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Resumo

A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

Resumo

O transplante de medula óssea alogênico (TMO) é uma terapia eficaz para malignidades hematológicas devido ao efeito enxerto versus leucemia (GVL) para erradicar tumores. No entanto, sua aplicação é limitada pelo desenvolvimento da doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), uma grande complicação da TMO. GVHD é evocado quando as células T nos enxertos doadores reconhecem alloantigen expresso por células receptoras e montam ataques imunológicos indesejados contra tecidos saudáveis receptores. Assim, as terapias tradicionais são projetadas para suprimir a aloreatividade das células T do doador. No entanto, essas abordagens prejudicam substancialmente o efeito GVL para que a sobrevivência do destinatário não seja melhorada. Compreender os efeitos das abordagens terapêuticas em TMO, GVL e GVHD é, portanto, essencial. Devido às capacidades de apresentação de antígenos e secreção de citocinas para estimular células T doadoras, as células dendríticas receptoras (DCs) desempenham um papel significativo na indução do GVHD. Portanto, direcionar dCs destinatários torna-se uma abordagem potencial para controlar o GVHD. Este trabalho fornece uma descrição de uma nova plataforma de TMO para investigar como os DCs host regulam as respostas GVH e GVL após o transplante. Também é apresentado um modelo eficaz de TMO para estudar a biologia do GVHD e gvl após o transplante.

Introdução

O transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas (TMO) é uma terapia eficaz para tratar malignidades hematológicas1,2 através do efeito enxerto-versus-leucemia (GVL)3. No entanto, os linfócitos doadores sempre montam ataques imunológicos indesejados contra tecidos receptores, um processo chamado doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD)4.

Os modelos murine de GVHD são uma ferramenta eficaz para estudar a biologia do GVHD e a resposta GVL5. Camundongos são um modelo animal de pesquisa econômico. São pequenos e eficientemente dosados com moléculas e biológicas nas fases iniciais do desenvolvimento6. Camundongos são animais de pesquisa ideais para estudos de manipulação genética por serem geneticamente bem definidos, o que é ideal para estudar caminhos biológicos e mecanismos6. Vários modelos de complexo de histocompatibilidade maior estrito do mouse (MHC) MHC-incompatíveis de GVHD foram bem estabelecidos, tais como C57BL/6 (H2b) para BALB/c (H2d) e FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Estes são modelos particularmente valiosos para determinar o papel de tipos de células individuais, genes e fatores que afetam o GVHD. Transplante de C57/BL/6 (H2b) doadores parentais para receptores com mutações no MHC I (B6.C-H2bm1) e/ou MHC II (B6.C-H2bm12) revelaram que uma incompatibilidade tanto na classe MHC I quanto na classe II é um requisito importante para o desenvolvimento do GVHD agudo. Isso sugere que tanto as células CD4+ quanto CD8+ T são necessárias para o desenvolvimento da doença7,8. GVHD também está envolvido em uma cascata inflamatória conhecida como a "tempestade de citocinas pró-inflamatórias"9. O método de condicionamento mais comum em modelos de murina é a irradiação corporal total (TBI) por raio-X ou 137Cs. Isso leva à ablação da medula óssea do receptor, permitindo assim o enxerto de células-tronco do doador e prevenindo a rejeição do enxerto. Isso é feito limitando a proliferação de células T receptoras em resposta às células doadoras. Além disso, as disparidades genéticas desempenham um papel importante na indução da doença, que também depende da menor incompatibilidademhc-incompatível 10. Portanto, a dose mieloablativa de irradiação varia em diferentes cepas de camundongos (por exemplo, BALB/c→C57BL/6).

A ativação de células T doadoras por células apresentadoras de antígenos hospedeiros (APCs) é essencial para o desenvolvimento do GVHD. Entre os APCs, as células dendríticas (DCs) são as mais potentes. Eles são herdavelmente capazes de induzir GVHD devido à sua captação superior de antígenos, expressão de moléculas co-estimuladoras de células T e produção de citocinas pró-inflamatórias que polarizam as células T em subconjuntos patogênicos. Os DCs receptores são fundamentais para facilitar a escorva de células T e a indução de GVHD após o transplante11,12. Assim, os DCs tornaram-se alvos interessantes no tratamento do GVHD12.

