Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Resumo

Este estudo esboça medidas quantitativas do tamanho e da localização sináptica, da morfologia do músculo, e da forma mitochondrial em C. elegans usando ferramentas livremente disponíveis do processamento de imagem. Esta aproximação permite que os estudos futuros em C. elegans comparem quantitativamente a extensão de mudanças estruturais do tecido e do organela em conseqüência das mutações genéticas.

Resumo

A definição dos mecanismos celulares subjacentes à doença é essencial para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Uma estratégia freqüentemente usada para desvendar esses mecanismos é introduzir mutações nos genes candidatos e descrever qualitativamente as alterações na morfologia dos tecidos e organelas celulares. Entretanto, as descrições qualitativas não podem capturar diferenças fenotípicas sutis, podem deturpar variações fenotípicas em indivíduos de uma população, e são freqüentemente avaliadas subjetivamente. Aqui, abordagens quantitativas são descritas para estudar a morfologia dos tecidos e organelas no nematódeo Caenorhabditis elegans usando microscopia confocal de varredura a laser combinada com software de processamento de bioimagem disponível comercialmente. Uma análise quantitativa de fenótipos que afetam a integridade da sinapse (tamanho e níveis de fluorescência integrados), desenvolvimento muscular (tamanho da célula muscular e comprimento do filamento da miosina) e morfologia mitocondrial (circularidade e tamanho) foi realizada para entender os efeitos das mutações genéticas nestas estruturas celulares. Essas abordagens quantitativas não se limitam às aplicações aqui descritas, pois poderiam prontamente ser utilizadas para avaliar quantitativamente a morfologia de outros tecidos e organelas no nematoide, bem como em outros organismos modelo.

Introdução

O nematódeo Caenorhabditis elegans (C. elegans) é cada vez mais utilizado como um sistema modelo para desvendar os processos biológicos e moleculares envolvidos na doença humana. Um nematódeo adulto tem um comprimento de corpo de pouco mais de 1 mm, e pode produzir uma grande ninhada de até 300 ovos¹. Após a eclosão, C. elegans só exigem 3-4 dias para atingir a idade adulta, e viver por cerca de 2 a 3 semanas². Devido à sua facilidade de cultivo, C. elegans é atualmente um dos modelos animais mais procurados in vivo para a realização de triagem de drogas rentável e rápida para identificar terapêutica para doenças humanas. Adicionalmente, sua conservação genética, paradigmas comportáveis bem definidos, corpo transparente para a fluorescência ou a microscopia de luz, e a facilidade da manipulação genética fazem o estudo de conseqüências celulares e moleculars de mutações genéticas prontamente achieveable ³. o genoma C. elegans compartilha aproximadamente 60-80% de ortologia com genes humanos, e cerca de 40% desses genes são conhecidos como relacionados à doença. Algumas das doenças humanas que foram modeladas e estudadas em C. elegans incluem distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth), doenças associadas ao músculo ( Distrofia muscular de Duchenne) e doenças metabólicas (hiperglicemia)^2,4. Na maioria dos distúrbios humanos, ocorre a localização celular e organela induzida por doenças e alterações morfológicas, que podem ser prontamente avaliadas no modelo de nematódeos.

Os marcadores fluorescentes têm sido amplamente utilizados para rotular tecidos e organelas para visualização dinâmica o microscópio. No entanto, em C. elegans, os métodos convencionais que avaliam as irregularidades morfológicas devido a mutações genéticas têm se invocado em grande parte nas descrições visuais. Embora as avaliações qualitativas possam abranger faixas mais amplas de descrições fenotípicas (morfologia sináptica, aglutinamento de GFP, forma axonal específica, espessura da fibra muscular, etc.) e proporcionam uma visão ocular das alterações morfológicas, elas são menos adequadas para comparando pequenas variações entre diferentes grupos. Além disso, as avaliações qualitativas são baseadas na avaliação visual, subjetiva, que pode conduzir a excesso ou subestimativas de anomalias morfológicas. Finalmente, as observações qualitativas também podem variar muito entre os indivíduos, criando dificuldades com a replicação de dados.

