Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

Resumo

Modelos ortotópicos de camundongos de melanoma uveal uveal uveal do fígado foram criados usando técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica com esquema tumoral derivado do paciente e técnicas de injeção de agulha com linhas de células de melanoma uveal humana cultivadas.

Resumo

Nas últimas décadas, tumores xenoenxertos subcutâneos implantados no paciente ou linhas de células humanas cultivadas têm sido cada vez mais reconhecidos como modelos mais representativos para estudar cânceres humanos em camundongos imunodeficientes do que a célula humana estabelecida tradicional linhas in vitro. Recentemente, modelos de xenoenxerto tumoral derivados do paciente (PDX) ortotópicos implantados em camundongos foram desenvolvidos para melhor replicar características dos tumores de pacientes. Espera-se que um modelo de camundongo xenoenxerto ortotópico do fígado seja uma plataforma útil de pesquisa sobre o câncer, fornecendo insights sobre biologia tumoral e terapia medicamentosa. No entanto, a implantação do tumor ortotópico do fígado é geralmente complicada. Aqui descrevemos nossos protocolos para a implantação ortotópica de tumores uveal uveal metastáticos derivados do fígado. Nós cultamos linhas de células de melanoma uveal metastático do fígado humano em camundongos imunodeficientes. Os protocolos podem resultar em taxas de sucesso técnico consistentemente altas usando uma técnica de implantação ortotópica cirúrgica com pedaços de tumor de melanoma uveal derivado do paciente ou uma técnica de injeção de agulha com linha de células humanas cultivadas. Também descrevemos protocolos de tomografia computadorizada para detectar tumores hepáticos interiores e para técnicas de reimplantação usando tumores criopreservados para alcançar o reenxerto. Juntos, esses protocolos fornecem uma plataforma melhor para modelos de camundongos tumorais ortotópicos do fígado de melanoma uveal metastático do fígado em pesquisa translacional.

Introdução

O melanoma uveal é o tumor maligno intraocular mais comum entre adultos no mundo ocidental. Nos últimos 50 anos, a incidência de melanoma uveal (5,1 casos por milhão) manteve-se estável nos Estados Unidos^1,2. O melanoma uveal surge de melanócitos na íris, corpo ciliário ou choroide, e é uma doença extremamente letal quando desenvolve metástase. A taxa de mortalidade de pacientes com metástase de melanoma uveal foi de 80% aos 1 ano e 92% aos 2 anos após o diagnóstico inicial das metástases. O tempo entre o diagnóstico de metástases e morte é tipicamente curto, menos de 6 meses, sem levar em conta a terapia^3,4. O câncer se espalha através do sangue e tende a metástase dominante mente para o fígado (89-93%)^4,5. Um modelo eficaz do rato é urgente necessário para uma investigação mais adicional da melanoma uveal fígado-metastática. Para a pesquisa translacional, há uma clara demanda para gerar um modelo de camundongo uveal metastático localizado no fígado.

Espera-se que os modelos de camundongos tumorais derivados do paciente forneçam estratégias de medicamentos individualizados. Estes modelos podem ser preditivos de desfechos clínicos, ser úteis para avaliação de medicamentos pré-clínicos e ser usados para estudos biológicos de tumores^6. Os modelos representativos de PDX são camundongos xenoenxerto supada tumoralmente ectópica, que têm tumor em locais subcutâneos. A maioria dos pesquisadores pode fazer cirurgia para implantação subcutânea sem prática especial^7,8. Eles também podem monitorar tumores subcutâneos facilmente. Embora os modelos PDX subcutâneos se tornaram populares na fase de pesquisa, eles têm alguns obstáculos na mudança para uso prático. Implantação subcutânea força tumores derivados do paciente a enxetorgravura em um microambiente diferente da origem tumoral, de modo que leva à falha do enxerto e ao crescimento lento do tumor ^{9,10,11, 12,13,14.} O enxerto ortotópico pode ser uma abordagem mais ideal e racional para um modelo PDX porque usa o mesmo órgão que o tumor original^15,16.

Recentemente, desenvolvemos protocolos para técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica de tumores de melanoma uveal metastáticos do fígado derivados do paciente e técnicas de injeção de agulha com uma linha de células de melanoma uveal metastático do fígado humano cultivada no NOD. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) ratos^17,18. Os protocolos resultam em taxas de sucesso técnico consistentemente altas. Também estabelecemos técnicas de tomografia computadorizada que são úteis para detectar tumores hepáticos interiores, e desenvolvemos reimplantação de tumores criopreservados na plataforma PDX. Nós encontramos que os modelos uveal do xenograft do melanoma mantêm as características do tumor paciente original do fígado, incluindo suas características histopatológicas e moleculares. Juntas, essas técnicas fornecem uma plataforma melhor para modelos de tumorortópico hepático para melanoma uveal em pesquisatranscional.

