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Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.

Resumo

As ilhotas pancreáticas compreendem células endócrinas com padrões distintivos de expressão hormonal. As células endócrinas mostram diferenças funcionais em resposta às condições normais e patológicas. O objetivo deste protocolo é gerar dados de transcriptomas de alta qualidade e em grande escala de cada tipo de célula endócrina com o uso de uma tecnologia de sequenciamento de RNA de célula única microfluídico baseada em gotas. Tais dados podem ser utilizados para construir o perfil de expressão gênica de cada tipo de célula endócrina em condições normais ou específicas. O processo exige a manipulação cuidadosa, a medida exata, e o controle rigoroso da qualidade. Neste protocolo, nós descrevemos etapas detalhadas para a dissociação, o sequenciamento, e a análise dos dados dos ilhotas pancreatic humanos. Os resultados representativos de aproximadamente 20.000 pilhas humanas da ilífica única demonstram a aplicação bem sucedida do protocolo.

Introdução

Ilhotas pancreáticas liberar hormônios endócrinos para regular os níveis de glicose no sangue. Cinco tipos de células endócrinas, que diferem funcionalmente e morfologicamente, estão envolvidos neste papel essencial: α-células produzem glucagon, β-células de insulina, δ-células somatostatina, células PP polipeptídeo pancreático, e ε-células grelina1. O perfil da expressão gênica é uma abordagem útil para caracterizar as células endócrinas em condições normais ou específicas. Historicamente, todo o perfil de expressão gênica de Islet foi gerado usando Microarray e sequenciamento de RNA de próxima geração2,3,4,5,6,7 , 8. embora o transcriptoma do Islet inteiro seja informativo para identificar os transcritos órgão-específicos e os genes do candidato da doença, não descobre a heterogeneidade molecular de cada tipo da pilha do Islet. A técnica da microdissecção da captação do laser (LCM) foi aplicada para obter diretamente tipos específicos da pilha dos ilhotas9,10,11,12 mas cai a falta da pureza da pilha alvejada População. Para superar essas limitações, a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) tem sido usada para selecionar populações específicas de células endócrinas, como as células α e β-13,14,15,16 , 17 anos de , 18. Além disso, Dorrell et al. utilizaram uma abordagem de triagem de FACS baseada em anticorpos para classificar as células β em quatro subpopulações19. As pilhas da ilhada FACS-classificadas podem igualmente ser chapeadas para arranjar em seqüência do RNA de únicas pilhas; no entanto, os métodos baseados em placa enfrentam desafios na escalabilidade20,21,22.

Para gerar alta qualidade, dados de transcriptoma em grande escala de cada tipo de célula endócrina, aplicamos a tecnologia microfluídico a células de Illet humanas. A plataforma microfluídico gera dados de transcriptoma a partir de um grande número de células individuais em uma maneira de alta taxa de transferência, alta qualidade e escalável23,24,25,26,27. Além de revelar características moleculares de um tipo de célula capturado em uma grande quantidade, a plataforma microfluídico altamente escalável permite a identificação de tipos de células raras quando são fornecidas pilhas suficientes. Assim, a aplicação da plataforma às ilhotas pancreáticas humanas permitiu o perfilamento das ε-células secretores de grelina, um tipo raro de células endócrinas com pouca função conhecida devido à sua escassez28. Nos últimos anos, vários estudos foram publicados por nós e outros relatando dados de transcriptoma em larga escala de ilhotas humanas usando a tecnologia29,30,31,32, 33. Os dados estão disponíveis publicamente e os recursos úteis para a Comunidade do Islet para estudar a heterogeneidade da pilha de glândula endócrina e sua implicação nas doenças.

