Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Resumo

É apresentado aqui um método do Electroporation para a entrega do ADN do plasmídeo e a rotulagem da pilha ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo é um método rápido e eficiente para visualizar e traçar células ependymogliais individuais e abre novas possibilidades para aplicar a eletroporação a uma ampla gama de manipulações genéticas.

Resumo

O electroporation é um método do transfection em que um campo elétrico é aplicado às pilhas para criar pores temporários em uma membrana de pilha e para aumentar sua permeabilidade, desse modo permitindo que as moléculas diferentes sejam introduzidas à pilha. Neste papel, o electroporation é usado para introduzir plasmídeos às pilhas ependymoglial, que alinham a zona ventricular do telencephalon adulto do zebrafish. Uma fração dessas células mostra Propriedades de células-tronco e gera novos neurônios no cérebro zebrafish; Portanto, estudar seu comportamento é essencial para determinar seus papéis na neurogênese e regeneração. A introdução de plasmídeos através do Electroporation permite a rotulagem e o seguimento a longo prazo de uma única pilha ependymoglial. Além disso, os plasmímids tais como o recombinase do CRE ou o Cas9 podem ser entregados às únicas pilhas ependymoglial, que permite a recombinação do gene ou a edição do gene e fornece uma oportunidade original de avaliar a função autônoma do gene da pilha em um controlado, natural Ambiente. Finalmente, este protocolo detalhado, passo a passo do Electroporation é usado para obter a introdução bem sucedida de plasmídeos em um grande número de únicas pilhas ependymoglial.

Introdução

Zebrafish são excelentes modelos animais para examinar a regeneração cerebral após uma ferida de ferimento de facada. Em comparação com os mamíferos, na escada evolutiva, espécies menos evoluídas como o zebrafish geralmente apresentam taxas mais elevadas de neurogênese constitutiva e áreas mais amplas de residência neural adulta de células-tronco, levando à geração constante de novos neurônios ao longo a maioria das áreas cerebrais na vida adulta. Esta característica parece correlacionar com significativamente maior capacidade regenerativa de zebrafish em comparação com os mamíferos¹, como zebrafish têm notável potencial para gerar eficientemente novos neurônios na maioria dos modelos de lesão cerebral estudados^{2, 3,4,5,6,7,8}. Aqui, o telencéfalo zebrafish é estudado, uma vez que é uma área cerebral com neurogênese proeminente na idade adulta. Estas zonas da neurogênese adulta são homólogo às zonas neurogênica no cérebro mamífero adulto^9,10,11.

As áreas neurogênica abundantes no telencéfalo do zebrafish estão atuais devido à existência do glia radial como pilhas ou pilhas do ependymoglia. As células ependymogliais atuam como células-tronco neurais adultas residentes e são responsáveis pela geração de novos neurônios no cérebro intacto e regenerador^3,5. Experimentos de rastreamento de linhagem mostraram que a ependymoglia ventricular reage à lesão, então proliferam e geram novos neuroblastos que migram para o local da lesão⁵. Devido à natureza evertido do telencephalon do zebrafish, as pilhas de ependymoglial alinham a superfície ventricular e constroem a parede ventricular ventral. A parede ventricular dorsal é formada por uma camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a). Importante, o zebrafish ependymoglia incorpora as características tanto da glia radial de mamíferos quanto das células ependímicas. Os processos radiais longos são uma característica típica das células da glia radial, enquanto as extensões celulares e as junções apertadas (bem como suas posições ventriculares) são características típicas das células ependímicas^12,13,14. Conseqüentemente, estas pilhas são referidas como pilhas ependymoglial.

Para seguir o comportamento in vivo de células ependymogliais únicas durante a regeneração, eles precisam ser rotulados de forma confiável. Os vários métodos da rotulagem in vivo da pilha para a microscopia fluorescente foram descritos previamente, tais como repórteres endógenos ou tinturas lipofílico¹⁵. Estes métodos, em contraste com o electroporation, podem exigir uns períodos de tempo mais longos e frequentemente não oferecem a possibilidade da única rotulagem da pilha ou do traçado a longo prazo permanente. Electroporation, entretanto (além da única rotulagem da pilha), oferece a possibilidade de introduzir o ADN novo na pilha de anfitrião. Além disso, comparado a outros métodos de transferência de DNA para as células, a eletroporação demonstrou ser um dos métodos mais eficientes^16,17,18,19.