Protocolo

Os pacientes inscritos no estudo devem fornecer consentimento por escrito permitindo o uso de amostras cirúrgicas descartadas para fins de pesquisa e estudos genéticos, de acordo com um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional. Este protocolo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Coleção de tecido tumoral fresco derivado do paciente

1. Obtenha o tecido tumoral derivado do paciente a partir de uma cirurgia ou uma biópsia de agulha em uma sala de cirurgia do hospital.
2. Coloque o tecido tumoral em um recipiente de 100 mL contendo a solução de sal equilibrado de Hanks (HBSS) no gelo.
3. Transfira o tecido para um capô estéril (Nível 2 de Biossegurança) em laboratório.
4. Vá para o segundo passo o mais rápido possível.
   Nota: Por razões de segurança, exclua pacientes com infecções conhecidas por HIV ou hepatite B ou C.

2. Processamento de tecido tumoral fresco derivado do paciente

1. Coloque o tecido em um tubo de 50 mL contendo solha soline tampão de fosfato (PBS) no gelo. Para lavar o tecido, adicione PBS no tubo e descarte PBS do tubo duas vezes.
2. Transfira o tecido em uma placa de Petri contendo PBS no gelo.
3. Usando fórceps estéreis e tesouras, retire as partes necróticas do tecido. Mantenha o tecido úmido e frio durante os passos 2,3 a 2,5. Para amostras de biópsia de agulha, pule o passo 2.3 e 2.5, e não corte as amostras.
   Nota: O tecido necrótico muitas vezes se rompe facilmente quando tocado.
4. Corte o tecido em 1 mm³ cubos para implantação hepática cirúrgica.
5. Corte o resto do tecido em cubos de 2 mm na placa de Petri.
6. Transfira-os para um microtubo de 1,7 mm com formalina de 4% para análise histológica e para outro tubo para análise genômica e proteômica.
7. Coloque os microtubos em um frasco de nitrogênio líquido com nitrogênio líquido. Transfira os tubos para um congelador de -80°C para armazenamento permanente.
   Nota: O tempo entre a remoção da amostra do paciente e o processamento do tecido não deve exceder 30 min.

3. Implantação hepática cirúrgica com tecido tumoral derivado do paciente

1. Spray todos os objetos que entram na capa para a cirurgia com 70% de álcool etílno.
   Nota: Isso inclui instrumentos cirúrgicos, almofadas de aquecimento e máquinas de anestesia.
2. Medir o peso de um cotonete e folha de tecido.
3. Anestesiar um rato com um vaporizador de isoflurano de 3 a 5%, colocando-o na câmara de indução.
4. Uma vez que o rato é anestesiado inteiramente, coloc o na posição supine em uma almofada de aquecimento. Coloque o cone isoflurane no cnout do rato para inalar 1,5-3% isoflurane para manutenção de anestesia.
   Nota: O rato precisa de estar na almofada de aquecimento durante o procedimento inteiro. A falta de aquecimento pode causar hipotermia.
5. Confirme a anestesia adequada por nenhuma reação quando o pé do rato é picado com fórceps ultrafinos.
6. Injete buprenorfina (0,6 mg/kg) subcutâneamente no flanco usando uma agulha 27 G em uma micro seringa antes da cirurgia.
7. Aplique 70% de álcool etílico no abdômen e espalhe a pele para cima e para baixo. Depois de espalhar a pele, confirme uma visualização mais fácil da pele abaixo da área subcostal esquerda para um corte mais fácil. Não raspe a pele do abdômen.
   Nota: A pele esconderá o local da incisão após a cirurgia e impedirá que o rato risque a operação do borne da incisão. No entanto, você pode raspar a pele para evitar a infecção do site de incisão de acordo com os padrões institucionais.
8. Aplique o iodo e deixe-o ser absorvido na pele.
9. Coloque uma cortina cirúrgica estéril com um buraco de 2 cm no mouse.
10. Levante a pele abdominal com fórceps ultrafinos curvos e faça uma incisão subcostal esquerda transversal de 1 cm com tesoura curva.
11. Insira a ponta da tesoura curva a pele da incisão e abra-as ligeiramente para separar o peritônio da pele. Retire a tesoura da incisão com lâminas fechadas.
    Nota: Abrir e fechar tesouradentro do rato pode causar danos e sangramento.
12. Localizar o fígado o peritônio. Confirme uma cor avermelhada escura através do peritônio.
13. Com tesoura curva, faça uma incisão transversal de 1 cm no peritônio. Se uma artéria peritoneal sangra da vanguarda, parar imediatamente o sangramento com cautery.
14. Pegue o tecido adiposo usando fórceps ultrafinos curvos com uma mão, insira a borda de um cotonete o lobo do fígado esquerdo e enrole o cotonete para baixo com a outra mão para trazer o fígado.
    Nota: Agarrar o tecido gordo é importante manter o tecido gordo da colagem ao cotonete.
15. Exteriorize o fígado no cotonete e coloque o fígado em uma folha de tecido absorvente não tecido.
    Nota: A folha da tela joga dois papéis essenciais em estabilizar o fígado e em absorver a hemorragia.
16. Faça uma incisão de 5 mm de largura e profundidade usando uma lâmina de bisturi estéril nº 11 para formar um bolso no parenchyma enquanto pressiona suavemente o local da incisão com o cotonete.
    1. Insira a lâmina em paralelo com a superfície do fígado e corte horizontalmente.
    2. Pressione o local da incisão com o cotonete para parar qualquer hemorragia.
       Nota: Não mantenha a lâmina vertical, caso contrário, você vai romper o fígado e ferir grandes vasos no meio do fígado.
17. Enrole o cotonete para cima para abrir o local da incisão e implante um cubo de 1 mm³ de tecido tumoral no bolso com fórceps ultrafinos curvos. Retraia os fórceps enquanto rola o cotonete em rotação reversa e pressionando para baixo.
    Nota: Pressionar para baixo no local da incisão com o cotonete ao retrair os fórceps ajuda a impedir o deslocamento do tumor dentro do bolso.
18. Tire delicadamente o cotonete do local da incisão após a implantação. Avance para a etapa 3.19 o mais rápido possível.
19. Coloque um hemostat absorvível no local da incisão.
20. Confirme a hemostasis. Se o sangramento continuar, adicione mais hemostat no local da incisão.
21. Descasque o fígado fora da folha de tecido com fórceps (de preferência sem corte) e coloque o fígado de volta na cavidade abdominal.
22. Suture peritoneum com dupla ligadura usando 5-0 sutura absorvível.
23. Sutura de pele com ligadura tripla usando 5-0 sutura absorvível.
    Nota: A ligadura tripla ajuda a impedir a dehiscência da incisão cirúrgica.
24. Observe o mouse até ficar completamente acordado e colocá-lo de volta na gaiola.
25. Medir o peso do cotonete e da folha de tecido com sangue para o volume de sangramento durante a cirurgia. Compare-os com seus pesos originais antes da cirurgia. Reduzir o sangramento durante a cirurgia para menos de 10% do volume de sangue circulante no mouse.

