Identificando mutações por derretimento de alta resolução em uma população de lavando de arroz

Resumo

Neste artigo, nós apresentamos o protocolo que é descrito como a análise de derretimento de alta resolução (HRM)-baseou as lesões locais induzidas alvo nos genomes (TILLING). Este método utiliza mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN e é apropriado para a seleção da elevado-produção da inserção/apagamento (Indel) e da única base cifras (SBS).

Resumo

As lesões locais induzidas alvo em genomes (TILLING) são uma estratégia da genética reversa para a seleção da elevado-produção de mutações induzidas. Entretanto, o sistema de TILLING tem menos aplicabilidade para a deteção da inserção/apagamento (Indel) e o TILLING tradicional precisa etapas mais complexas, como a digestão do nuclease do CEL I e a electroforese do gel. Para melhorar a eficiência da produção e da seleção, e para fazer a seleção dos indels e das Substitions de base únicas (SBSs) possíveis, um derretimento High-Resolution novo (HRM)-baseou o sistema de LAVRAMENTO é desenvolvido. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado de HRM-TILLING e mostramos sua aplicação na seleção da mutação. Este método pode analisar as mutações de amplicões do PCR medindo a desnaturação do ADN dobro-encalhado em altas temperaturas. A análise de HRM é executada diretamente borne-PCR sem processamento adicional. Além disso, um método simples, seguro e rápido da extração do ADN (SSF) é integrado com HRM-TILLING para identificar indels e SBSs. Sua simplicidade, robustez e alta taxa de transferência torná-lo potencialmente útil para a mutação de digitalização em arroz e outras culturas.

Introdução

Mutantes são importantes recursos genéticos para a pesquisa de genômica funcional de plantas e criação de novas variedades. Uma aproximação da genética para diante (isto é. da seleção do mutante ao clonagem do gene ou ao desenvolvimento da variedade) usou-se para ser o método principal e único para o uso de mutações induzidas aproximadamente 20 anos há. O desenvolvimento de um novo método de genética reversa, o TILLING (direcionamento de lesões locais induzidas em genomas) por McCallum et al.¹ , abriu uma nova paradigma e desde então tem sido aplicado em um grande número de espécies de animais e plantas². O TILLING é particularmente útil para as características de reprodução que são tecnicamente difíceis ou dispendiosas de serem determinadas (por exemplo, resistência a doenças, conteúdo mineral).

A lavagens foi inicialmente desenvolvida para as mutações do ponto de triagem induzidas por mutagénicos químicos (por exemplo, EMS^1,3). Inclui as seguintes etapas: o estabelecimento de uma população (s) de TILLING; Preparação de DNA e agrupamento de plantas individuais; Amplificação do PCR do fragmento do ADN do alvo; formação de heteroduplexes por desnaturação e recozimento de amplicões e clivagem de PCR por nuclease de cel I; e identificação de indivíduos mutantes e suas lesões moleculares específicas^3,4. No entanto, esse método ainda é relativamente complexo, demorado e de baixa taxa de transferência. Para torná-lo mais eficiente e com maior produtividade, muitos métodos de lavo modificados foram desenvolvidos, como o apagamento da lavagem (de-lavagem) (tabela 1)^{1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12}.

A análise da curva de HRM, que é baseada em mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN, é um método simples, cost-effective, e high-throughput para a seleção da mutação e genotipagem¹³. A HRM já foi amplamente utilizada na pesquisa vegetal, incluindo o TILLING baseado em HRM (HRM-TILLING) para a triagem das mutações do SBS induzidas pela mutagenese do EMS¹⁴. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados de HRM-TILLING para a seleção das mutações (Indel e SBS) induzidas por raios da gama (γ) no arroz.