Nos últimos anos, um número de algoritmos computacionais de fácil utilização e prontamente disponíveis que podem analisar quantitativamente as imagens foram desenvolvidas. No entanto, a utilização de tal software de análise de imagem para alguns estudos morfológicos, especialmente em relação aos músculos da parede corporal e mitocôndria, em C. elegans Research tem se atrasado. Para melhorar a análise estrutural subjacente em C. elegans, algumas das prontamente disponíveis, software de análise de imagem de código aberto foram trialed para comparar quantitativamente os efeitos das mutações genéticas na mitocôndria muscular, músculo da parede do corpo e sináptica Morfologia. Estes procedimentos experimentais esboçam em detalhe como estes programas (Fiji, ilastik, cellprofiler, squassh) podem ser usados para avaliar mudanças no tamanho sináptica e na localização da proteína sináptica, na área do músculo da parede do corpo e no comprimento da fibra, e no tamanho mitochondrial e circularidade como resultado de mutações genéticas no nematoide.

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Protocolo

1. crescimento e manutenção de cepas de C. elegans

1. Sementes de meio de crescimento de nematódeos (NGM, ver tabela de materiais) placas de agar com 300 μl da estirpe de E. coli de crescimento lento OP50 em um armário de fluxo laminar.
2. Deixe as placas de agar NGM no gabinete de fluxo laminar para secar.
   Nota: na ausência de armário do fluxo laminar, as placas podem ser deixadas para secar no banco mas são mais propensas à contaminação.
3. Transfira pelo menos 20 animais para cada uma das duas placas de agar NGM OP50-semeadas para ter estoques de trabalho. Há duas maneiras principais de transferir animais.
   1. Picking: Levante suavemente os animais usando uma picareta esterilizada por calor. Este método é eficaz para selecionar animais individuais ou múltiplos de uma placa de agar. Ter um pequeno arranhão de bactérias na ponta quando a colheita ajuda a transferência.
      Nota: uma picareta é feita de um pequeno pedaço de fio de platina cerca de 4 cm de comprimento que é incorporado em uma pipeta de vidro, com a ponta do fio achatado para ser ' Spear-like '. Aqueça-esterilize a picareta entre a colheita para impedir a contaminação cruzada.
   2. CHUNKING: usando uma espátula esterilizada, corte um pequeno quadrado de agar contendo os animais de uma placa e transferido de cabeça para baixo para uma nova placa.
      Notas: Este método é geralmente útil para a transferência de um grande número de vermes, e para remover a contaminação de placas através de várias rodadas de CHUNKING não-contaminado agar. Evite a contaminação cruzada flamejando a espátula por alguns segundos e imersando a espátula em 100% de etanol entre as transferências. A transferência de placas com fome não é recomendada, pois a inanição e a superlotação podem afetar a saúde e a morfologia das estruturas celulares e subcelulares.
4. Manter os vermes em temperatura de crescimento padrão (20 ° c). Para assegurar a fonte contínua de sem-fins well-FED, transfira os sem-fins às placas OP50-semeadas novas cada 2 a 3 dias.

2. idade-sincronizando C. elegans

1. Manter os vermes em 3-4 placas NGM até que a população está lotado, mas não faminta.
2. Lave suavemente os vermes da placa NGM com a solução M9. Os ovos permanecerão no prato, uma vez que se ater ao E. coli OP50. Repita com quatro etapas adicionais da lavagem para remover todos os animais chocados.
3. Permitir que os vermes para eclodir para 40 min.
4. Adicione 1-2 mL de solução M9 à placa e Gire suavemente para soltar os vermes recém-eclotos.
5. Colete a solução M9 com vermes recém-nascidos e transfira a solução com vermes para uma placa NGM fresca.
6. Permita que a solução M9 evate expondo a placa NGM ao ar. Faça isso adjacente a uma chama aberta para evitar a contaminação da placa NGM.
7. Cresça os sem-fins por 27 h em 20 ° c para permitir o desenvolvimento no terceiro estágio larval (L3). Para os animais adultos velhos sincronizados de 3 dias, os sem-fins são escolhidos no estágio larval 4, e crescidos por mais 3 dia para alcangar o estágio adulto idoso de 3-Day.