4. Coleta e processamento de cultura do fígado humano metastático Uveal Melanoma Cell Line

1. Prepare as células cultivadas.
2. Coletar células e calcular o número de células usando um contador de células.
3. Prepare uma quantidade apropriada de suspensão celular para 10,0 x 10⁶ células em um tubo de 15 mL.
4. Gire o tubo a 300 x g por 5 min em uma centrífuga à temperatura ambiente.
5. Retire o supernatant no tubo de 15 mL. Deixe a pelota celular na parte inferior do tubo.
6. Adicione 50 μL de RPMI 1640 médio em um tubo de 1,7 mL.
7. Corte a ponta de uma ponta de 200 μL com tesoura para ampliar a abertura da ponta.
8. Adicione 60 μL da matriz da membrana do porão usando uma pipeta com a ponta de corte no tubo de 1.7 mL que tem RPMI.
9. Misture RPMI e matriz no tubo de 1,7 mL. Vórtice-lo.
10. Adicione 110 μL da mistura na pelota celular no tubo de 15 mL. Transfira a suspensão celular para um novo tubo de 1,7 mL.
11. Mantenha o tubo no gelo antes da injeção da agulha.

5. Implantação cirúrgica da agulha da linha de pilha metastática metastática cultivada da pilha de Uveal do fígado no fígado

1. Siga o protocolo acima das etapas 3.1 a 3.15.
2. Recolher a suspensão celular com uma microseringa com uma agulha 27 G.
3. Insira a agulha ao longo da superfície do fígado e avançar a ponta da agulha 5 mm mais profundo.
4. Injetar 20 μL de suspensão celular no fígado.
5. Cauterizar o ponto de inserção do fígado para evitar que as células injetadas vazem. Confirme a hemostasis.
6. Siga o protocolo acima das etapas 3.21 a 3.24.