Protocolo

1. os preparativos

1. Desenvolvimento de populações mutagenizadas com raios γ
   1. Trate aproximadamente 20.000 sementes secadas do arroz (com índice de umidade de CA. 14%) de uma linha de arroz japonica (por exemplo, DS552) com raios gama ¹³⁷Cs em 100 GY (1 GY/min) em uma instalação de irradiação γ (por exemplo, célula gama).
      Nota: as sementes utilizadas para o tratamento devem ter uma elevada viabilidade (por exemplo, com uma taxa de germinação > 85%). A dose de irradiação para o arroz indica pode ser aumentada para 150 GY.
   2. Semear as sementes irradiadas após a germinação em um leito de mudas e transplante de mudas individualmente para um campo de arroz e crescer na população M₁ .
      Nota: a semeadura direta de M₁ plantas escassamente poderia igualmente ser aplicada para conservar o custo labor. Impeça o cruzamento de plantas de M₁ com outras variedades do arroz usando meios físicos ou biológicos da isolação.
   3. Granel-colheita M₂ sementes do m₁ plantas, com 1-2 sementes de cada m₁ pânico, para formar um m₂ população.
      Nota: na prática e para a simplicidade, colher todas as sementes de plantas de M₁ e após a mistura inteiramente, uma parcela é amostrada para formar uma população de m₂ .
   4. Mergulhe cerca de 5.000 M₂ sementes em água para 24 (indica arroz)-36 (arroz japonica) h à temperatura ambiente. Em seguida, deixe as sementes germinar a 37 ° c por 2 dias em papel filtro úmido em placas de Petri.
      Nota: mais sementes de M₂ podem ser germinadas para análise para aumentar a probabilidade de identificar mutantes.
   5. Coloc as sementes germinadas aos painéis de semeadura com furos pequenos e cresça-os hydroponically por 3-4 semanas em uma solução da cultura modificada de Yoshida et al.¹⁵ em uma estufa com um fotoperíodo de 12 h [° c do dia (30 ± 2) e a noite (24 ± 2) ° c].
2. Amostragem de tecidos foliares: corte um disco (Φ ~ 2 mm) da folha totalmente estendida de cada semeadura na mesma posição usando um perfurador de furo.
3. Preparação de soluções de extração de DNA
   1. Tampão A: adicionar 2 mL de NaOH de 5 M e 10 mL de 20% de Tween 20 para fazer o volume final de 50 mL. Prepare recentemente o tampão A antes da extração do ADN.
   2. Tampão B: Adicionar 20 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0) e 80 μL de 0,5 M de EDTA para fazer um volume final de 100 mL.
4. Primers de PCR
   1. Primers para análise de HRM: iniciadores de projeto para amplificação da seqüência de destino usando software (por exemplo, primer Premier5) e sintetizar por uma empresa comercial.
      Nota: porque HRM é menos aplicável à análise de fragmentos longos, e daqui, os amplicões devem ser menos do que 400 BP. fragmentos com muito alto (> 75%) ou muito baixa (< 25%) O conteúdo de GC também não é bom para análise de HRM.
   2. Primers para controle de qualidade: Use os 24 marcadores SSR distribuídos nos 12 cromossomas de arroz de Peng et al.¹⁶.

2. extração de DNA

1. Coloc 4 discos da folha em cada poço de uma placa do PCR 96-well, adicione A solução do amortecedor A (50 mL/well). Congelar a placa num congelador de-80 ° c durante 10 min.
2. Descongelar a placa à temperatura ambiente e, em seguida, incubar a 95 ° c durante 10 min.
3. Adicionar 50 μL de tampão B a cada poço e misturar bem por vortexing.
4. Centrifugar a placa durante 1 min a 1.500 x g. O sobrenadante está pronto para a PCR.

3. amplificação do PCR

1. Otimização de PCR
   1. Adicione os seguintes reagentes a cada PCR bem: 1 μL de ADN (o sobrenadante no passo 2,4), 5 μL de 2x Master Mix (contendo 2x tampão PCR, 4 mmol/L MgCl₂, 0,4 mmol/l 2 '-desoxirribonucleosídeo trifosfatos (dNTPs) e 50 U/ml TAQ DNA polimerase, 0,2 μl cada um de 10 iniciadores μmol/L e faça um volume final de até 10 μL usando água livre de nucleases.
   2. Use um bloco térmico capaz de gradiente para determinar a temperatura de recozimento ideal para cada fragmento alvo usando o seguinte programa de PCR: 5 min a 94 ° c, seguidos por 40 ciclos de 30 s a 94 ° c, 30 s a 52-62 ° c (temperatura de gradiente) e 30 s a 72 ° c , com uma extensão final em 72 ° c por 8 minutos e uma preensão em 16 ° c.
   3. Examine os amplicões em géis do agarose de 1% para a determinação da temperatura óptima do recozimento.
      Nota: uma temperatura óptima de recozimento deve permitir a amplificação específica do fragmento alvo, sem amplificação inespecífica e dimerização da cartilha.
2. PCR para análise de HRM
   Nota: as placas compatíveis com HRM e o DNA de mudas de M₂ extraídos conforme descrito na etapa 2,4 são usados para PCR.
   1. Executar PCRs em um volume final de 10 μL, com 1 μL de DNA (sobrenadante), 5 μL de 2x Master Mix, 0,2 μL cada um dos 10 primers μmol/L e 1 μL de corante de fluorescência 10x. Em cada placa incluem um tipo selvagem (WT) pai amostra e um negativo (sem DNA) controle.
   2. Adicione uma gota de óleo mineral a cada poço para evitar a evaporação.
   3. Selar a placa com película adesiva e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min.
   4. Execute o PCR usando a temperatura de recozimento otimizada.
      Nota: em alguns casos, a tintura da fluorescência pode afetar a amplificação do PCR, daqui o corante é adicionado após a conclusão do PCR. Nesses casos, o corante é incorporado em fios de DNA por desnaturação pós-PCR e recozimento.