3. preparação de lâminas para imagens

1. Prepare o estoque de agarose 3-4% w/v em um frasco de microondas seguro (3-4 g em 100 mL de água ultrapura).
   Nota: o agar pode ser usado no lugar do agarose na mesma concentração.
2. Derreta o agarose cuidadosamente em um forno de microondas, tomando cuidado para não ferver, até que todos os agarose dissolve (solução clara). Mantenha a solução a 70 ° c para evitar a solidificação.
   Nota: o estoque de agarose pode ser usado várias vezes. Reaqueça antes de usar se o agarose solidified.
3. Usando uma pipeta de Pasteur, coloc uma gota do agarose derretido em uma corrediça do microscópio.
   Nota: Evite ter bolhas de ar na gota de agar como estes perturbar a integridade da almofada.
4. Pressione imediatamente a gota do agarose com uma outra corrediça do microscópio, aplaando delicadamente o agarose em uma almofada entre as duas corrediças.
   Nota: quaisquer bolhas restantes devem ser removidas nesta fase. Se não, os novos slides devem ser feitos como os animais podem facilmente ficar preso nas bolhas. Evite transbordamento de agar para o lado ao pressionar o slide.
5. Deixe a agarose secar durante 1 min.
6. Separe cuidadosamente os dois slides para evitar danos ao agarose, deixando a almofada solidificada em uma das lâminas.
   Nota: as corrediças com almofadas do agarose devem sempre ser preparadas frescas apenas antes do experimento como podem secar para fora. Certifique-se que a almofada do agarose tem uma espessura consistente. Não deve haver bolhas de ar ou rachaduras no pad, pois isso pode interferir com a imagem.
7. Adicionar uma pequena gota (5-10 μL) de 0, 5% cloridrato de tetramisole (anestésico) para o centro da almofada de agarose.
8. Usando a picareta calor-sterilized, transfira rapidamente aproximadamente 10 – 15 animais da placa de estoque à gota do anestésico antes que a solução seque para fora. Evite transferir muito bactérias OP50, pois isso torna a solução turva, que pode interferir com a imagem.
   Nota: se a solução anestésica secar durante a colheita, basta Pipetar uma segunda gota de 0, 5% de cloridrato de tetramisole para os animais. Os animais tendem a colocar em seu lado lateral na solução anestésica.
9. Aplique uma lamínula posicionando-a logo acima da almofada de agarose e deixando-a cair suavemente. Isso impedirá a formação de bolhas. Não aplique pressão na lamínula, pois isso pode esmagar os animais.
10. Rotule os slides com o nome de deformação.

4. avaliando a morfologia sináptica

Nota: os efeitos da superexpressão do MEC-17 sobre a integridade da sinapse nos neurônios do receptor de toque do microtúnico lateral posterior (PLM) foram estudados quantificando o tamanho e a localização sináptica usando microscopia confocal de varredura de linha. Os neurônios PLM (incluindo as regiões sinápticas) foram visualizados usando o transgene uIs115 (PMEC-17:: tagRFP) (Strain: TU4065⁵) e a região sináptica foi especificamente rotulada com jsIs37 (PMEC-7:: SNB-1:: GFP) (estirpe: NM664 ⁶. º) . Este estudo foi realizado em animais sincronizados L3 não transgênicos e transgênicos da cepa extracromosomal MEC-17 superexpressão BXN507 [cjnEx036 (PMEC-4:: MEC-17, pmyo-2:: mcherry); jsIs37; uIs115]⁷. Uma lista completa de cepas utilizadas neste estudo está incluída na tabela 1.

