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Resumo

Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.

Resumo

Espera-se que os sistemas microfisiológicos (MPS) recém-introduzidos que cultivam organoides humanos tenham um desempenho melhor do que os animais na fase de testes pré-clínicos do processo de desenvolvimento de medicamentos porque são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Neste estudo, a barreira intestinal humana (emulada por uma co-cultura de células Caco-2 e HT-29) e o equivalente hepático (emulado por esferoides feitos de células hepaRG diferenciadas e células estelares hepáticas humanas) foram integrados em um dispositivo microfluido de dois órgãos (2-OC) para avaliar algumas propriedades farmacocinóficas (APAP) e toxicológicas. O MPS tinha três conjuntos: Intestino apenas 2-OC, Fígado apenas 2-OC, e Intestino/Fígado 2-OC com a mesma mídia perfusando ambos organoides. Para avaliações de PK, dosamos o APAP na mídia em momentos de predefinição após a administração sobre a barreira intestinal (emulando a rota oral) ou na mídia (emulando a rota intravenosa), a 12 μM e 2 μM, respectivamente. As amostras de mídia foram analisadas por cromatografia líquida de alta pressão de fase invertida (HPLC). Os organoides foram analisados para expressão genética, para valores de TEER, para expressão e atividade proteica, e depois coletados, fixos e submetidos a um conjunto de avaliações morfológicas. A técnica MTT teve um bom desempenho na avaliação da viabilidade organoide, mas as análises de alto teor (HCA) foram capazes de detectar eventos tóxicos muito precoces em resposta ao tratamento apap. Verificamos que o fluxo de mídia não afeta significativamente a absorção de APAP, enquanto melhora significativamente a funcionalidade equivalente hepática. A absorção intestinal humana apap e o metabolismo hepático poderiam ser emulados no MPS. A associação entre os dados do MPS e na modelagem de sílico tem grande potencial para melhorar a previsibilidade dos métodos in vitro e proporcionar melhor precisão do que os modelos animais em estudos farmacocinéticos e toxicológicos.

Introdução

Devido a diferenças genômicas e proteômicas, os modelos animais têm valor preditivo limitado para vários desfechos humanos. Além disso, são demorados, caros e eticamente questionáveis1. O MPS é uma tecnologia relativamente nova que visa melhorar a potência preditiva e reduzir os custos e o tempo gasto com testes pré-clínicos. São dispositivos microfluidos que cultivam organoides (unidades funcionais de mimética artificial de órgãos) sob fluxo de mídia que promove a comunicação organóide-organóide. Organoides feitos de células humanas aumentam a relevância translacional2,3,4. Espera-se que o MPS se comtrate melhor do que os testes em animais porque eles são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Quando totalmente funcional, o MPS fornecerá resultados mais significativos, em maior velocidade e menores custos e riscos4. Muitos grupos estão desenvolvendo MPS para vários propósitos, especialmente modelos de doenças para testar a eficácia da droga.

O nível de exposição é um dos parâmetros mais críticos para avaliar a eficácia e toxicidade da droga5,6,7,8,9,10,11,12. O MPS permite a integração organoide que emula exposição sistêmica e espera-se que seja melhor do que a cultura tradicional do tecido humano 2D. Esta tecnologia pode melhorar significativamente a previsão de absorção intestinal composta e metabolismo hepático4.

Um MPS integrando modelo equivalente humano de intestino e fígado é um bom ponto de partida, considerando o papel central desses dois órgãos na biodisponibilidade de medicamentos e exposição sistêmica13,14,15. APAP é uma droga atraente para estudar um MPS sem um equivalente renal porque sua metabolização é feita principalmente pelo fígado16,17.

O 2-OC é um dispositivo microfluido de duas câmaras adequado para a cultura de dois diferentes tecidos/organoides equivalentes humanos interligados por microcanais16. A fim de emular uma administração oral/intravenosa humana in vitro de uma droga e avaliar os efeitos da conversa cruzada entre o intestino e os equivalentes hepáticos na farmacocinética APAP, além da funcionalidade e viabilidade dos organoides, foram realizados três diferentes conjuntos de MPS: (1) um "Intestino 2-OC MPS" composto por um equivalente intestinal baseado em uma inserção cultural contendo uma cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada ao dispositivo 2-OC; (2) um "Liver 2-OC MPS" composto por esferoides hepáticos feitos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados no dispositivo 2-OC; e (3) um "Intestino/Fígado 2-OC MPS" composto pelo equivalente do intestino em um compartimento de dispositivo comunicando-se com o equivalente hepático no outro pelo fluxo de mídia através dos canais microfluidos.

Todos os ensaios foram realizados sob condições estáticas (sem fluxo) e dinâmicas (com fluxo) devido ao impacto dos estímulos mecânicos (compressão, alongamento e cisalhamento) na viabilidade e funcionalidades da célula18,19,20. O presente artigo descreve o protocolo para emulação de administração oral/intravenosa da APAP e as respectivas análises de absorção/metabolismo e toxicológicas no MPS 2-OC contendo modelos equivalentes de intestino humano e fígado.

Protocolo

1. Produção de equivalentes teciduais para cultivo no 2-OC

  1. Produção equivalente de barreira intestinal pequena
    1. Manter as células Caco-2 e HT-29 utilizando o meio equivalente intestinal: DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% penicilina e estreptomicina, e 1% aminoácidos não essenciais, que é nomeado como "DMEM S" neste manuscrito.
    2. Retire o meio, lave duas vezes com 1x DPBS e adicione 8 mL de 0,25% Trypsin/EDTA para dissociar células Caco-2 cultivadas em frascos de cultura celular (175 cm2). Incubar por 5 min a 37 °C e parar a reação adicionando pelo menos o volume duplo do inibidor de trippsina. Realize o mesmo procedimento para células HT-29, ajustando os volumes de reagentes, uma vez que uma quantidade menor dessas células é necessária e elas são mantidas em frascos menores (75 cm2).
    3. Centrífuga a 250 x g por 5 min, remova o sobrenante de ambos os tubos e resuspenda as pelotas de células em 10 mL de células DMEM S. Count, assegurando uma viabilidade celular superior a 80%. Asepticamente integram as inserções da cultura celular em uma placa de 24 poços previamente preenchida com 400 μL de DMEM S por poço no lado basolateral (que representa a corrente sanguínea humana).
    4. Co-cultivar células Caco-2 e HT-29 a uma proporção de 9:121. Use 2,25 x 105 Caco-2 e 2,5 x 104 células HT-29 em cada intestino equivalente em um volume final de 200 μL de DMEM S. Ajuste os números e volumes celulares de acordo com o número desejado de organoides. Misture com cuidado.
    5. Pipeta 200 μL de solução celular no lado apical de cada inserção (que representa o lado do lúmen intestinal humano), semeando 250.000 células por inserção. Co-cultivar as células nas pastilhas por três semanas22. Troque o meio pelo menos três vezes por semana, aspirando-o tanto dos lados apical quanto basolateral com uma pipeta Pasteur estéril, tomando cuidado para não danificar a barreira celular intacta.
      NOTA: Proceda com a aspiração no lado apical, de modo a não tocar na barreira celular (aspirar apoiando a pipeta Pasteur na borda plástica da pastilha da célula).
    6. Verifique a formação apertada de monocamadas medindo o TEER (resistência elétrica transeptelial) a cada três dias usando um voltímetro23,de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Realize um espaço em branco, medindo a resistência através de uma inserção de cultura celular sem células, mas com o mesmo meio celular e na mesma placa celular.
      2. Calcule a resistência tecidual subtraindo a resistência em branco da resistência equivalente ao tecido e multiplique pela área de superfície eficaz da membrana do filtro (0,6 cm2). Uma boa resistência à barreira intestinal está em uma faixa de 150 a 400 Ω∙cm2.
        NOTA: Após 21 dias as células devem ser totalmente diferenciadas e a barreira intestinal se formou, de modo que os equivalentes do intestino estão prontos para serem integrados ao MPS.
  2. Produção de equivalentes hepáticos
    1. Manter células HepaRG usando o meio equivalente hepático, que é o E médio de William complementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM L-glutamina, 100 unidades/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 5 μg/mL insulina humana e 5 x 10-5 M hidrocortisona, e é chamado de "Williams E S" neste manuscrito. Renove a mídia HepaRG a cada 2-3 dias e mantenha a cultura celular por duas semanas para iniciar a diferenciação em hepatócitos e cholangiocitos.
    2. Após as duas primeiras semanas, adicione 2% de DMSO ao meio da HepaRG por mais duas semanas para completar a diferenciação celular24,25. Grow HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), usando frascos de cultura celular revestidos de poli-L-lysina, mudando a mídia a cada dois ou três dias.
    3. Retire o meio, lave duas vezes com 1x DPBS e adicione 8 mL de 0,05% Trypsin/EDTA, para dissociar células HepaRG cultivadas em frascos de cultura celular (175 cm2). Incubar por 5 a 10 min a 37 °C e parar a reação adicionando pelo menos o dobro do volume do inibidor de trippsina. Execute o mesmo para HHSTeC, adaptando o volume de reagentes, uma vez que uma quantidade menor dessas células são necessárias e elas podem ser mantidas em frascos menores (75 cm2).
    4. Centrifugar ambos a 250 x g por 5 min, remover o supernasce e resuspensar as pelotas de célula no meio Williams E S. Contar células, assegurando uma viabilidade celular superior a 80%.
    5. Gere os esferoides hepáticos que combinam células HepaRG e HHSTeC a uma proporção de 24:1, respectivamente, no meio Williams E S16. Adicione 4,8 x 104 HepaRG diferenciado e 0,2 x 104 HHSTeC para compor cada esferoide hepático de 50.000 células, em um volume de 80 μL. Ajuste os números e volumes celulares de acordo com o número desejado de esferidas. Misture com cuidado.
    6. Usando uma pipeta multicanal, dispense 80 μL da piscina celular combinada em cada poço de 384 microplatas esferoides, que tem geometria redonda bem inferior.
      NOTA: Após quatro dias, spheróides de cerca de 300 μm são formados.
    7. Usando pontas largas, transfira os esferoides hepáticos para placas de 6 poços de ultra-baixa fixação, o que permite a contagem necessária de "um por um".

2. Integração de equivalentes intestinais e hepáticos em um MPS de 2-OC

  1. Montagem de MPS de intestino 2-OC para ensaio de absorção
    1. Pipeta 500 μL de DMEM S no compartimento maior de 2-OC e 300 μL no menor. Aspire a mídia basolateral e apical de cada barreira intestinal equivalente nas 24 placas do poço. Utilizando fórceps estéreis, integre uma inserção por circuito 2-OC, especificamente no compartimento maior. Aplique 200 μL do meio intestinal no lado apical.
      NOTA: Evite a formação de bolhas ao integrar os organoides ao MPS.
    2. Conecte o MPS à unidade de controle, que deve ser conectada a uma fonte de ar pressurizada. Defina os parâmetros: uma pressão de, aproximadamente, ±300 bar e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hz. Inicie o fluxo 24 horas antes da administração da substância de teste. No dia seguinte, realize o tratamento APAP.
  2. Montagem de Fígado 2-OC MPS para ensaio de metabolismo
    1. Pipeta 650 μL de Williams E S no compartimento grande e 350 μL no compartimento menor, que receberá os esferoides. Nas placas de 6 placas de 6 poços de ultra-baixa fixação, conte os esferoides usando pontas largas. Cada fígado equivalente é composto de vinte esferoides26. Integre vinte equivalentes hepáticos por circuito, utilizando pontas largas, que permitem a transferência apenas de organoides, no compartimento menor de um 2-OC.
    2. Conecte o MPS à unidade de controle, que deve ser conectada a uma fonte de ar pressurizada. Defina os parâmetros: uma pressão de, aproximadamente, ±300 bar e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hz. Inicie o fluxo 24 horas antes da administração da substância de teste. No dia seguinte, realize o tratamento APAP.
  3. Montagem de TPM de intestino/fígado 2-OC para absorção e ensaio de metabolismo
    1. Combine as duas mídias (intestino e fígado) em uma proporção de 1:4, o que significa 200 μL de DMEM S no lado apical do intestino e 800 μL de Williams E S no lado basolateral. Integre os equivalentes intestinais e hepáticos, simultaneamente, no 2-OC.
    2. Conecte o MPS à unidade de controle, que deve ser conectada a uma fonte de ar pressurizada. Defina os parâmetros: uma pressão de, aproximadamente, ±300 bar e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hz. Inicie o fluxo 24 horas antes da administração da substância de teste. No dia seguinte, realize o tratamento APAP.
      NOTA: Para todos os experimentos, realize cada ponto de tempo em triplicado, o que significa três circuitos separados de 2-OC (ou seja, 1 e 1/2 dispositivos 2-OC). O volume total de cada circuito de 2-OC é de 1 mL.

3. Preparação de acetaminofeno (APAP)

  1. Prepare a solução de estoque apap, dissolvendo APAP em etanol absoluto. No dia do experimento, diluir o APAP no respectivo meio (solução APAP), a uma concentração de 12 μM para "administração oral" e 2 μM para "administração intravenosa".
  2. Garantir que a concentração final de etanol na solução de controle e tratamento de veículos seja de 0,5% para ambas as administrações. Para o controle positivo (100 mM APAP), a concentração de etanol é de 2%.

4. Administração de substâncias de teste e amostragem de mídia

  1. Administração "oral" da APAP e amostragem de mídia
    1. Aspire a mídia basolateral e apical de cada barreira intestinal equivalente no 2-OC. Pipeta 500 μL do meio de cultura apropriado no grande compartimento no lado organoide basolateral e 300 μL no pequeno compartimento.
    2. Verifique se há bolhas e proceda com o tratamento equivalente da barreira intestinal com a substância de teste no lado apical, emulando a administração oral. Emular a administração "oral" apap adicionando 200 μL de uma solução APAP de 12 μM no lado apical das pastilhas de cultura intestinal, que representa o "lado lúmen" intestinal(Figura 1B). Conecte o MPS à unidade de controle.
    3. Recolher o volume total dos lados apical e basolateral nos seguintes pontos de tempo: 0h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3h, 6h, 12 h e 24h15,27. Realize todos os experimentos em triplicado, em condições estáticas e dinâmicas, e colete cada amostra de cada triplicado, em um microtubo separado. Analise as amostras usando HPLC/UV.
      NOTA: Separar amostras apical e basolateral.
  2. Administração "endovenosa" da APAP e amostragem de mídia
    1. Emule a rota "intravenosa" administrando a solução APAP de 2 μM diretamente no compartimento do fígado. Aspire todo o conteúdo médio 2-OC. Pipeta 650 μL de Williams E S contendo a substância de teste no compartimento grande e 350 μL da mesma mídia no compartimento menor que contém os 20 esferoides. Recolher todos os volumes nos seguintes pontos de tempo: 0h, 30 min, 1h, 2h, 3h, 6h, 12h e 24h27,28.
    2. Realize todos os experimentos em triplicado, em condições estáticas e dinâmicas. Colete cada amostra de cada triplicado, em um microtubo separado. Analise as amostras usando HPLC/UV.

5. Instrumentação e condições cromatográficas

  1. Análise HPLC
    1. Defina todos os parâmetros relevantes para a análise do HPLC de acordo com a Tabela 1.
    2. Filtre a fase móvel através de um filtro de membrana de 0,45 μm sob vácuo. Filtre as amostras através de um filtro de seringa PVDF tamanho 0,22 μm (diâmetro 13 mm) e armazene-as em um frasco. Comece a medição.
  2. Soluções de estoque, padrões de calibração e amostras de controle de qualidade (QC)
    1. Prepare 10 mM de soluções de estoque APAP em tampão de acetato de amônio (100 mM, pH 6.8) e diluir ainda mais com a mídia de cultura celular DMEM S e Williams E S diluída com tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) para alcançar as soluções de trabalho que variam de 0,25 a 100,00 μM.
    2. Inclua um conjunto de amostras de calibração em triplicado, bem como amostras de controle de qualidade em quatro níveis em triplicado. Prepare esses padrões por diluição serial.
    3. Crie curvas de calibração das áreas de pico APAP versus concentrações padrão nominais APAP. Determine a regressão linear adequada para cada curva de calibração. Avalie a bondade de ajuste de vários modelos de calibração por inspeção visual, coeficiente de correlação, precisão intra e inter-execução e valores de precisão.
    4. Injete amostras em branco da mídia DMEM S e Williams E S diluídas em tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) em sextuplicato. Prepare triplicados de amostras de controle de qualidade em mídia DMEM S e Williams E S diluídas com tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) para as concentrações APAP de 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 e 90,00 μM.
    5. Certifique-se de que as amostras de controle de qualidade sejam preparadas a partir de uma nova solução de estoque, diferente da usada para gerar uma curva padrão. Use amostras de controle de qualidade para investigar variações intra e inter-execut.
  3. Procedimentos de validação
    1. Realizar a validação do método bioanallítico seguindo os procedimentos relatados anteriormente29,30. Realizar as corridas cromatográficas em cinco ou seis ocasiões distintas, considerando os meios de cultura celular Williams E S e DMEM, respectivamente.
    2. Certifique-se de que os pontos de calibração que variam de 0,25 a 100,00 μM de APAP, em mídia de cultura celular DMEM S ou Williams E S diluídas em tampão de acetato de amônio (1:1, v/v), são plotados com base nas áreas de pico do APAP (eixo y) contra as respectivas concentrações nominais (eixo x). Compare as inclinações dessas curvas de calibração padrão com inclinações da curva de calibração preparadas no tampão de acetato de amônio. Certifique-se de que todas as curvas de calibração tenham um valor de correlação de pelo menos 0,998.
    3. Determine a precisão e a precisão (intra e inter-run) para o analito na matriz de substitutos usando réplicas em quatro níveis diferentes de controle LLOQ, baixo, médio e de alta qualidade em cinco ou seis dias diferentes. Realize medições de precisão e precisão intra-executadas no mesmo dia em mídia de cultura celular DMEM S ou Williams E S diluída em tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) contendo concentrações APAP 0,50, 4,50, 45,00 e 90,00 μM (n= 3).
    4. Avalie cada conjunto de amostras de controle de qualidade contendo as concentrações APAP das curvas de calibração obtidas recentemente. Teste a seletividade dos ensaios pelo grau de separação do composto de interesse e possíveis outros picos cromatográficos causados por componentes interferentes.
  4. Menor limite de quantificação (LLOQ) e limite de detecção (LOD)
    1. Determine o limite inferior de quantificação (LLOQ) com base no desvio padrão da resposta e da abordagem da inclinação. Calcule usando a fórmula 10α/S, onde α é o desvio padrão do y-intercept e S é a inclinação da linha reta obtida pelo plotagem das curvas de calibração29,30. Estime o limite de detecção (LOD) levando em consideração 3,3 vezes o desvio padrão do em branco, dividido pela inclinação da curva de calibração29,30.

6. Equivalentes teciduais viabilidade/funcionalidade

  1. Mtt
    1. Realize um ensaio MTT para avaliar a viabilidade organoide em todos os pontos de tempo do ensaio mps. Como controle negativo, use mídia celular mais veículo. Como controle positivo, trate os organoides com APAP de 100 mM e 1% NaOH diluído no meio celular.
    2. Transfira os 20 esferoides de cada réplica para poços individuais em uma placa de 96 poços, e a cultura celular insere, contendo os equivalentes do intestino, para 24 placas de células bem, colocando um intestino equivalente por poço. Lave os equivalentes teciduais três vezes com 1x DPBS.
    3. Adicione 300 μL de uma solução MTT de 1 mg/mL, diluída no meio celular respectivo, por poço. Incubar as placas por 3h em condições padrão de cultura celular.
    4. Remova a solução MTT de cada poço cuidadosamente por pipetação. Extrair formazan MTT do intestino e equivalentes hepáticos usando 200 μL de isopropanol por poço durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Sele a tampa para evitar a evaporação.
    5. Transfira 200 μL de cada supernante para o respectivo poço pré-identificado em uma placa de teste de 96 poços. Use isopropanol como o branco.
    6. Leia a absorção de formazan em um leitor de placas a 570 nm. Calcule a capacidade relativa das células de reduzir mTT (%) utilizando a densidade óptica média de cada ponto de tempo, em comparação com o controle negativo, considerado como viabilidade celular 100%.
  2. Citoquímica/Histologia
    1. Fixar o intestino e os equivalentes hepáticos, por 25 min à temperatura ambiente, utilizando 4% (w/v) paraformaldeído em 0,1 M tampão de fosfato-salino, pH 7.4. Lave os organoides 5 vezes no buffer PBS por 10 minutos cada vez. Manche o intestino e os equivalentes hepáticos com tetrametilrhodamina isothiocyanato-phalloidin ou Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 em PBS31.
    2. Transfira-os para o meio de congelamento de OUTUBRO por alguns minutos para aclimatar na RT antes de transferi-los para nitrogênio líquido até o congelamento completo. Realize crioseções hepáticas criosections cerca de 10-12 μm de espessura, usando um criostat.
    3. Monte as seções teciduais em meio de montagem com DAPI. Examine-os por microscopia de fluorescência confocal.
    4. Congele os organoides após a fixação para realizar a coloração de hematoxilina e eosina de acordo com os protocolos estabelecidos. Monte os slides com meio de montagem depois de cortar o tecido como descrito acima e pegue imagens histológicas usando um microscópio óptico.
  3. Análise de alto teor de conteúdo
    1. Coloração mitocondrial e nuclear das células
      1. Reconstitua o pó liofilizado no DMSO para fazer uma solução de estoque de coloração mitocondrial de 1 mM (por exemplo, MitoTracker Deep Red FM). Armazene a solução de estoque aliquoted a -20 °C protegida contra a luz. Diluir a solução de coloração mitocondrial de 1 mM para a concentração final (200 nM) em meio de cultura tecidual pré-armado (37 °C) sem soro.
      2. Remova a mídia de cultura celular. Adicione a solução de coloração mitocondrial para cobrir completamente a amostra e incubar células por 15-45 min a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
      3. Remova cuidadosamente a solução de funcionamento da coloração mitocondrial e substitua-a por 2-4% de fixação de paraformaldeído em PBS por 15 minutos à temperatura ambiente.
      4. Enxágüe as células fixas suavemente com PBS por 5 minutos. Repita o processo de lavagem duas vezes.
      5. Prepare uma solução de estoque de coloração de ácido nucleico de 10 mg/mL (16,23 M) dissolvendo 100 mg de corante Hoechst 33342 em 10 mL de água ultrapura.
        NOTA: A solução de estoque deve ser aliquoted e armazenada protegida contra luz a -20 °C.
      6. Prepare uma solução de trabalho de coloração de ácido nucleico 0,2-2,0 μg/mL em PBS e incuba as células fixadas com solução de coloração de ácido nucleico por 10 minutos à temperatura ambiente.
      7. Remova a solução de funcionamento da coloração de ácido nucleico e enxágue as células suavemente com PBS por 5 minutos três vezes. As células devem ser mantidas em PBS a 4 °C, protegidas da luz.
    2. Análise de coloração mitocondrial e nuclear
      1. Analise as células usando um microscópio de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados para a mancha de ácido nucleico (λEx/ λEm: 361/497 nm) e a mancha mitocondrial (λEx/ λEm: 644/665 nm). Encontre células por coloração positiva de ácido nucleico e quantifique o número celular. Quantificar a intensidade da fluorescência da mancha mitocondrial nas mitocôndrias.
  4. Medições morfométricas (cálculos esferoides) em ImageJ
    1. Export High Content Analysis (HCA) imagens como arquivos *.flex do software Columbus. Importar arquivos .flex como uma escala de cinza no ImageJ usando o plugin Bio-Formats32: File > Import > Bio-Formats.
    2. