Isolamento de subconjuntos de macrófagos e células estromais de espécimes miocárdios humanos e de camundongos

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para isolar vários subconjuntos de macrófagos e outras células não imunes do miocátrio humano e do rato, preparando uma única suspensão celular através da digestão enzimática. Também são apresentados esquemas de gating para identificação baseada em citometria de fluxo e caracterização de macrófagos isolados.

Resumo

Macrófagos representam as populações de células imunes mais heterogêneas e abundantes no coração e são centrais na condução de inflamação e respostas reparadoras após lesão cardíaca. Como vários subconjuntos de macrófagos orquestram as respostas imunes após lesão cardíaca é uma área ativa de pesquisa. Apresentado aqui é um protocolo simples que nosso laboratório executa rotineiramente, para a extração de macrófagos de espécimes de miocánio humano e camundongos obtidos de indivíduos saudáveis e doentes. Resumidamente, este protocolo envolve digestão enzimática de tecido cardíaco para gerar uma única suspensão celular, seguido de coloração de anticorpos e citometria de fluxo. Esta técnica é adequada para ensaios funcionais realizados em células classificadas, bem como sequenciamento de RNA em massa e célula única. Uma grande vantagem deste protocolo é a sua simplicidade, variação mínima do dia a dia e ampla aplicabilidade que permite a investigação da heterogeneidade do macrófago em vários modelos de camundongos e entidades de doenças humanas.

Introdução

Os macrófagos representam o tipo de célula imune mais abundante no coração, e desempenham papéis significativos na geração de respostas inflamatórias e reparadoras robustas após lesão cardíaca^1,2,3,4. Anteriormente, nosso grupo identificou dois grandes subconjuntos de macrófagos no coração de urina derivados de origens distintas do desenvolvimento^5,6. Em termos gerais, populações distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes em tecidos podem ser identificadas com base na expressão da superfície celular do CCR2 (receptor de quimiocina 2 do motivo C-C). CCR2^- macrófagos (expressão da superfície celular: CCR2^-MHCII^baixa e CCR2^-MHCII^alta)são de origem embrionária (linhagens primitivas e erittroóides), capazes de auto-renovar, e representam uma população dominante em condições homeostáticas. Os CCR2⁺ macrófagos residentes são de origem hematopoiética definitiva, são mantidos através do recrutamento de monócitos circulantes e representam uma população menor em condições homeostáticas. Funcionalmente, CCR2^- macrófagos geram inflamação mínima e são fundamentais para o desenvolvimento coronariano regeneração cardíaca neonatal^5,7. Em contraste, CCR2⁺ macrófagos iniciam respostas inflamatórias robustas após insultos cardíacos e contribuem para a lesão por cardiomiócito colateral, remodelação adversa do ventrículo esquerdo e progressão da insuficiência cardíaca^8,9.

Recentemente, mostramos que o miocásio humano também contém dois subconjuntos distintos de macrófagos identificados de forma semelhante como CCR2^- ou CCR2⁺⁸. A expressão gênica e as análises funcionais revelaram que os CCR2 humanos^- e os macrófagos CCR2⁺ representam subconjuntos funcionalmente divergentes e são funcionalmente análogos à CCR2^- e CCR2⁺ macrófagos encontrados no coração do rato. CCR2 humano^- macrófagos expressam níveis robustos de fatores de crescimento, incluindo IGF1, PDGF, Cyr61 e HB-EGF. CCR2⁺ macrófagos são enriquecidos em quimiocinas e citocinas que promovem inflamação, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 e TNF-a. Estimulados CCR2⁺ macrófagos secretam níveis marcadamente mais altos da citocina inflamatória interleucina-1β (IL-1β) na cultura. Como esses subconjuntos contribuem diferencialmente para a reparação de tecidos e a remodelação ventricular esquerda (LV) no contexto da lesão cardíaca continua a ser uma área de pesquisa ativa.