1. Imagem latente confocal de sinapses do neurônio do receptor do toque
   1. Para a imagem das regiões sinápticas, use uma linha de varredura confocal microscópio acoplado a um 488 nm e 552 nm opticamente bombeado semi-condutor laser de diodo e equipado com software de captura de imagem.
   2. Localize os worms usando a menor ampliação.
   3. Quando os animais estão situados com sucesso, mude para uma ampliação de 40X e aplique o meio de imersão (neste estudo: um objetivo multiimersivo de 40X/1.10 HC PL APO CS2 com imersão em água foi usado).
   4. Visualize a região sináptica, excitando os fluoróforos com um laser de 488 nm (2% de potência) para o fluoróforo GFP e 552 nm (1% de potência) para o fluoróforo tagrfp.
   5. Determine o quadro x e y ideal para capturar toda a região sináptica. Certifique-se de considerar o tamanho ideal do pixel ao selecionar o quadro. Neste estudo, obteve-se um tamanho de pixel consistente de 56 nm.
   6. Capture imagens usando um detector de fotos híbrido e defina os ganhos para evitar a superexposição dos fluoróforos (100% para a excitação de 488 nm e 15% para a excitação de 552 nm).
   7. Colete imagens z-Stack para cobrir toda a sinapse, usando o tamanho ideal da etapa z, dependendo do objetivo específico usado. Neste estudo, foi utilizado um tamanho de z-Step ideal de 0,211 nm.
      Nota: Assegure-se de que todas as imagens sejam tomadas condições rigorosas para permitir a quantificação e comparação de fluorescência integrada. Isto pode ser feito mantendo os parâmetros da microscopia idênticos através de todas as imagens capturadas (isto é, ajustes do laser e do detector, tamanho do pixel, velocidade da exploração, e tamanho óptimo da z-etapa). As configurações ideais dependem do objetivo e podem ser calculadas usando programas de Bioinformática acessíveis, como a calculadora de Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). Etiquetas de imagens sistematicamente, isso será útil ao usar software de Bioinformática que irá organizar e processar arquivos com base no nome do arquivo.
2. Quantificação da região sináptica
   1. Para analisar a região sináptica, exporte imagens como arquivos TIFF. O software de processamento de imagens baseado em Java, como o ImageJ, pode ser usado (neste estudo, a macro de conversão de imagem de RM no ImageJ foi usada).
   2. O tamanho e os níveis de intensidade de fluorescência integrados das sinapses foram medidos a partir da intensidade de soma das pilhas z obtidas com CellProfiler-3.1.5. Carregue as imagens no software CellProfiler 3.1.5. Se necessário, as imagens podem ser filtradas com base em nomes de arquivo de imagem.
   3. Configure o módulo nome e tipo. Opcionalmente, extraia os metadados do rótulo da imagem para organizar os dados calculados de acordo.
   4. Determinar a região sináptica à mão definição desta região utilizando o tagRFP difuso expresso a partir do transgene uIs115 (PMEC-17:: tagrfp) . Isso pode ser feito adicionando o módulo referente ao pipeline CellProfiler-3.1.5.
   5. Para medir o tamanho e a fluorescência da sinapse definida manualmente, adicione o tamanho do objeto de medida e a forma e a medida do módulo de intensidade do objeto ao pipeline.
   6. Calcule a intensidade de fluorescência integrada relativa adicionando o módulo calcular matemática . Divida as unidades de intensidade integrada obtidas de jsIs37 (PMEC-7:: SNB-1:: GFP) pelas unidades integradas obtidas para UIs115 (PMEC-17:: tagrfp).
   7. Exporte medições e cálculos.