Aqui, nós descrevemos um protocolo de sequenciamento microfluídico com base em gotas de RNA de célula única, que tem sido usado para produzir dados de transcriptomas de aproximadamente 20.000 células de ilhas humanas, incluindo α-, β-, δ-, PP, ε-Cells, e uma menor proporção de células não-endócrinas 32. o fluxo de trabalho começa com ilhotas humanas isoladas e retrata etapas de dissociação de células de ilhotas, captura de célula única e análise de dados. O protocolo requer o uso de ilhotas recém-isoladas e pode ser aplicado a ilhotas de seres humanos e outras espécies, como roedores. Usando este fluxo de trabalho, untendenciosa e abrangente Islet célula Atlas em linha de base e outras condições podem ser construídas.

Protocolo

1. dissociação de Illet humana

  1. Obter ilhotas humanas isoladas de doadores de órgãos de cadáveres de qualquer sexo, com idades entre 15-80 anos, sem doenças pré-existentes, a menos que ilhotas de doadores com dados demográficos específicos sejam necessárias para o propósito do estudo.
    1. Após a isolação, tenha as ilhotas isoladas mantidas na facilidade da cultura do tecido por 2-3 dias no fornecedor. Toma frequentemente mais de 1 dia para que os danos do Islet tornem-se visíveis.
    2. Coloque as ilhotas em uma garrafa e mergulhe-a completamente no meio de ilhós. Levá-lo para o laboratório durante a expedição durante a noite.
    3. Obter a quantidade equivalente de ilhotas (IEQ) dos ilhéus enviados do fornecedor de ilhós.
  2. Recupere ilhotas da remessa no dia da chegada do ilhós. Realize esta etapa usando um capuz para minimizar a chance de contaminação.
    1. Fixe o Islet completo Media (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-strep, 2 mM glutamina) em um refrigerador.
    2. Transfira as ilhotas da garrafa para um tubo cônico de 50 mL.
    3. Adicione 10 mL de meios de ilhós completos pré-arrefecidos ao frasco esvaziado para lavar as ilhotas restantes. Transfira a mídia para o tubo cônico.
    4. Centrifugue o tubo em 200 x g por 2 min para recuperar ilhotas. Aspirar o sobrenadante deixando cerca de 1-2 mL de mídia com o pellet.
    5. Ressuscite as ilhotas com meios de ilhós completos pré-arrefecidos. Com base no IEQ fornecido pelo fornecedor, adicione 12 mL de mídia por 5000 IEQ.
    6. Despeje as ilhotas na mídia em um prato de cultura de tecido não tratado de 10 cm. Incubar durante a noite em uma incubadora da cultura do tecido em 37 ° c com 5% CO2 no ar atmosférico.
  3. Dissociar ilhotas como mostrado abaixo. Realize esta etapa após a incubação durante a noite.
    1. Pre-aqueça o Islet completo e a solução da dissociação da pilha.
    2. Prepare 1X PBS contendo 0, 4% de BSA à temperatura ambiente.
    3. A contagem e a mão-escolhem 200-300 ilhotas usando uma pipeta P200 e transferem as ilhotas a um tubo cónico de 15 mL que contem 5 mL meios de ilhós completos pre-warmed.
    4. Recolher as ilhotas por centrifugação a 200 x g durante 2 min. aspirar suavemente o sobrenadante sem perturbar a pelota na parte inferior.
    5. Adicione 1,0 mL de solução de dissociação de células pré-aqueceu e interrompa a pelota introduzindo suavemente para cima e para baixo. Incubar as ilhotas a 37 ° c por 9-11 min. Cada 3 min pipeta para cima e para baixo lentamente para 10 s para dissociar as células em células individuais.
    6. Uma vez que as células de Illet estão bem dissociadas e a solução fica turva, adicione 9 mL de mídia de Illet completa e filtre através de um filtro de célula de 30 μm em um novo tubo cônico de 15 mL.
    7. Lave o filtro do tubo e da pilha com 2 mL de meio de ilhós completo para recolher as ilhotas restantes e adicionar ao mesmo tubo.
    8. Colete células por centrifugação a 400 x g por 5 min.
    9. Aspirar suavemente a mídia e ressuscite o pellet celular em 5 mL 1X PBS contendo 0, 4% BSA (PBS-BSA).
    10. Filtre através de um novo filtro de célula de 30 μm em um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 400 x g por 5 min para coletar células.
    11. Aspirar o sobrenadante e ressuscigar o pellet celular em 200-300 μL 1X PBS-BSA solução.
    12. Meça a concentração da pilha e ajuste o volume a uma concentração final de 400-500 pilhas/μL.