É apresentado aqui um protocolo do Electroporation que seja refinado com a finalidade de etiquetar únicas pilhas ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo permite a rotulagem de pilhas ependymoglial únicas a fim segui-los durante um período de longo prazo²⁰ ou para manipular caminhos específicos em uma maneira pilha-autônoma^21,22.

Protocolo

Todos os animais utilizados neste protocolo foram mantidos condições de manejo padrão, e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos de manuseio da UE e do governo da Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. preparação da mistura plasmídeo para electroporação

1. Diluir o plasmídeo de interesse em água estéril e adicionar solução de estoque de mancha verde rápido [1 mg/mL]. Certifique-se de que a concentração final do plasmídeo é ~ 1 μg/μL. Adicione a mancha em uma concentração de não mais de 3%, porque seu único objetivo é colorir a solução e visualizar a injeção ventricular.
2. Uma vez preparado, misture a solução de plasmídeo pipetando para cima e para baixo várias vezes ou tocando com o dedo. Armazene à temperatura ambiente (RT) até o uso.
   Nota: Para o co-Electroporation de dois plasmídeos na mesma pilha, assegure-se de que a concentração de cada plasmídeo individual usado na mistura seja pelo menos 0,8 ng/μl com uma relação do molar de 1:1 para obter a eficiência do co-Electroporation de 80%-de 90%.

2. preparações para procedimento de injecção e electroporação

1. Prepare os capilares de vidro (diâmetro externo 1 mm, diâmetro interno 0,58 mm) necessários para a injeção no aparelho de tração da agulha.
2. A fim de injetar a quantidade correta de plasmídeo (ver acima), puxe o capilar a uma temperatura de 68,5 ° c com dois pesos leves e dois pesados (ver tabela de materiais para as especificações do extrator).
   Nota: No caso de um extrator diferente é usado, calibrar o capilar para entregar o volume adequado de mistura de electroporação.
3. Defina manualmente o dispositivo de injeção para uma pressão de injeção de 200 hPa (girando o botão PI) e a pressão constante de 0 hPa. Ajuste manualmente o tempo de injeção para o modo manual e controle a pressão com o pedal do pé.
4. Ajuste o dispositivo do Electroporation ao "modo LV" com cinco pulsos em 54 – 57 V (25 MS cada um com 1 s intervalos). Ligue os eléctrodos ao dispositivo.
5. Prepare um tanque de peixes com água de peixe limpa, onde o peixe será despertado da anestesia após o procedimento de eletroporação. Aerate a água mantendo a pedra do ar unida à bomba de ar para o período inteiro da recuperação até que o peixe esteja despertado inteiramente.
6. Tome uma esponja de cozinha regular e faça um corte longitudinal na esponja para prender peixes durante o procedimento da injeção e do Electroporation (veja a publicação precedente³).
   Nota: A esponja da cozinha deve regularmente ser lavada ou trocado a fim remover produtos químicos tóxicos potenciais.
7. Coloc uma pequena quantidade de gel multi-purpose altamente condutor do ultra-som ao lado da instalação da injeção e do Electroporation.
   Nota: Isso garantirá a condutividade elétrica adequada e, consequentemente, a distribuição de células eletroporadas em todo o telencon.

3. anestesia de zebrafish

1. Antes da anestesiarização, prepare uma solução de anestesia com 0,2% MS222 em água destilada e ajuste o pH para 7 com tampão Tris-HCl. Diluir este estoque 1:10 (ou seja, para 0, 2% MS222) usando água de peixe.
2. Anestesie os peixes mantendo-os nesta solução de trabalho até que o movimento do corpo e das guelras diminui (tipicamente por alguns minutos).

