Modelo murino de impacto cortical controlado para a indução de traumatismo cranioencefálico

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo para a indução de ferimento de cérebro traumático murino através de um impacto cortical controlado da abrir-cabeça.

Resumo

Os centros de controle de doenças e prevenção de lesões estimam que quase 2 milhões pessoas sustentam uma lesão cerebral traumática (TBI) todos os anos nos Estados Unidos. Na verdade, a TBI é um fator contribuinte para mais de um terço de toda a mortalidade relacionada a lesões. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à fisiopatologia da TBI são pouco compreendidos. Assim, os modelos pré-clínicos de TCE capazes de replicar os mecanismos de lesão pertinentes à TBI em pacientes humanos são uma necessidade de pesquisa crítica. O modelo controlado do impacto cortical (CCI) de TBI utiliza um dispositivo mecânico para impactar diretamente o córtice exposto. Embora nenhum modelo possa recapitular completamente os padrões de lesões diferentes e a natureza heterogênea da TBI em pacientes humanos, o CCI é capaz de induzir uma ampla gama de TBI clinicamente aplicável. Além disso, CCI é facilmente padronizado permitindo que os investigadores para comparar os resultados através de experimentos, bem como em grupos de investigação. O seguinte protocolo é uma descrição detalhada de aplicar um CCI severo com um dispositivo de impacto comercialmente disponível em um modelo murino de TBI.

Introdução

Os centros para o controle da doença e a prevenção de ferimento estimam que aproximadamente 2 milhões americanos sustentam um ferimento de cérebro traumático (TBI) cada ano^1,2. Na verdade, a TBI contribui para mais de 30% de todas as mortes relacionadas a lesões nos Estados Unidos com custos de saúde chegando a $80000000000 anualmente e quase $4000000 por pessoa por ano, sobrevivendo a um TBI severo^3,4,5. O impacto da TBI é destacado pelas complicações neurocognitivas e neuropsiquiátricas de longo prazo significativas sofridas por seus sobreviventes com o início insidioso de deficiências comportamentais, cognitivas e motoras denominadas encefalopatia traumática crônica (CTE) ⁶ anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9} anos de ^{, 10}. mesmo eventos de concussão subclínicos — os impactos que não resultam em sintomas clínicos — podem levar à disfunção neurológica de longo prazo^11,12.

Modelos animais para o estudo da TBI têm sido empregados desde o final dos anos 1800 ' s¹³. Na década de 1980, foi desenvolvido um pêndulo pneumático com o objetivo de modelar a TBI. Este método é referido agora como o impacto cortical controlado (CCI)¹⁴. O controle e a reprodutibilidade do CCI levaram os pesquisadores a adaptar o modelo para uso em roedores¹⁵. O nosso laboratório utiliza este modelo para induzir o TBI através de um Impactador disponível comercialmente e dispositivo de acionamento eletrônico^16,17. Este modelo é capaz de produzir uma escala larga de Estados clìnica aplicáveis de TBI dependendo dos parâmetros biomecânicos usados. A avaliação histologic de cérebros de TBI depois que uma lesão severa induzida em nosso laboratório demonstra a perda cortical e hippocampal ipsilateral significativa assim como o edema e a distorção contralaterais. Adicionalmente, o CCI produz um comprometimento consistente na função motora e cognitiva, medido por ensaios comportamentais¹⁸. As limitações ao CCI incluem a necessidade para a craniotomia e a despesa de adquirir o dispositivo do impactor e de accionar.

Vários modelos adicionais de TBI existem e estão bem estabelecidos na literatura, incluindo o modelo de percussão de fluido lateral, modelo de queda de peso e modelo de lesão de jateamento^19,20,21. Embora cada um desses modelos tenha suas próprias vantagens distintas, suas principais desvantagens são a lesão mista, a alta mortalidade e a falta de padronização, respectivamente²². Além disso, nenhum desses modelos oferece precisão, precisão e reprodutibilidade do CCI. Ajustando os parâmetros biomecânicos de entrada para o dispositivo de acionamento, o modelo CCI permite que o investigador controle preciso sobre o tamanho da lesão, profundidade da lesão, e energia cinética aplicada ao cérebro. Isso dá aos investigadores a capacidade de aplicar todo o espectro de TBI para áreas específicas do cérebro. Ele também permite a maior reprodutibilidade do experimento para experimentar.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Northwestern. C57BL/6 camundongos foram comprados no laboratório Jackson e grupo alojado em uma instalação de barreira no centro de medicina comparativa na Northwestern University (Chicago, IL). Todos os animais foram alojados em 12/12 h de luz/ciclo escuro com acesso gratuito à comida e água.

1. induzir anestesia

1. Anestesie o camundongo com cetamina (125 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) injetado intraperitonealmente.

2. sinais vitais que monitoram cada 15 minutos

1. Monitore a temperatura, a frequência respiratória e a cor da pele. O rato deve sentir-se quente ao toque. A pele deve aparecer rosa e bem perfused. A frequência respiratória deve variar 50 – 70 respirs por minuto.