5. quantificando a estrutura do músculo da parede do corpo

1. Imagem latente da fluorescência da estrutura do músculo da parede do corpo
   1. Obter uma cepa (por exemplo, RW1596) carregando o transgene stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006))⁸, que rotula fibras de MIOSINA com GFP.
      Nota: a introdução do transgene em animais pode ser conseguida cruzando uma tensão de interesse com os animais que já expressam o transgene, ou microinjetando o ADN no braço longe do ponto de origem do gonad. O fenótipo ' Rolling ' induzido pela mutação rol-6 neste transgene facilita a visualização dos músculos. Os músculos da parede do corpo correm ao longo dos lados dorsal e ventral que normalmente são impróprios da vista em animais selvagens, porque eles tipicamente se encontram em um de seus lados laterais. O alelo de rol-6 (su1006) induz a torção dos animais, expondo desse modo algumas pilhas dos músculos para a imagem latente.
   2. Imagem os animais usando um microscópio de fluorescência acoplado com uma alta resolução carregada acoplado câmera do dispositivo (CCD), 40X objetivo ou superior, filtro GFP e software de aquisição.
   3. Ajuste o tempo de exposição e a intensidade da iluminação para evitar imagens saturadas.
   4. Capture e salve imagens de músculos (ampliação de 400X) de uma seção do animal contendo pelo menos uma célula muscular oblíqua visível completa. Evite regiões com uma única célula muscular que está incompleta ou seções que estão fora de foco. Também excluem imagens de regiões anteriores e posteriores extremas, e regiões adjacentes à vulva.
      Nota: se o animal não tiver uma única célula muscular completa visível, deslize suavemente a lamínula para girar o animal de modo a expor uma célula completa.
2. Medição da área de células musculares
   1. Abra a imagem no software⁹ de Fiji (a versão 2.0.0 foi usada neste estudo).
   2. Use a seleção de polígono para rastrear cuidadosamente em torno de uma única célula muscular oblíqua. Ajuste a linha do polígono no final arrastando o ponto de ancoragem para melhorar o rastreamento.
   3. Vá para a guia analisar na parte superior do software e clique em medir para calcular a área da seleção. Uma tabela de resultados separada que contenha a área e outras medidas será mostrada. Se a medição da área estiver ausente na tabela de resultados, vá para definir medições na guia analisar e verifique se a caixa área está marcada. Da mesma forma, desmarque outras medições que não são necessárias.
   4. Para células musculares com uma região degenerada/ausente, Trace a região ausente com a ferramenta de seleção de polígono e clique em medir novamente. Se houver várias lacunas dentro da célula, Trace cada lacuna separadamente.
   5. Calcule a proporção de área de Gap para toda a célula muscular única. Uma relação elevada indica uma extensão mais elevada da degeneração do músculo devido às grandes aberturas dentro da pilha. Se não houver regiões ausentes, como comumente observadas em animais do tipo selvagem, a razão seria calculada como zero.
      Nota: como controle, a pontuação também para defeitos de estrutura muscular visualmente e comparar os resultados com a medição quantitativa. Isso é especialmente útil se a cepa estiver sendo estudada pela primeira vez no laboratório. Para a pontuação fenotípica, avalie os animais como defeituosos ou não-defeituosos com base na integridade dos filamentos. Por exemplo, animais com perda de estrias de filamento distintas, aglomeração de GFP ou lacunas dentro das células musculares devido à degradação estrutural, seriam marcados como defeituosos.
3. Segmentação e quantificação do comprimento da fibra da miosina
   1. Se necessário, primeiro converta arquivos para. TIF usando Fiji ou outro pacote de software. Salve os arquivos TIFF no local desejado.
   2. Open ilastik¹⁰ (software livre, versão 1.3.2 pode ser baixado https://www.ilastik.org/).
   3. Uma vez em ilastik, escolha classificação de pixel em criar novo projeto. O software solicitará que o projeto seja salvo. Renomeie o projeto e salve em um local desejado.
      Observação: um novo projeto só precisa ser criado uma vez. A segmentação subseqüente pode ser feita usando o mesmo projeto. Para usar as mesmas configurações de projeto, vá para a guia projeto na parte superior e clique em abrir projeto para acessar o arquivo de projeto.
   4. Deve haver 5 abas no painel esquerdo (dados de entrada, seleção de recursos, treinamento, exportação de previsão e processamento em lote). Na guia dados de entrada, clique em Adicionar novo e, em seguida, Adicionar imagem separada (s). Direcione a janela pop-up para a pasta que contém os arquivos TIFF e selecione a imagem a ser aberta.
   5. Na próxima guia abaixo ( seleçãode recursos), clique em selecionar recursos para selecionar todos os recursos de pixel, indicados por caixas verdes assinaladas. A seleção de pixel nesta etapa é usada para distinguir as diferentes classes de pixels na próxima etapa.
      Observação: a seleção de recursos de pixel depende da resolução da imagem. Assim, os desenvolvedores sugerem para selecionar todos ou tantos recursos quanto possível, se o poder de processamento e tempo permitir.
   6. O painel de treinamento a seguir permite a classificação de diferentes classes de objetos com base em pixels. Neste caso, as duas classes são os filamentos de miosina individuais expressando GFP e fundo indesejado ou bordas borradas. Clique em Adicionar rótulo para ter o primeiro rótulo. Scrawl sobre um número de filamentos para começar o treinamento do classificador.
      Observação: clicar duas vezes no rótulo permite a alteração de nome (por exemplo, renomeando ' rótulo 1 ' para ' filamento '). Clicar duas vezes na caixa colorida permite que as cores para exibição de desenho e probabilidade sejam alteradas. O tamanho padrão do pincel é 1, embora o tamanho pode ser aumentado para 61. Se o pixel errado tiver sido desenhado, basta usar a ferramenta borracha para remover o desenho. Os controles de teclado (-) e (Shift +) podem ser usados para ampliar e reduzir a imagem, respectivamente. As teclas de seta são usadas para navegar ao redor da imagem.
   7. Adicione um segundo rótulo e renomeie-o para background. Scrawl sobre fundos indesejados e espaços entre os filamentos.
   8. Clique em Live Update e certifique-se de que a classificação foi feita pelo software corretamente. Adicione mais rabiscos e ajuste fino o treinamento se necessário.
      Nota: é importante manter um olho para fora para fibras mescladas e bordas obscuras (como a linha do corpo) nesta etapa. Melhore a predição aqui tanto quanto possível para aumentar a exatidão das medidas. A exatidão da predição igualmente depende da definição da imagem, porque os pixéis em imagens da baixa qualidade são mais difíceis de provocar distante. Também é opcional, mas recomendável executar o método de filtro na função sugerir recursos ao lado de controle de atualização ao vivo .
   9. Uma vez que o classificador do treinamento foi executado adequadamente, vá ao painel da exportação da predição . Clique em escolher Exportar configurações de imagem com probabilidades como a fonte.
   10. Use as configurações a seguir. A subregião de recorte x e y assinalada, e c unticked. Os valores de início e de parada para c devem ser 0 e 1, respectivamente. Marque e converta o tipo de dados em transformações para 8 bits não assinados, marque renormalize [min, Max] e use os valores padrão. Altere o formato do vídeo do arquivo de saída para PNG e renomeie o arquivo e o diretório conforme desejado.
   11. Feche a janela de configurações de exportação e exporte a imagem específica que acabou de ser segmentada.
   12. Abra a imagem PNG guardada no software Fiji. A imagem deve aparecer em preto e branco.
   13. Ajuste o limiar da imagem usando as configurações padrão.
   14. Aplique o plugin de esqueletização (Skeletonize 2D/3D e, em seguida, analise esqueleto). Uma tabela separada de resultados será exibida, que inclui o comprimento da ramificação. O comprimento da ramificação representa o comprimento da fibra. Outros dados nos resultados também podem ser úteis, como a distância euclidiana.
       Nota: omitir fibras com comprimentos de 0 μm ou mais de 250 μm, pois estes tamanhos não são fisiologicamente possíveis.