O TCE é necessário para melhorar o enxerto celular do doador. Devido ao efeito TBI, os DCs receptores são ativados e sobrevivem por um curto período de tempo após o transplante12. Apesar dos grandes avanços no uso da bioluminescência ou fluorescência, estabelecer um modelo eficaz para estudar o papel dos DCs receptores no GVHD ainda é desafiador.

Como as células T doadoras são a força motriz para a atividade da GVL, estratégias de tratamento usando drogas imunossupressoras, como esteróides, para suprimir a aloreatividade das células T, muitas vezes causam recaída ou infecçãotumoral 13. Portanto, direcionar os DCs receptores pode fornecer uma abordagem alternativa para tratar o GVHD, preservando o efeito GVL e evitando a infecção.

Em resumo, o presente estudo fornece uma plataforma para entender como diferentes tipos de sinalização em DCs receptoras regulam o desenvolvimento de GVHD e o efeito GVL após o TMO.

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Protocolo

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Flórida Central.

1. Indução GVHD

NOTA: O transplante de células de medula óssea alogênica (BM) (etapa 1.2) é realizado dentro de 24h após a irradiação. Todos os procedimentos descritos abaixo são realizados em ambiente estéril. Realize o procedimento em uma capa de cultura de tecido e use reagentes filtrados.