3. procedimentos pré-cirúrgicos

1. Pesar todos os ratos no dia anterior à indução da lesão.
2. Esterilizar um conjunto de instrumentos cirúrgicos por autoclavagem para cada sujeito experimental. Esterilizar o dispositivo de impacto antes de usar.
3. Prepare uma gaiola da recuperação coloc uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento elétrica ajustada ao ajuste "baixo" e posicionado em uma maneira tal que os ratos possam se afastar do calor uma vez ambulatory.
4. Configurar o teatro operacional dentro de uma capa de fluxo laminar esterilizado.
   1. Posicione o quadro de operação estereotótaxo.
   2. Prenda o dispositivo impactante ao frame Stereotaxic.
   3. Ajuste o dispositivo de accionar com os parâmetros biomecânicos desejados para a velocidade e o tempo de permanência.
      Nota: neste protocolo uma lesão cerebral grave é descrita utilizando uma ponta de impacto de 3 mm de diâmetro através de uma craniectomia de 5 mm de diâmetro com a velocidade definida em 2,5 m/s e um tempo de permanência de 0,1. Uma escala larga de parâmetros biomecânicos pode ser usada para induzir o espectro cheio de TBI.
5. Don novo equipamento de proteção pessoal e luvas estéreis.
6. Depilar a pele do local operatório usando cortadores elétricos.
7. Aplique a pomada opthalmic protetora aos olhos do rato para impedir ferimento e a secagem córneos.
8. Coloque o mouse no teatro operacional.
9. Prepare a pele com uma esfoliação cirúrgica baseada em iodo alternada com álcool três vezes.

4. aplicação do impacto cortical controlado

1. Incise o couro cabeludo 1 cm na linha média com um bisturi expondo o crânio.
2. Posicione o mouse dentro de um quadro de operação estereotódico, fixando os ossos temporais bilaterais entre as barras de orelha em miniatura e bloqueando os incisivos dentro de uma pinça de incisão, criando uma preensão de três pontos estável na cabeça do mouse.
3. Retrair o couro cabeludo para longe do local operatório com um hemostato ou pinça de travamento para garantir que o couro cabeludo não entra em contato com a broca durante a craniectomia.
4. Identifique as suturas sagital e coronal no crânio exposto.
   Nota: Este protocolo centra a craniectomia 2 mm à esquerda da sutura sagital e 2 mm rostral para a sutura coronal.
5. Realize uma craniectomia usando uma broca com uma broca de trefina.
   1. Para realizar a craniectomia, primeiro ative a broca na velocidade máxima e, em seguida, aplique a broca de trefina perpendicular ao crânio no local da craniectomia.
   2. Aplique a pressão delicada, mesmo à broca uma vez que o contato é feito com o crânio. Uma ligeira "dar" será sentida uma vez que a broca penetra através do crânio. Não penetre na dura subjacente.
      Nota: Este protocolo utiliza um bocado de broca do trephine de 5 milímetros para executar o craniectomy.
6. Use o fórceps e uma agulha hipodérmica do calibre pequeno para remover a aleta do osso, expondo inteiramente o Mater subjacente da dura.
7. Gire a ponta do pêndulo para o campo operatório e abaixe-a até que ela faça contato com a dura-máter exposta. Uma vez que o contato é feito o sensor do contato do instrumento fará um tom audível para alertar o cirurgião que o contato estêve feito. Isso marcará o ponto zero do qual a profundidade de deformação é definida.
   Nota: Este protocolo utiliza uma ponta de impacto de 3 milímetros para gerar uma lesão severa. As pontas tão pequenas quanto 1 milímetro podem ser usadas para aplicar ferimento mais localizado.
8. Retraia a ponta impactante e ajuste a profundidade de impacto desejada abaixando a posição do impactor no frame Stereotaxic.
   Nota: neste protocolo nós descrevemos uma lesão severa ajustando a profundidade da deformação a 2 milímetros.
9. Aplique a lesão ativando o pêndulo no dispositivo de acionamento.
10. Gire o dispositivo de impacto para fora do campo e retire o animal do quadro estereotódico.

5. fechamento cirúrgico do local

1. Controle o sangramento do crânio e a superfície cortical ferida com pressão direta de um aplicador derrubado algodão estéril.
2. Seque o crânio com um aplicador de ponta de algodão estéril.
3. Feche o couro cabeludo sobre a craniectomia usando um adesivo cirúrgico comercialmente disponível ou sutura de monofilamento.
   Nota: neste protocolo um adesivo cirúrgico veterinário é usado para fechar o couro cabeludo. A aba óssea não é substituída e é descartada.

6. cuidados e monitorização pós-operatórios

1. Administrar analgesia pós-operatória (por exemplo, buprenorfina de liberação sustentada 0,1 – 0,5 mg/kg administrada por via subcutânea fornecendo 72 h de analgesia sustentada).
2. Coloque o animal na posição de recuperação de decúbito lateral em uma gaiola pré-aquecida limpa.
3. Observe os animais até acordar e móvel, em seguida, devolver cada mouse para a sua gaiola de casa.
4. Garanta o acesso gratuito à comida e à água. Ingestão normal de alimentos e água normalmente retomar dentro de uma a duas horas após a lesão.
5. Medir o peso corporal a cada três dias durante todo o experimento.

Resultados

O pêndulo monta diretamente no quadro estereotódico, permitindo até 10 μm de resolução para o controle do ponto de impacto, profundidade e penetração. As forças eletromagnéticas empregadas podem transmitir velocidades de impacto variando de 1,5 – 6 m/s. Isto permite a precisão incomparável e a reprodutibilidade sobre a escala inteira do TBI clìnica relevante. Os investigadores podem executar experimentos piloto mudando os parâmetros de lesão, como o tamanho da ponta do pêndulo, a velocidade de impacto e...

Discussão

Existem várias etapas que são críticas para a aplicação de uma lesão confiável e consistente. Primeiro, o mouse deve chegar a um plano profundo de anestesia cirúrgica, garantindo nenhum movimento durante o desempenho da craniectomia. Embora numerosos regimes anestésicos possam ser utilizados para induzir anestesia geral em roedores, os anestésicos que induzem a depressão respiratória, como anestésicos inalatórios, podem resultar em parada respiratória quando combinados com TCE grave. Este protocolo utiliza...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50