2. único controle da qualidade da suspensão da pilha

  1. Determine a concentração celular usando um contador de células automatizado baseado em fluorescência34.
    1. Misture 10 μL de células com 0,5 μL AO/DAPI. Pipeta misture completamente. Carregue 10,5 μL no slide e execute o ensaio de contagem de células para determinar a contagem e a viabilidade.
    2. Diluir e/ou filtrar a suspensão da célula conforme necessário com base na contagem de células.

3. single cell particionamento usando um chip microfluídico. Siga o protocolo do fabricante microfluídicos da microplaqueta35.

  1. Traga 3 ' contas de gel e reagentes de transcrição reversa (RT) para a temperatura ambiente (> 30 min). Reconstituir o primer RT no tampão TE, se necessário.
  2. Prepare a mistura mestre RT em um tubo de ligação baixa, conforme descrito na tabela 1.
  3. Determine o número de células a serem inseridos para cada amostra. Calcule o volume de suspensão da célula (X) necessário para entregar o número de célula alvo pretendido. O volume calculado de água livre de nuclease para adicionar a cada amostra será de 33,8-X μL.
  4. Para cada amostra a ser particionada, adicione 33,8-X μL de água nuclease livre em 0,2 mL tubo de tira PCR. Em seguida, adicione 66,2 μL de mistura mestre a cada tubo de tira. Não adicione as células ao tubo de tira neste momento. Pipeta suavemente para misturar. Coloque os tubos de tiras preparados no gelo.
  5. Coloque um chip microfluídico em uma caixa de chip. Oriente a caixa de chip assegurando que os poços de petróleo (linha rotulada 3) estejam mais próximos da pessoa que realiza o experimento.
  6. Se executar menos de 8 amostras, use 50% de glicerol para preencher os canais não utilizados na seguinte ordem:
    1. Adicionar 90 μL de 50% de glicerol nos poços da linha 1 para todos os canais não utilizados.
    2. Adicionar 40 μL de 50% de glicerol nos poços da linha 2 para todos os canais não utilizados.
    3. Adicionar 270 μL de 50% de glicerol nos poços da linha 3 para todos os canais não utilizados.
  7. Encaixe os grânulos de gel em um Vortex. Vortex em plena velocidade para 30 s. Bata a tira na parte superior do banco várias vezes para coletar grânulos. Confirme que não há bolhas presentes.
  8. Adicionar X μL de células nos tubos de tiras preparados. Pipeta para misturar 5 vezes. Sem descartar as pontas da pipeta, transfira 90 μL de mistura de células para a linha 1 do chip.
  9. Aguarde 30 s e, em seguida, carregue 40 μL de grânulos de gel para a carreira 2. Pipeta muito lentamente para esta etapa. Dispensar 270 μL de óleo de particionamento para os poços da linha 3.
  10. Prenda a junta da microplaqueta nas abas do suporte da microplaqueta. Coloc o suporte de microplaqueta montado no único dispositivo de particionamento da pilha e pressione a tecla do funcionamento.
  11. Remova imediatamente o suporte montado da microplaqueta em cima da conclusão do funcionamento.
  12. Retire a junta da microplaqueta do suporte, abra a caixa da microplaqueta em um ângulo 45 °, e remova 100 μL da emulsão do chip em uma placa plástica azul de 96 poços.