4. digitalização de HRM e confirmação de mutação

1. Retire a película adesiva da placa e insira a placa numa máquina HRM.
2. Selecione nova execução no menu arquivo ou pressione o botão executar na parte superior da tela.
3. Especifique as temperaturas inicial e final para o derretimento de 55 ° c a 95 ° c.
   Nota: após a primeira execução, o intervalo de temperatura de fusão pode ser determinado para um fragmento específico; daqui, a temperatura do derretimento pode ser ajustada para a análise subseqüente do mesmo fragmento para conservar o tempo.
4. Selecione amostras para análise de fusão de alta resolução, exclua amostras semelhantes ao controle negativo.
5. Normalize as curvas de fusão para ter a mesma fluorescência inicial e final. Confirme visualmente se os cursores de temperatura inferior mínimo e inferior máximo estão em uma região das curvas.
6. Mantenha o nível ∆ F (diferença de fluorescência) na configuração padrão de 0, 5.
7. Selecione o Common versus Variant da lista de seleção de padrões e escolha a sensibilidade normal .
8. Use o WT como o controle; as amostras com um valor de ∆ F de ≥ 0, 5 do WT são consideradas para conter a planta do mutante.
9. Identificação e confirmação de plantas mutantes.
   1. Identifique as quatro plantas, de que cada pool do mutante foi feito.
   2. Extraia o DNA de cada uma dessas plantas usando um método CTAB de acordo com Allen et al.¹⁷ com algumas modificações.
      Nota: RNase livre de DNase e NaAc não são usados ao extrair o ADN usando o método de CTAB descrito por Allen et al.¹⁷, porque a qualidade do ADN é boa bastante para uma amplificação mais adicional do PCR. Ajuste o DNA para uma concentração final de ~ 25 ng/μL após a quantificação usando um espectrofotômetro.
   3. Amplifique o fragmento alvo usando primers de PCR e programe o mesmo que para a análise de HRM.
   4. Identifique lesões moleculares específicas por sequenciamento de Sanger dos amplicons.
      Nota: uma vez que a conclusão da amplificação do PCR, emite os amplicões a uma companhia para arranjar em seqüência de Sanger. A lesão molecular pode ser identificada comparando-se as sequências entre a planta M₂ e o peso.

5. controle de qualidade de mutantes selecionados com marcadores moleculares

1. Realize a PCR para os 24 marcadores SSR em um volume final de 10 μL com 25 ng de DNA genómico (extraído usando o protocolo CTAB), 5 μL de mistura Master 2x, 0,2 μL de cada um dos primers SSR de 10 μM.
2. Execute o PCR usando o seguinte programa: 5 min a 94 ° c, seguidos por 30 ciclos de 30 s a 94 ° c, 30 s a 55 ° c e 30 s a 72 ° c, com uma extensão final a 72 ° c por 7 min.
3. Separe os amplicões em géis de poliacrilamida a 8% e revele polimorfismo de fragmentos amplificados por coloração prateada¹⁸.
4. Compare os haplótipos SSR de variantes selecionadas e o WT.
   Nota: os mutantes induzidos têm frequentemente haplótipos de SSR idênticos a seu WT, se mais de um marcadores SSR são diferentes entre uma variação e o WT, a variação é altamente provável ser um contaminante genético (por exemplo, uma mistura ou uma planta outcruzou) um pouco do que um induzido mutante¹⁸.

Resultados

Análise e digitalização de HRM

No total, 1.140 amostras de DNA agrupadas de 4.560 M₂ mudas foram produzidas e submetidas à amplificação de PCR. Dois fragmentos com o tamanho de 195 BP e 259 BP foram amplificados para OsLCT1 e SPDT, respectivamente (tabela 2). A maioria das amostras apresentou curvas de fusão não significativamente diferentes do WT (ΔF < 0, 5). Curvas de HRM significativamente diferentes do WT (ΔF > 0, 5) ...

Discussão

O TILLING provou ser uma poderosa ferramenta genética reversa para identificar mutações induzidas para a análise funcional do gene e a criação de culturas. Para algumas características que não são facilmente observadas ou determinadas, a TILLING com detecção de mutação baseada em PCR de alta taxa de transferência pode ser um método útil para obter mutantes para diferentes genes. O método HRM-TILLING tem sido utilizado em populações EMS-mutagenizadas de tomate¹², trigo

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2× Taq plus PCR Master Mix	Tiangen, China	KT201	PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate	Bio-rad, America	MSP-9651	Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus	Eppendorf, German	6333000073	PCR amplification
LightScanner	Idaho Technology, USA	LCSN-ASY-0011	For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0	Idaho Technology, USA		For analysis of the fluorescence change
EvaGreen	Biotium, USA	31000-T	Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000	Thermo Scientific, USA	ND2000	For DNA quantification