6. quantificando a morfologia mitocondrial

Nota: para a quantificação da morfologia mitocondrial, este estudo utilizou a cepa BXN038⁷ contendo o UIs115 (PMEC-17:: tagrfp)⁵ transgene para visualizar os neurônios de PLM e jsIs609 (PMEC-4:: MLS:: GFP)¹¹ para visualizar as mitocôndrias especificamente dentro dos neurônios PLM. Este estudo foi realizado em Worms adultos de 3 dias de idade sincronizada, mas foi realizado com sucesso em outras idades, bem como em outros tecidos⁷.

1. Imagem latente da fluorescência das mitocôndria dentro dos neurônios de PLM
   1. Para medir as alterações de tamanho e forma das mitocôndrias dentro dos neurônios PLM, visualize o neurônio de fundo e as mitocôndrias usando transgenes fluorescentes.
   2. Para a imagem do neurônio PLM, use um microscópio confocal acoplado a um 488 nm e 552 nm opticamente bombeado laser de diodo semicondutor e equipado com software de captura de imagem.
   3. Imagem do worm como por etapas 4.1.1-4.1.4 acima, assegurando condições de exposição não saturantes.
   4. A fim Visualizar o Neuron inteiro, uma imagem telhada pode ser precisada. Para conseguir isso, use o software com uma opção de digitalização de telha para localizar e soltar um marcador em um canto do neurônio e, em seguida, localize a extremidade oposta e solte o outro marcador. O software calculará o número ideal de telhas necessárias para capturar a área desejada.
      Nota: para reduzir o tempo de digitalização, muitas vezes é mais fácil localizar os neurônios que seguem um único plano, resultando em menos telhas.
   5. Para acoplar a digitalização de mosaico com uma pilha Z, defina os limites inferiores e superiores antes de iniciar a verificação de mosaico e certifique-se de que o tamanho de fatia ideal está definido.
   6. Assegure-se de que a resolução seja otimizada, pois a segmentação será mais refinada com resoluções mais elevadas (aqui, foi utilizada uma resolução de 3224 x 3224 pixels).
      Nota: enquanto o transgene uIs115 (PMEC-17:: tagRFP) é usado para marcar o PLM e posicionar com sucesso a câmera, não precisa necessariamente ser imaged devido à fluorescência ligeira do fundo observada do JsIs609 (PMEC-4:: MLS:: GFP) transgene dentro do próprio AXON PLM. Assim, a digitalização e o tempo de imagem podem ser reduzidos removendo o filtro de 552 nm do experimento.
2. Segmentação de objetos usando SQUASSH
   1. Converta arquivos de imagem em imagens . TIFF e gere projeções de intensidade máxima de pilhas Z usando o software de imagem de Fiji. Recorte imagens para o tamanho mínimo enquanto ainda contém o neurônio completo para reduzir a carga computacional e reduzir o ruído de fundo.
      Nota: para os resultados representativos, foram consideradas apenas as mitocôndrias dentro dos processos axonais longos, de modo que o corpo celular e qualquer mitocôndria dentro foram excluídos de cada imagem.
   2. Usando a macro SQUASSH do Mosaic Suite para o ImageJ, execute a segmentação de divisão Bregman¹² nas projeções máximas. Um guia detalhado para a instalação e aplicação desta macro está disponível no site do Mosaic (http://mosaic.mpi-cbg.de/) e descrito por Rizk et al. 2014¹³. O processo de segmentação de imagem é descrito em breve abaixo.
      Nota: esta segmentação identifica objetos (neste caso mitocrion individual) sobre um limiar de intensidade de fluorescência, permitindo a medição exata de cada tamanho de objetos individuais e forma.
   3. Remova o ruído de fundo de uma imagem usando o método de rolamento de esferas, no qual uma janela definida pelo usuário se move pela imagem, imputando a estimativa de intensidade de plano de fundo local da intensidade mais frequente em cada janela. Isso corrige intensidades de fundo irregulares.
   4. Use a detecção de objeto para localizar aproximadamente regiões da imagem que contenham objetos (mitocôndria) de interesse, com base na intensidade de fluorescência e no número de pixels. Os parâmetros que regem essa etapa são regularização e intensidade mínima do objeto.