4. amplificação de cDNA de célula única. Siga o protocolo do fabricante microfluídicos da microplaqueta35.

  1. Transcrição reversa.
    Nota: Realize esta etapa uma capa limpa de PCR-only para impedir a contaminação microbiana e outra do cDNA não amplificado.
    1. Sele a placa 96-well azul com um selo da folha em um aferidor aquecido da placa.
    2. Execute a reacção de transcrição inversa num termociclador da seguinte forma: 53 ° c para 45 min à 85 ° c para 5 min à 4 ° c Hold.
      Nota: Este é um ponto de parada seguro. As amostras podem segurar em 4 ° c para até 72 h.
  2. Purificação pós-RT
    1. Traga os grânulos magnéticos de ligação do ácido nucleico e os grânulos magnéticos da seleção do tamanho do ácido nucleico à temperatura ambiente e ao Vortex para re-suspender. Neste ponto, descongele o buffer de limpeza de amostra por 10 min a 65 ° c. Traga todos os outros reagentes à temperatura ambiente e ao vortex.
    2. Prepare os bufferes como mostrado nas tabelas 2 e nas tabelas 3.
  3. Quimicamente quebrar a emulsão e purificar.
    1. Para isso, retire suavemente o selo da chapa.
    2. Dispense 125 μL de reagente de quebra de emulsão rosa em cada emulsão. Aguarde 1 min e, em seguida, transfira todo o volume para um tubo de tira 0,2 mL limpo. Certifique-se de que há uma camada de clara e uma camada de rosa no tubo de tira.
    3. Remova 125 μL da camada rosa da parte inferior do tubo de tira sem perturbar a camada clara. É normal para um pequeno volume (~ 15 μL) da camada rosa para permanecer no tubo.
    4. Adicionar 200 μL de mistura de limpeza da tabela 2 ao tubo de tira e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Transfira o tubo de tira para um suporte magnético e deixe a solução limpar. Retire o sobrenadante e descarte, em seguida, lave as contas com 80% etanol duas vezes. Deixe secar os grânulos durante 1 min.
    6. Retire o tubo de tira do íman e adicione 35,5 μL de solução de eluição da tabela 3 aos grânulos. Pipeta para Ressuspender os grânulos na solução. Incubar por 2 min à temperatura ambiente.
    7. Transfira o tubo de tira para um suporte magnético e deixe a solução limpar. Retire o cDNA purificado do tubo de tira e dispense-o para limpar 0,2 mL tubos de strip.
  4. Amplificar o cDNA.
    1. Prepare a mistura mestre de amplificação na tabela 4, abaixo.
    2. Adicionar 65 μL de cDNA amplificação Master Mix a cada amostra. Coloque o tubo de tira em um termociclador e execute o seguinte programa: 98 ° c 3 min à 15 ciclos de [98 ° c 15 s à 67 ° c 20 s à 72 ° c 1 min] à 72 ° c 5 min à 4 ° c Hold
      Nota: Este é um ponto de parada seguro. As amostras podem segurar em 4 ° c para até 72 h.
    3. Purify o cDNA amplificado com os grânulos magnéticos da seleção do tamanho do ácido nucleico de 0.6 x. Lave duas vezes com 80% de etanol e eluir com 40,5 μL.
    4. Execute o controle de qualidade cDNA usando a eletroforese automatizada do gel e o ensaio fluorescência-baseado do quantificação do ADN36,37.
      Nota: Este é um ponto de parada seguro. As amostras podem prender em 4 ° c para até 72 h ou em-20 ° c indefinidamente.