A análise baseada em citometria flow-ofuscar a heterogeneidade do macrófago no camundongo e no coração humano requer digerir o tecido cardíaco e gerar uma única suspensão celular seguida de análise citométrica de fluxo ou classificação celular para processos a jusante, como sequenciamento de RNA em massa/sequenciamento de RNA de célula única ou cultivo das células para ensaios funcionais. O protocolo original para fazer uma única suspensão celular de corações de urina foram relatados pela primeira vez pelo grupo Nahrendorf em Nahrendorf et al. 2007¹⁰. Nosso laboratório adaptou e modificou o protocolo para extrair macrófagos do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com ligeira modificação no esquema de coloração e gating, CD45^- células estromais do miocátrio humano também podem ser colhidas. Apresentado aqui, em texto e vídeo, é um protocolo que é realizado rotineiramente para a extração de macrófagos ou estromal do miocátrio humano.

Espécimes de tecido cardíaco são obtidos de pacientes adultos com cardiomiopatia dilatada (DCM: idiopática ou familiar) ou cardiomiopatia isquêmica (ICM) submetidos à implantação ou transplante cardíaco do dispositivo de assistência ventricular esquerda (LVAD). Os corações explantados ou os núcleos de LVAD são perfundidos intravascular com soro frio antes de começar o procedimento da digestão. É importante notar que a "qualidade" do espécime de tecido determinado em termos de grau de cicatrização ou infiltração de tecido adiposo pode afetar muito o rendimento dos macrófagos. Espécimes cardíacos com grandes áreas de cicatrizes terão rendimento celular muito menor e podem representar séria limitação técnica quando os métodos de análise a jusante desejados requerem cultivo de células in vitro.

Protocolo

O protocolo apresentado foi aprovado pela Washington University em St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos os sujeitos fornecem consentimento informado antes da coleta de amostras e os experimentos são realizados de acordo com o protocolo de estudo aprovado. O protocolo apresentado é realizado com a aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee da Washington University School of Medicine e segue as diretrizes descritas no Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Preparação de espécimes de tecido cardíaco humano

1. Nivele corações explantados por cânulando a ostia da artéria coronária esquerda e direita e perfusique com 200 mL de soro fisiológico frio.
2. Flush LVAD apical tecidos cored por cânulando um vaso epicardial e perfundir com 50 mL de soro de soro frio.
3. Dissecar o espécime do tecido da parede apical ou lateral do ventrículo esquerdo no soro fisiológico frio ou em HBSS usando uma tesoura estéril.
4. Dissecar cuidadosamente a gordura epicardial e tendineae de acordes do espécime usando uma tesoura fina.
5. Dissecar pedaços de tecido em pedaços pesando aproximadamente 200 mg com a ajuda de uma lâmina estéril ou tesoura.

2. Preparação do coração do rato

1. Eutanásia do rato por asfixia de CO₂ ou deslocamento cervical.
2. Abra a cavidade torácica com a ajuda de tesouras afiadas. Use hemostats sem corte para levantar o coração para cima. Perfuse o coração com PBS frio usando uma agulha de 25 G unida a uma seringa de 5 mL. Perfuse até que o coração aparece decorado na cor.
3. Retire o coração e coloque em uma placa de Petri estéril no gelo.