  1. Dia 0: Prepare os ratos receptores.
    1. Use camundongos do tipo selvagem feminino (WT) em um fundo BALB/c (CD45.2+ H2kd+), 10-12 semanas de idade como destinatários.
    2. Tag ear e pesar os receptores antes do TBI. Em seguida, coloque até 11 ratos na câmara de irradiação e mantenha-os no irradiador. Irradie em uma dose única de 700 cGy por 10-15 min.
    3. Devolva animais irradiados para as gaiolas e os abriga em instalações livres de patógenos antes do transplante.
      NOTA: O peso corporal mínimo dos receptores deve ser de cerca de 20 g. Use este peso como referência para calcular a perda de peso corporal durante o período experimental.
  2. Dia 1: Preparar medula óssea empobrecida com células T (TCD-BM) dos camundongos doadores.
    1. Eutanásia CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 camundongos por asfixia de CO2 e aguardem por 2-3 min até ficarem inconscientes. Realizar a luxação cervical como uma eutanásia secundária, se necessário.
    2. Coloque cada rato em uma tábua de trabalho limpa. Higienize a pele e a pele com 70% de isopropanol.
    3. Recolher a tíbia e o fêmur de ambas as pernas usando fórceps e tesouras. Coloque-os em RPMI frio contendo 1% de FCS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 2 mM L-glutamina (1% RPMI) em tubos cônicos de 50 mL. Limpe bem o fêmur e os ossos da tíbia removendo todos os tecidos musculares usando fórceps e tesouras. Transfira o fêmur e a tíbia dos tubos cônicos de 50 mL para uma placa de Petri de 92 mm de diâmetro contendo 1% de RPMI.
    4. Com uma tesoura, corte as pontas do fêmur ou da tíbia. Encha um tubo de 50 mL com 25 mL de 1% de meio RPMI 1640. Use isso para encher uma seringa de 3 mL presa a uma agulha de 26 G com 3 mL de 1% de RPMI. Insira esta seringa no osso e empurre o êmbolo para tirar a medula óssea (BM) da cavidade para dentro do tubo de coleta com 1% de RPMI (~3 mL/osso).
    5. Repita o passo 1.2.4 para todos os ossos restantes da tíbia e do fêmur de outros camundongos doadores. Mantenha todos os tubos de coleta no gelo.
    6. Faça a suspensão de uma única célula lavando os pedaços de medula óssea através de um filtro de células de malha de 75 μm. Recolher a suspensão unicelular em um tubo de 50 mL.
    7. Tubos de centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Aspire e descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota no tampão PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) a 20 x 106 células/mL. Guarde uma alíquota de 2 x 106 células para coloração de pureza.
    8. Adicione o anticorpo Thy 1 a 0,05 μg/106 células14 e incubar por 30 min a 4 °C. Lave uma vez com 25 mL de PBS gelada. Resuspender a 20 x 106/mL em 0,5% BSA/10% de complemento de coelho jovem/2% DNase (10.000 U/mL em H2O estéril). Incubar por 45 min a 37 °C e lavar 2x como antes.
      NOTA: As células T são esgotadas usando um mAb específico para Thy1, uma proteína expressa por todas as células T, mas não por outros leucócitos.
    9. Resuspender as células em 20 mL de tampão PBS contendo 0,5% de BSA. Conte as células de medula óssea em 1% de ácido acético usando um hemocytometro. Mantenha uma alíquota de 2 x 106 células para uma verificação de pureza por citometria de fluxo após a purificação celular.
      NOTA: Um rato doador normalmente gera cerca de 25 x 106 TCD-BM.
    10. Use citometria de fluxo para confirmar um esgotamento bem sucedido da célula T. Mancha 1 x 106 células, preservadas das etapas 1.2.7 (antes do esgotamento da célula T) e 1.2.9 (TCD-BM após esgotamento da célula T) com os seguintes anticorpos: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).
  3. Dia 1: Prepare células T dos ratos doadores
    1. Use cd45.2+ H2kb+ C57BL/6 camundongos do tipo selvagem (WT) como doadores para células T.
    2. Eutanie camundongos C57BL/6 por asfixia por dióxido de carbono (CO2) conforme descrito em 1.2.1.
    3. Limpe bem a pele e a pele do rato com 70% de etanol. Excise baços e linfonodos e separe-os em uma única suspensão celular de esplenocites usando um êmbolo de seringa e filtros de malha de 40 μm. Lave o filtro e o êmbolo de seringa com 1% de RPMI (1% FBS contendo mídia RPMI) para coletar todos os esplenocitos.
    4. Centrifugar a suspensão celular a 800 x g por 5 min a 4 °C. Adicionar 5 mL de tampão de revestimento ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) depois de descartar o sobrenadante. Incubar a suspensão celular por 5 min em temperatura ambiente.
      NOTA: O tampão de lyse ACK é usado para a repressão de glóbulos vermelhos.
    5. Adicione 5 mL de 1% rpmi para parar a lésia. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    6. Prepare o tampão de classificação celular ativado por gelo (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA em PBS, pH 7.2). Degas o buffer antes de usar. Resuspenda as pelotas de célulaem 5 mL de tampão MACS.