5. sequenciamento de construção da biblioteca

  1. Tagmentation e Clean-up do cDNA38.
    1. Normalize o cDNA para 50 ng em 20 μL do volume total. A quantificação exata é crítica nesta etapa.
    2. Faça a mistura de tagmentation na tabela 5 e alíquota 30 μl a cada 20 μL de cDNA amostra no gelo. Coloque as amostras no termociclador e execute o protocolo de tagmentation: 55 ° c 5 min à 10 ° c Hold.
    3. Execute a limpeza do cDNA tagmented usando colunas38. Adicione 180 μL de tampão de ligação de ADN a cada amostra. Transfira 230 μL para uma coluna de rotação.
    4. Centrifugar a 1300 x g durante 2 min e descartar o fluxo.
    5. Lave duas vezes com 300 μL de tampão de lavagem do ADN. Centrifugue um adicional de 2 min a 1300 x g para garantir a remoção de etanol.
    6. Elute purificou o cDNA tagmented adicionando 31 μL de tampão de eluição à coluna e incubar à temperatura ambiente durante 2 min.
    7. Centrifugue por 2 min a 1300 x g para recuperar o produto purificado.
  2. PCR do índice de amostra.
    1. Escolha códigos de barras que não se sobreponham durante uma execução de sequenciamento multiplexada.
    2. Faça uma mistura mestre do índice de amostra do PCR como mostrado na tabela 6.
    3. Adicionar 60 μL de mistura mestre de PCR de índice de amostra a 30 μL da amostra purificada.
    4. Adicionar 10 μL de um índice de amostra de 20 μM, 4-oligo a cada amostra (índice de registro usado). O volume total de reacção é agora de 100 μL.
    5. Coloc em um ciclador térmico com a tampa ajustada a 105 ° c. Execute o seguinte programa: 98 ° c 45 s à 12-14 ciclos de [98 ° c 20 s à 54 ° c 30 s à 72 ° c 20 s] à 72 ° c 1 min à 4 ° c segure.
      Nota: Este é um ponto de parada seguro. As amostras podem segurar em 4 ° c para até 72 h.
  3. Purify bibliotecas com duplo talão limpar.
    1. Adicione 100 μL de grânulos magnéticos da seleção do tamanho do ácido nucleico à amostra e misture-o completamente com uma pipeta. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Transfira para um íman e deixe-o em pé até a solução limpar. Retire e descarte o sobrenadante.
    3. Lave duas vezes com 200 μL de 80% de etanol.
    4. Seque os grânulos no íman durante 2 min. Retire do íman e adicione 50,5 μL de tampão EB à pelota do talão. Pipeta para re-suspender as contas no buffer.
    5. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min. transfira para um íman e deixe repousar durante 2 min. transferir 50 μL de amostra eluída para um tubo de tira limpo.
    6. Adicionar 40 μL de tamanho de ácido nucleico seleção de grânulos magnéticos para a amostra e incubar à temperatura ambiente por 5 min. transfira para um íman e deixe a solução clara. Remova e descarte o sobrenadante.
    7. Lave duas vezes com 125 μL de 80% de etanol.
    8. Seque os grânulos no íman durante 2 min. Retire do íman e adicione 60,5 μL de tampão EB à pelota do talão. Pipeta para re-suspender as contas no buffer.
    9. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min. transfira para um íman e deixe-o ficar por 2 min. transferir 50 μL de amostra eluída para um tubo de tira limpo. Esta é a biblioteca final.
    10. Segure as amostras a 4 ° c para até 72 h ou a-20 ° c indefinidamente. Observe que este é um ponto de parada seguro.
  4. Quantificar e executar controle de qualidade de bibliotecas finais usando eletroforese automatizada de gel e ensaio de quantificação de DNA baseado em fluorescência36,37. Diluir as amostras 1:10 antes de executar o controle de qualidade.