4. injeção de solução de plasmídeo

1. Encha o capilar de vidro preparado com 10 μL de solução de plasmídeo usando pontas do microloader. Evite a formação de bolhas de ar dentro do capilar.
2. Prima menu/alterar capilar no dispositivo de injecção. Insira e fixe a agulha no suporte da agulha.
3. um estereomicroscópio com uma ampliação de 3,2 x ou 4x, corte apenas a ponta do capilar usando pinça Fine-end. Mude o dispositivo da injeção do modo capilar da mudança no modo da injetora , a seguir aplique a pressão com um pedal do pé para assegurar-se de que a solução do plasmídeo esteja funcionando facilmente fora da agulha e sem obstáculo.
4. Transfira o peixe do tanque de pecuária para o recipiente (caixa plástica) com solução anestésica. Aguarde alguns minutos até o movimento das guelras Subsides.
5. Coloque os peixes na esponja pré-molhada com o lado dorsal virado para cima. Execute todas as seguintes etapas da injeção o estereomicroscópio para assegurar a exatidão do procedimento.
6. Usando uma microfaca de dissecação de aço inoxidável com 40 mm de aresta de corte e 0,5 mm de espessura, crie um pequeno furo no crânio de peixe no lado posterior do telencídeo (Figura 1b), ao lado da borda com Tectum óptico.
   Nota: Esta etapa deve ser realizada com cuidado uma vez que o furo deve ser muito pequeno e superficial, penetrando unicamente o crânio, para evitar danos cerebrais.
7. Incline o peixe conforme necessário e Oriente a ponta do capilar de vidro em direção ao crânio no ângulo correto para facilitar a penetração da ponta capilar através do orifício.
8. Insira a ponta do capilar através do orifício no crânio com cuidado até atingir o ventrículo telencefálico (ver Figura 1b). Isto exigirá a penetração através da camada de pilha ependymal dorsal. Tenha especialmente cuidado para não inserir o capilar muito profundamente para evitar o contato com o tecido cerebral. Mantenha o capilar precisamente entre os hemisférios, permanecendo dentro do ventrículo logo após perfurar a camada ependymal dorsal.
   Nota: Este é um passo muito delicado. A exatidão deste procedimento é melhorada usando linhas do mutante da pigmentação tais como brassy²⁴, permitindo a melhor visualização da posição capilar de vidro durante a injeção.
9. Com a ponta capilar dentro do ventrículo, injete a solução de plasmídeo aplicando pressão com o pedal por cerca de 10 s, o que corresponde a aproximadamente 1 μL de solução de plasmídeo.
   Nota: Se mudar o extrator da agulha, os capilares ou o injector, o sistema deve ser calibrado a fim entregar sempre 1 μL da solução do plasmídeo. A calibração pode ser realizada medindo-se o diâmetro da gota de plasmídeo expelido em óleo mineral (por exemplo, óleo de parafina) e, posteriormente, calculando o volume da gotículo. Após 10 s de injecção, deve haver ~ 1 μL de líquido plasmídeo expelido para o óleo mineral.
10. Confirme o sucesso da etapa precedente observando a propagação do líquido durante todo o ventrículo.

5. electroporação

1. Retire o peixe do conjunto de injeção enquanto ainda o segura na esponja.
2. Mergulhe o lado interno da ponta dos eletrodos no gel de ultra-som.
3. Cubra o telencon de peixes com uma pequena quantidade de gel de ultra-som.
4. Posicione a cabeça de peixe entre os eletrodos, colocando o eletrodo positivo no lado ventral da cabeça do peixe e o eletrodo negativo no lado dorsal (Figura 1C), enquanto ainda mantém o corpo do peixe na esponja. Isto ajusta o sentido do fluxo da corrente necessária para electroporate o ependymoglia posicionado na zona zona.
5. Pressione os eletrodos suavemente e precisamente contra o telencótido (Figura 1C). Administrar a corrente com o pedal do pé. Segure os eletrodos no lugar até que todos os cinco pulsos estão acabados.

6. recuperação dos peixes

1. Deixe o peixe recuperar-se no tanque previamente preparado, continuamente aerado até que acorde. O gel do Lidocaine podia ser aplicado no crânio a fim aliviar toda a dor possivelmente desenvolvida.

Resultados

O método de eletroporação descrito permite a entrega do DNA plasmídeo em células ependimogliais, localizadas superficialmente no telencédigo zebrafish e logo abaixo da camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a).

Se o resultado da eletroporação for positivo, rotulados células ependymogliais únicas (células vermelhas na Figura 2a, b) podem ser observadas entre outr...

Discussão

Este protocolo do Electroporation é um método in vivo de confiança de etiquetar pilhas ependymoglial individuais. O protocolo pode precisar de uma adaptação adicional para rotular outros tipos de células, como neurônios ou oligodendrócitos. Para conseguir a rotulagem bem sucedida, os plasmídeos que contêm promotores diferentes podem ser usados. O promotor da galinha-beta actina, o eF1alpha, o CMV e o promotor do ubiquitin foram usados previamente para conduzir a expressão de transgenes diferentes no ependymogl...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161