    7. Conte os esplenocites e verifique as células vivas e mortas usando um hemocytometer e 1% de trippan azul. Guarde uma alíquota de 2 x 106 células para avaliar o rendimento de purificação com análise de citometria de fluxo.
    8. Resuspender os esplenocites na concentração de 200 x 106/mL no tampão MACS. Adicionar 0,03 μL de biotina anti-mouse-Ter-119, 0,03 μL de biotina anti-rato-CD11b, 0,03 μL de biotina anti-mouse-CD45R e 0,03 μL de biotina anti-mouse-DX5 por 106 células. Incubar por 15 min a 4 °C.
      NOTA: Biotina anti-mouse-Ter-119, biotina anti-mouse-CD11b, biotina anti-rato-CD45R e biotina anti-mouse-DX5 foram usadas para reagir com células eritróidas, granulócitos, células B e NK, respectivamente. Portanto, esses subconjuntos celulares estão esgotados na etapaseguinte 15.
    9. Adicione 10 mL de tampão MACS gelado à suspensão celular. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    10. Resuspender as pelotas celulares no tampão MACS a uma concentração de 100 x 106/mL. Adicione microesferas anti-biotina (0,22 μL/106 células) à suspensão do esplenocite. Misture bem e incubar por mais 15 min a 4 °C. Lave a suspensão celular uma vez com 10 mL de tampão MACS gelado. Centrifugação a 800 x g por 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante.
    11. Coloque uma coluna de separação magnética no campo magnético. Enxágüe a coluna com 3 mL de tampão MACS. Deixe a suspensão da célula na coluna. Coletar o fluxo constituído por células T não encadernadas e enriquecidas, em um novo tubo cônico de 15 mL. Lave a coluna MS com 3 mL de tampão MACS gelado.
      NOTA: Certifique-se de que a coluna está vazia antes de executar as etapas de lavagem.
    12. Centrifugar a suspensão celular a 800 x g por 5 min a 4 °C. Resuspenda a pelota celular em 5 mL de tampão MACS.
    13. Conte as células em azul trippan de 1% usando um hemocytometro. Guarde uma alíquota de 2 x 106 células para uma verificação de pureza por citometria de fluxo.
      NOTA: O rendimento médio das células T esplênicas isoladas por este método é de ~20-25 x 106 células por rato.
    14. Confirme o rendimento do enriquecimento da célula T por citometria de fluxo. Mancha 1 x 106 células, preservadas das etapas 1.3.7 (antes do esgotamento da célula T) e 1.3.13 (TCD-BM após o esgotamento da célula T), com os seguintes anticorpos: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).
  4. Dia 1: Injete camundongos irradiados com células T doadoras e TCD-BM.
    1. Lave as células TCD-BM e T 2x com PBS (800 x g para 5 min a 4 °C). Resuspenda as células em PBS frio para injeção. Ajuste a concentração celular para 20 x 106/mL para TCD BM e 4 x 106/mL para células T.
    2. Aqueça o animal usando uma lâmpada de aquecimento para aumentar a visibilidade das veias traseiras bilaterais. Se necessário, coloque o rato em uma contenção.
    3. Limpe a superfície da cauda usando 70% de isópropanol. Injetar TCD-BM (5 x 106 células/mouse) com ou sem células T (0,75 x 106 células/mouse). Tenha cuidado para não introduzir ar na seringa.
    4. Remova a agulha e aplique um cotonete anti-séptico diretamente no local da injeção 5-10 s para parar qualquer sangramento.
  5. Avalie o GVHD nos dias 2-80.
    1. Acompanhe a sobrevivência dos animais. Monitore os sinais clínicos de GVHD adaptados do sistema de pontuação estabelecido anteriormente por Cook et al.16 e o peso corporal dos camundongos receptores 2x por semana. Use o peso corporal determinado antes do TCE para calcular a perda de peso corporal.
    2. Pesar cada rato individualmente. Escore a perda de peso da seguinte forma: grau 0 = menos de 10%; grau 1 = 10%-20%; grau 2 = mais de 20%.
    3. Pontuação o sinal de postura dos beneficiários: grau 0 = sem palpite; grau 0,5 = leve palpite, mas endireita-se ao caminhar; grau 1 = animal permanece curvado ao caminhar; grau 1,5 = animal não se endireita; grau 2.0 = pé animal nos dedos traseiros.
    4. Pontuação o sinal de mobilidade dos beneficiários: grau 0 = muito ativo; grau 0,5 = mais lento que camundongos ingênuos; grau 1,0 = movimentos somente quando cutucados; grau 1,5 = movimentos ligeiramente quando cutucados; grau 2.0 = não se move quando cutucado.
    5. Pontuação da pele dos receptores: grau 0 = sem escoriações, lesões ou escala; grau 0,5 = vermelhidão em uma área específica; grau 1 = abrasão em uma área ou abrasão leve em duas áreas; grau 1,5 = escoriações graves em duas ou mais áreas; grau 2.0 = escoriações graves, pele rachada, sangue seco.
    6. Pontuação da pele dos receptores: grau 0 = sem sinais anormais; grau 0,5 = ridicularização na lateral da barriga ou nuca do pescoço, grau 1,0 = desviamento através ou do lado da barriga e pescoço; grau 1,5 = pele emaranhada e babada; grau 2.0 = pele mal emaranhada na barriga e nas costas.
    7. Pontuação da diarreia dos beneficiários: grau 0 = sem diarreia; grau 0,5 = fezes leves e macias; grau 1,0 = leve (fezes amarelas); grau 1,5 = moderado (fezes amarelas com um pouco de sangue); grau 2 = grave (fezes amarelas e ensanguentadas, "fezes de bolo seco" aparecem na área anal).