6. Tomografia computadorizada

1. Coloque o rato em um contidor no estado acordado.
2. Limpe a cauda com uma almofada de álcool estéril para desinfecção e vasodilatação.
3. Injete 100 μL de agente de contraste tc na veia da cauda com uma agulha de 27 G em uma seringa de 1 mL.
4. Aguarde 4 h após a injeção antes de fazer a tomografia computadorizada.
   Nota: Leva 4 h até que o agente é levado por células de fígado Kupffer.
5. Quatro horas após a injeção, anestesiao o rato tumor-rolamento com isoflurane vaporizado de 3-5% coloc o na câmara da indução.
6. Uma vez que o mouse é totalmente anestesiado, coloque-o na posição propensa em um CT. Coloque o cone isoflurane no mirante do mouse para inalar isoflurane de 1,5-3% para manutenção de anestesia.
7. Confirme a anestesia adequada por nenhuma reação quando o pé do rato é picado com fórceps ultrafinos.
8. Faça uma tomografia por 15 min.
9. Certifique-se de que o mouse até que seja totalmente despertado após a tomografia computadorizada e colocá-lo de volta na gaiola.
10. Avalie a existência do tumor e meça o tamanho do tumor nas imagens de TC.
    Nota: O agente de contraste melhora o parenchyma normal do fígado de modo que seja fácil reconhecer o tumor não realçado. Não interprete mal a vesícula biliar e o estômago como tumor.

7. Tecido de colheita e processamento

1. Eutanásia ratos usando CO₂ seguido de deslocamento cervical, colocando o dedo indicador e polegar atrás do crânio e puxando o corpo pela base da cauda. Avance para o passo 7.2 o mais rápido possível.
2. Coloque o mouse em uma posição supina e pulverizar o abdômen com 70% de álcool etílno.
3. Use fórceps estéreis e tesouras estéreis para fazer uma incisão transversal de 3 cm abaixo do processo xifórido para expor os órgãos abdominais.
4. Extirpar o tecido tumoral e realizar etapas 2.1 a 2.2.
5. Corte o resto do tumor em cubos de 2 mm na placa de Petri.
6. Transfira-os para um tubo criogênico com criomémetro para reimplantação após criopreservação.
7. Coloque os tubos em um recipiente de congelamento criogênico cheio de isopropanol.
8. Transfira o recipiente para um congelador de -80°C para armazenamento temporário. Não coloque os criotubos com criomémetro diretamente em um tanque de nitrogênio líquido. Congelá-los lentamente a uma taxa de resfriamento de -1 °C/min para preservar o tecido tumoral.
9. No dia seguinte, transfira os tubos para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento permanente.

8. Reimplante

1. Mantenha os tubos congelados em um frasco líquido de nitrogênio com nitrogênio líquido até que esteja pronto para implantar tecido. Minimize a exposição do tecido à temperatura ambiente para manter a viabilidade e aumentar as chances de enxerto.
2. Descongele tubo criopreservado em um banho de água de 37 °C.
3. Executar etapas 2.2-2.4.
4. Implante o tumor descongelado em camundongos, conforme descrito nos passos 3.1-3.24.

Resultados

A implantação ortotópica cirúrgica usando o método do bolso do fígado pode transplantar o tumor uveal metastático da melanoma do fígado humano no fígado do rato com uma taxa de sucesso elevada de 80% dentro de seis meses. O tumor xenoenxerto enenxertos no fígado como um tumor solitário sem nódulos filha (Figura 1 e Figura 3A). A técnica cirúrgica de injeção ortotópica no fígado usando microagulhas enenxertou com...

Discussão

Os modelos ortotópicos atuais do xenograft são labor-intensive, demorados, e caros criar. Modelos de camundongos xenoenxerto de tumor ortotópico para câncer de fígado foram estabelecidos há mais de duas décadas há^19,20,21. No entanto, esta técnica é complicada e requer o uso de equipamentos especiais, como um suporte de microagulha e 6-0 a 8-0 suturas finas um microscópio. Tumor e tecido hepático normal devem ser cos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent)	Miltenyl Biotec	130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium	Corning	21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver			All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane	Purdue Products	67618-150-17
Isopropanol	Fisher scientific	A416-1	Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC	BD	354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Lab	5557	4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium	Corning	21-031-CM
RPMI 1640	Corning	10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Nice-Pak products	B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution	Wako	163-20145
70% Ethyl alcohol solution	Fisher Scientific	04-355-122
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Absorbable hemostat	Johnson and Johnson	63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery	Bovie Medical	MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container	NALGENE	5100-0001
Cryotube	SARSTEDT	72.379
Curved scissors	World Precision Instruments	503247
Curved ultrafine forceps	World Precision Instruments	501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister	Harvard Apparatus	600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer	Artisan Scientific	66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar	Thermo Fisher Scientific	2123
Micro-CT scan	Siemens
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood			Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel	AD Surgical	A300-11-0
Straight forceps	World Precision Instruments	14226
Surgical drape
Tail vein restrainer	Braintree Scientific	TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle	BD	309623
1.7 mL tube	Bioexpress	C-3260-1
5-0 PDO Suture	AD Surgical	S-D518R13
15 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9152N
27 G needle	BD	780301
27 G needle	Hamilton	7803-01
50 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9502N
50 µL micro syringe	BD	80630
50 µL micro syringe	Hamilton	7655-01
100 mL container	Fisher Scientific	12594997
200μL tip