6. sequenciamento de bibliotecas

  1. Normalize cada amostra a ser seqüenciado a 2 ng/μL e ao pool 3 μL de cada amostra normalizada junto.
  2. Meça a concentração da associação com o ensaio fluorescência-baseado do quantificação do ADN37.
  3. Diluir a piscina para 0,25 ng/μL.
  4. Desnaturem a piscina da seguinte forma: 12 μL de amostra combinada diluída (0,25 ng/μL) + 1 μL de controlo do ADN (1 nM), 2 μL de tampão EB + 5 μL de NaOH (0,4 N). Deixe isso incubar por 5 min, em seguida, adicione 10 μL de 200 mM TRIS pH 8,0.
  5. Carregar 4, 5 μL em 1345,95 μL HT1. Carregue 1,3 mL no cartucho do sequenciador e corra de acordo com as diretrizes do fabricante39 usando uma receita de sequenciamento com 26 ciclos (leia 1) + 8 ciclos (i7 index) + 0 ciclos (índice i5) + 55 ciclos (Leia 2).

7. leitura de alinhamento (arquivo suplementar 1)

  1. Run Cell Ranger (v 2.0.0) para demultiplex RAW base chamada (BCL) arquivos gerados por sequenciamento em arquivos FASTQ. Alinhe os arquivos FASTQ ao conjunto genoma humano B 37,3 e ao modelo do gene UCSC para obter a quantificação da expressão.
  2. Controle de qualidade de alinhamento.
    1. Gere métricas de alinhamento e verifique bases de p30, fração de código de barras válida, fração de leitura associada a células, fração de leitura mapeada e leituras detectadas em cada célula.
    2. Examine o gráfico de classificação de código de barras para certificar-se da separação dos códigos de barras associados a células e do plano de fundo.

8. análise de dados (arquivo suplementar 2)

  1. Controle de qualidade celular e pré-processo.
    1. Exclua células com < 500 genes detectados, < 3000 número total de identificador molecular único (UMI), > 0,2 escore de viabilidade como anteriormente descrito32. Ajuste os pontos de corte de acordo com os tipos de tecidos e células.
    2. Remover doublets.
      1. Avaliar os cinco genes de hormônio endócrino (glucagon- GCG, insulina- ins, somatostatina- SST, polipeptídeo pancreático- PPYe grelina- ghrl) para o padrão de expressão bimodal (modo de alta e baixa expressão) usando R pacote mclust40.
      2. Remova as células que expressam mais de um gene hormonal, ou seja, com dois ou mais genes hormonais no modo de alta expressão.
    3. Normalize a expressão gênica pelo total de UMI e multiplique pelo fator de escala de 10.000 no nível da célula usando o pacote R Seurat41.
    4. Remover genes detectados em menos de 3 células.
    5. Detecte genes variáveis usando a expressão média e a dispersão de todas as células. Ajuste os pontos de corte de acordo com os tipos de tecido e células.
  2. Realize a análise de componentes principais com os genes variáveis. Células de cluster com o número selecionado de componentes principais. Derivar genes enriquecidos de cluster de células comparando um cluster de células com o resto das pilhas.

Resultados

O fluxo de trabalho de sequenciamento de RNA de célula única consiste em três etapas: dissociando ilhotas humanas intactas em suspensão de célula única, capturando células únicas usando uma tecnologia baseada em gotas e analisando dados de RNA-Seq (Figura 1). Em primeiro lugar, as ilhotas humanas adquiridas foram incubadas durante a noite. As ilhotas intactas foram examinadas o microscópio (Figura 2a). A integridade de p...

Discussão

As tecnologias de célula única desenvolvidas nos últimos anos fornecem uma nova plataforma para caracterizar os tipos de células e estudar a heterogeneidade molecular em ilhotas pancreáticas humanas. Nós adotamos um protocolo do isolamento microfluídico da único-pilha da gota-baseado e da análise dos dados para estudar ilhotas humanas. Nosso protocolo produziu com sucesso dados de sequenciamento de RNA de mais de 20.000 células de Ilíadas humanas únicas com variações relativamente pequenas na qualidade da s...

Divulgações

Todos os autores são funcionários e acionistas da Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Agradecimentos

Nenhum

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

Referências

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