2. Modelo de Cotransplante

  1. Gerar células dendríticas derivadas da medula óssea (BM-DCs).
    1. Isole a medula óssea dos fêmures e tíbias de TW ou fator B (fB)-/- camundongos no fundo B6 conforme descrito nos passos 1.2.3-1.2.4. Gire as células a 800 x g por 5 min.
    2. Ressuspensão da pelota em 5 mL de tampão de latrização ACK para lésis de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão celular por 5 min no gelo. Adicione 10 mL de 1% rpmi à suspensão celular para parar a lésia e centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    3. Resuspender as pelotas celulares em 10 mL de mídia de cultura (RPMI 1460 contendo 10% FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2 mM l-glutamina e 50 mM β-mercaptoetanol) e ajustar o volume para atender à concentração final de 2 x 106 células/mL.
    4. Adicione o fator estimulante da colônia de granulocyte-macrófago de 20 ng/mL (GM-CSF) à suspensão celular. Cultura as células de medula óssea em placas de Petri de 100 x 15 mm a 37 °C em 5% de CO2 por 6 dias.
    5. Substitua metade da mídia de cultura em curso (cerca de 5 mL) por mídias frescas contendo 40 ng/mL GM-CSF no dia 3.
    6. Pré-aqueça a mídia cultural em um banho de água a 37 °C. Colete cerca de 5 mL da mídia dos pratos de cultura de medula óssea. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota de célula em meios de cultura de 5 mL contendo 40 ng/mL GM-CSF.
    7. Adicione 25 μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) à mídia no dia 6 da cultura para amadurecer os BM-DCs. Salve uma alíquota de 2 x 106 células para determinar a eficácia da diferenciação dc por citometria de fluxo.
    8. Coletar BM-DCs maduros: Use elevadores de célulapara raspar suavemente DCs das placas de Petri. Recolher todas as suspensões celulares em tubos cônicos de 50 mL. Centrífuga a 800 x g,por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Lave as pelotas de célula3x com 50 mL de PBS gelado. Economize cerca de 2 x 106 BM-DCs para análise de fenótipo imunológico por citometria de fluxo.
  2. Realizar co-transplante de células dendríticas de TMO (TMO COTRANSPLANTE DC-cotransplante).
    NOTA: Use camundongos FVB (H2kq) como doadores para células T e células BM. Irradiar B6 Ly5.1 camundongos receptores em uma dose de 1.100 cGy (2 doses, intervalo de 3 h). Veja detalhes na etapa 1.1.
    1. Isolar bm de fêmures e tíbias dos camundongos doadores do FVB. Veja detalhes nas etapas 1.2.3-1.2.10.
      NOTA: Use medula óssea total isolada em vez de TCD-BM neste modelo.
    2. Purificar células T dos baços e linfonodos dos camundongos doadores do FVB. Veja detalhes nas etapas 1.3.1-1.3.13.
    3. Injete BM (5 x 106/mouse), Células T (0,5 x 106/mouse) com BM-DCs (2 x 106/mouse) no dia 0 do curso experimental.
    4. No 3º dia após o transplante, examine a reconstituição do doador DC por citometria de fluxo.
      1. Coletar sangue dos olhos dos receptores.
      2. Anestesiar os camundongos CD45.1/Ly5.1 B6 por inalação isoflurana de 3%. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a um pinça do dedo do dedo.
      3. Coloque um tubo de pipeta de vidro estéril no canto medial do olho direcionado caudally a um ângulo de 30-45° do plano do nariz. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo.
      4. Jogue o sangue em tubos de microcentrífuge estéreis de 1,5 mL contendo heparina. Transfira 50 μL de sangue para tubos de fluxo de vidro de 5 mL.
      5. Adicione 2 mL de buffer de lysing ACK. Incubar a 37 °C em banho-maria por 45 min. Adicione 2 mL de tampão de coloração FACS. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
      6. Resuspender as pelotas celulares com 200 μL de tampão FACS contendo anticorpos de coloração de fluxo apropriados (amarelo vivo/morte, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c e α-MHCII). Incubar por 15 min a 4 °C no escuro. Lave 2x com tampão FACS de 1 mL. Resuspender as pelotas celulares em 200 μL de tampão FACS e realizar a análise por citometria de fluxo.

3. Modelos GVHD/GVL de BMT

  1. Realize a indução GVHD/GVL.
    1. Cultura a luciferase transduziu linfoma de células A20 B em meios de cultura RPMI.
    2. Irradiar fundo BALB/c WT ou receptor Ly5.1 a 700 cGy (dose única). Veja detalhes na etapa 1.1.
    3. Isolar TCD-BM dos fêmures e tíbias de B6. Ly5.1 ratos doadores. Veja detalhes nas etapas 1.2.1-1.2.10.
    4. Purificar células T de baços e linfonodos dos camundongos doadores C57BL/6. Veja detalhes nas etapas 1.3.1-1.3.15.
    5. Lave o linfoma A20 2x com 25 mL de PBS. Resuspenda as pelotas celulares em 10 mL de PBS gelado. Pegue uma alíquota de suspensão celular (10 μL) e conte as células usando 1% de trippan azul e um hemocytometer. Ajuste a concentração celular para 20.000 células/mL.
    6. Injetar TCD-BM (5 x 106/mouse) com ou sem células T (0,75 x 106/mouse) e linfoma A20 (5.000 células/mouse).
    7. Acompanhamento sobre a sobrevivência do receptor, sinais clínicos GVHD e perda de peso corporal durante o curso experimental. Veja detalhes na etapa 1.5.
  2. Faça imagens bioluminescentes.
    1. Monitore o crescimento do tumor no receptor transplantado injetando os camundongos receptores com 4 mg de D-luciferina. Incubar por 5 min para garantir que a luciferina reaja com luciferase.
    2. Anestesiar o mouse usando 3% de isoflurano na câmara de um imager de bioluminescência e imagem dos receptores por 5 min no campo D e o tempo de exposição de 1 min.
    3. Analisar dados usando software de análise de imagens. Altere a escala das imagens pseudo coloridas para obter melhores resultados.
      NOTA: Todas as imagens devem estar na mesma escala entre os experimentos.
    4. Use o software de análise de imagem para determinar as regiões de interesse e quantificar a densidade do sinal calculando o fluxo (fótons/s) emitido de cada região de interesse.

