorescência apropriados para finalidades da microscopia de fluorescência.
20. Lave as células novamente com PBS uma ou duas vezes.
    1. Realize a coloração nuclear das células com Hoechst 33258 (1 mg/mL de solução em água desionizada). Prepare 0,1% solução Hoechst em PBS a partir da solução de ações e adicioná-lo às células.
    2. Incubar as células com 0,1% solução de Hoechst por 30 min, em seguida, lave novamente com PBS.
21. Adicionar 20 μL de PBS (ou meio de montagem) no slide e montar lentamente a lamínula contendo as células manchadas sobre a área do slide contendo PBS. Selar as margens da lamínula com xileno de poliestireno de Dibutilftalato (DPX).
22. Realize imagens das células fixas um microscópio a uma ampliação de 10x e 40x.

Resultados

Neste protocolo, uma estratégia simples foi elucidada em que as densidades variáveis do chapeamento de pilha de duas plataformas de seleção neural diferentes são obtidas. A Figura 1a,B ilustra a aderência das células após 4 h de chapeamento dos neurônios em células de alta e baixa densidade, respectivamente. Ao observar a aderência adequada dos neurônios como mostrado na Figura 1, o meio de revestimen...

Discussão

Este protocolo descreve que como alterando as densidades do chapeamento de pilha de neurônios preliminares, duas plataformas neuronal variáveis são obtidas. Embora este seja um método simples, cada etapa deve ser meticulosamente realizada para alcançar os resultados desejados. Outros métodos anteriores relataram culturas de neurônio primários de longo prazo ou culturas de neurofera. A maioria de protocolos preliminares da cultura do neurônio envolveram o cultivo de neurônios hippocampal por 3-5 semanas, mas a m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072