3. Preparação da suspensão de célula única

1. Coloque pedaços de tecido cardíaco humano (~ 200 mg) ou coração de urina em uma placa de Petri estéril. Pique finamente o tecido usando uma lâmina estéril ou tesoura.
2. Configure as digestões:
   1. Use um volume final de digestão de 3 mL por pedaço de tecido cardíaco humano (200 mg) ou por um coração de urina. As concentrações de enzimas finais são as seguintes: Colagem (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hialuronidase (60 U/mL).
   2. Para cada reação de digestão adicione DMEM e todas as enzimas a um tubo cônico de 15 mL. Com a ajuda de fórceps limpos, coloque o tecido finamente picado em cada tubo de reação. Misture bem por vórtice suave.
3. Digere para 1 h em 37 °C em uma incubadora de agitação ajustada a uma baixa a média velocidade da agitação.
4. Depois de 1 h de digestão, retire os tubos da incubadora e coloque no gelo. Configure 50 tubos cônicos mL com um filtro de células de 40 μm em cima. Molhe os filtros com 2 mL de enzima desativação (ED) buffer.
5. Desativar as enzimas de digestão, adicionando 8 mL de buffer DE para cada tubo de digestão. Em seguida, despeje a mistura total resultante de 13 mL através do filtro de célula de 40 μm nos tubos cônicos de 50 mL. Transfira as amostras de volta no tubo cônico fresco de 15 mL. Isso permite a ordileção de células ideais e minimiza a perda celular durante a centrífuga.
6. Gire as amostras a 400 x g por 6 min (Centrífuga situada em 4 °C). Descarte o supernatant deixando 0,5 mL de mídia. Resuspenda a pelota celular por tubulação suave e adicione 1 mL de amortecimento de lse da ACK. Delicadamente redemoinho do tubo e incubar à temperatura ambiente por 5 min para realizar glóbulo vermelho (RBC) lyse.
7. Após 5 min no buffer ACK, adicione 9 mL de DMEM à amostra. Coloque a tampa de volta para os tubos e gentilmente inverter os tubos para misturar, e filtrar através de um filtro de células de 40 μm. Colete a filtragem em tubos cônicos de 15 mL.
8. Centrífuga os tubos em 400 x g por 6 min e descartar o supernatant.
9. Adicione 1 mL de buffer FACS e resuspender a pelota. Em seguida, transfira nas células do tampão FACS para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífuga novamente a 400 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspender a pelota em 100 μL de FACS Buffer. Uma única suspensão da pilha está agora pronta para a coloração do anticorpo.

4. Mancha de anticorpos

1. Um painel típico de anticorpos humanos consiste nos seguintes anticorpos: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Por favor, consulte a Tabela 1. Adicione todos os anticorpos às amostras do coração em 1:50 diluição e incubação para ~30-40 min em 4 °C na obscuridade. Avance para o passo 4.4 abaixo.
2. Para células estromais (células endotélias, fibroblasto, células musculares lisas), adicione DRAQ5 (1 μM concentração final) e CD45-percpCy5.5. Por favor, consulte a Tabela 1. Incubar por 30 min a 4 °C no escuro. Avance para o passo 4.4 abaixo.
3. Para macrófagos cardíacos de urina adicione os seguintes anticorpos: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 e Ly6G-FITC. Por favor, consulte a Tabela 2. Adicione todos os anticorpos às amostras do coração em 1:100 diluição e incubar para ~30-40 min em 4 °C na obscuridade. Avance para o passo 4.4 abaixo.
4. Lave as amostras duas vezes no tampão FACS. Para cada lavagem, adicione 1 mL de tampão FACS, vórtice suave e centrífuga a 400 x g por 5 min, resuspenda em 350 μL de tampão FACS e adicione DAPI (1 μM, concentração final). As amostras estão agora prontas para a análise/classificação facs.

Resultados

O protocolo descrito permite o isolamento de macrófagos do mouse e do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com uma estratégia diferente de coloração e marcha, as células estromais também podem ser colhidas do miocánio humano. Os resultados da FACS aqui apresentados foram adquiridos na plataforma BD LSRII ou BD FACS ARIA III. Os controles de compensação foram gerados a partir de amostras de controle de cores únicas de splenocytes manchados. A Figur...

Discussão

O protocolo permite a extração de vários subconjuntos de macrófagos do miocátrio humano. O protocolo é simples e leva de 3 a 4 horas para preparar a suspensão de célula única pronta para a análise facs. Embora o protocolo seja relativamente simples de executar, há certos aspectos técnicos que precisam ser considerados que minimizarão a variabilidade. Em primeiro lugar, trabalhar em tempo hábil com o tecido humano é necessário para a viabilidade celular ideal. É importante manter o tecido em saline frio /...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conocal Tubes	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µm Cell Strainers	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL Conical Tubes	Thermo Fisher	352098
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2058
Collagenase 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0.5 M pH 8	Corning	46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer			490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M)
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3840201
Forceps	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hemostats	VWR	63042-052
Hyaluronidase type 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Petri dishes	Thermo Fisher	172931
Razor Blade	VWR	55411-050
Scissors	VWR	82027-578