      Observação: a regularização é usada para evitar segmentar a intensidade pequena, picos induzidos por ruído e o limite mínimo de intensidade do objeto ajuda a definir as organelas subcelulares da fluorescência do tecido de fundo. Estes são os dois principais parâmetros que são manipulados para encontrar uma segmentação ideal de mitocôndria, e o processo de otimização tende a ser experimental e erro de diferentes parâmetros para uma imagem de teste, seguido por inspeção manual.
   5. Use o software para estimar as intensidades de fundo locais em torno de cada objeto para ajudar a computação de segmentação ideal.
   6. Meça objetos individuais para o tamanho, perímetro, comprimento através do número do pixel, assim como a intensidade do sinal e a posição de x/y na imagem. Para calcular medições em tamanho (nm), fator no tamanho do pixel da imagem original.
      Nota: para cada experimento, os parâmetros ideais devem ser calculados primeiro. Para garantir a precisão da segmentação, é aconselhável realizar uma análise SQUASSH em uma imagem de teste e inspecionar manualmente a precisão da segmentação. A macro fornece arquivos de saída mostrando os objetos individuais que foram identificados na imagem original, e inspecionando esses parâmetros de perto e ajustando para atender irá garantir uma segmentação precisa. Os parâmetros definidos devem ser usados para todo o experimento para comparabilidade. Os parâmetros utilizados para os resultados representativos estão incluídos na tabela 2.
   7. Abra o software de análise Fiji ou ImageJ, navegue até o contêiner de macro mosaico e abra o menu SQUASSH.
      1. Abra o submenu subtracção em segundo plano e certifique-se de remover background? está marcada. O padrão para o tamanho da janela é 10.
      2. Defina a Regularization desejada e a intensidade mínima do objeto, os valores do canal 1 para identificar melhor e segmentar objetos (consulte a etapa 6.2.4). Os valores do canal 2 não são necessários para objetos marcados com um único transgene.
      3. Clique na estimativa de PSF de propriedades objetivas para estimar a função spread de pontos com base nas características do microscópio. Isso ajuda a segmentação de objetos intimamente localizados, representando a influência de cada pixel em seu pixel vizinho.
         Observação: a segmentação de subpixel não foi usada neste experimento devido à sua carga aumentada na potência de processamento do computador. Máscaras de células também não foram usadas como o AXON é facilmente definido. Essas configurações são úteis para tecidos mais complexos e para definir objetos em uma célula por célula base.
      4. Para opções de visualização, verifique se os contornos do objeto e salvar as características do objeto e da imagem estão verificados. Para uso posterior em gráficos e softwares estatísticos, assegure-se de que o número correto de condições seja entrado.
   8. Localize a pasta com imagens . TIFF e execute a macro. Esse processo pode ser realizado em uma imagem individual ou em um lote de imagens por genótipo localizado dentro de uma pasta. Os arquivos de saída serão localizados na pasta junto com as imagens originais.
3. Análise e medições de forma
   1. Use a saída de SQUASSH para fornecer um arquivo de dados . csv de objeto discriminado, que fornece cada objeto individual por linha, incluindo suas medidas, conforme descrito acima.
      Observação: enquanto esse processo de macro automatiza as medições de objeto, é sempre importante verificar manualmente as imagens de saída após a segmentação de SQUASSH para garantir que a macro identificou mitocôndria corretamente.
   2. Para analisar a forma de cada mitocôndria, use uma medida bidimensional para esfericidade, circularidade, para estimar o desvio do objeto de um círculo perfeito.
      Nota: circularidade é uma função de área e perímetro (circularidade = (4 x π) x (área/perímetro²) onde 1 = um círculo perfeito e 0 = uma linha reta. Isso pode ser conseguido usando uma fórmula em gráficos e software estatístico.
   3. Para determinar a variância em tamanho e forma em todo o pool de mitocôndrias, calcule histogramas e uma distribuição gaussiana ajustada usando gráficos e softwares estatísticos, com compartimentos de 0,2 μm para tamanho mitocondrial e 0, 5 para circularidade mitocondrial.

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Resultados

C. elegans é um organismo modelo ideal para estudar a morfologia de diferentes tecidos e organelas devido à sua simplicidade, linhagem celular conhecida, transparência e ferramentas disponíveis. Aqui, nós fornecemos abordagens quantitativas para o estudo de organelas (por exemplo, mitocôndria) e tecidos, incluindo sinapses e músculos usando imagens de fluorescência ao vivo e software de processamento de bio imagem livre.

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Discussão

As variações morfológicas foram avaliadas freqüentemente através da contagem manual de diferenças visíveis ou de usar limiares arbitrários para determinar defeitos em comparação a um phenotype do selvagem-tipo. Mais recentemente, entretanto, os métodos quantitativos foram usados para estudos comparativos da morfologia para medir exatamente e descrever mudanças em um nível celular e subcellular em uma forma imparcial. A capacidade de identificar diferenças sutis e biologicamente relevantes entre os fenótipo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Light LED	Schott	KL 300 LED
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Tryptone (Peptone from casein)	Merck	107213	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract	Merck	103753	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)	Merck	107214	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar	Sigma	A1296	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride	Merck	102382	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate	Merck	105101	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate	Merck	106586	Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Petri dishes	Corning	CLS430589-500EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Spatula	Met-app	2616
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G