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Resultados

O principal modelo B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)correspondeu de perto ao desenvolvimento do GVHD após o transplante(Figura 2). Todos os seis sinais clínicos gvhd estabelecidos anteriormente por Cooke et al.16 ocorreram nos receptores transplantados com células T WT-B6, mas não nos receptores transplantados apenas com BM (etapa 1,5), que representavam o grupo GVHD-negativo. Existem duas fases no desenvolvimento do GV...

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Discussão

O uso de células-tronco para se adequar a um indivíduo específico é uma abordagem eficaz para tratar cânceres avançados e resistentes18. Os fármacos de pequenas moléculas, no entanto, têm permanecido por muito tempo um foco primário da terapia personalizada contra o câncer. Por outro lado, na terapia celular uma infinidade de interações entre doador e hospedeiro pode influenciar decisivamente os desfechos do tratamento, como o desenvolvimento do GVHD após a TMO1

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo é apoiado pela Bolsa inicial da University of Central Florida College of Medicine (à HN), pela bolsa inicial do Centro Médico hillman Hillman (para a HL), pelo Bolsa de #1P20CA210300-01 do Ministério da Saúde dos Estados Unidos #4694 (para a PTH). Agradecemos ao Dr. Xue-zhong Yu da Universidade Médica da Carolina do Sul por fornecer materiais para o estudo.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA pH 8.0 100MLFisher ScientificBP2482100MACS buffer
10X PBSFisher ScientificBP3994MACS buffer
A20 B-cell lymphomaUniversity of Central FloridaIn houseGVL experiment
ACC1 fl/flJackson Lab30954GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4creUniversity of Central FloridaGVL experiment
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-485T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700Thermo Fisher Scientific117319Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PEThermo Fisher Scientific12-0251-82Flow staining
Anti-Mouse CD4 BiotinThermo Fisher Scientific13-0041-86T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement)Thermo Fisher Scientific48-0042-82Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APCThermo Fisher Scientific17-5320-82Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 BiotinThermo Fisher Scientific13-5921-85T-cell enrichment
Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM generation
B6 fB-/- miceUniversity of Central FloridaIn houseRecipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) miceCharles River564Donors
BALB/c miceCharles River028Transplant recipients
C57BL/6 miceCharles River027Donors/Recipients
CD11bThermo Fisher Scientific13-0112-85T-cell enrichment
CD25-biotinThermo Fisher Scientific13-0251-82T-cell enrichment
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotinThermo Fisher Scientific13-5971-82T-cell enrichment
Cell strainer 40 uMThermo Fisher Scientific22363547Cell preparation
Cell strainer 70 uMThermo Fisher Scientific22363548Cell preparation
D-LuciferinGoldbioLUCK-1GLive animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta Bilogicals R&D systemD17051Cell Culture
Flow cytometry tubesFisher Scientific352008Flow cytometry analysis
FVB/NCrlCharles River207Donors
Lipopolysacharide (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC mature
LS columnMitenyi Biotec130-042-401Cell preparation
MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubatorEppendorfGalaxy 170 RCell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)GIBCO15140Media
RPMI 1640Thermo Fisher Scienctific11875-093Media
TER119Thermo Fisher Scientific13-5921-82T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200Perkin ElmerXenogen IVIS-200Live animal imaging
X-RAD 320 Biological IrradiatorPrecision X-RAYX-RAD 320Total Body Irradiation

Referências

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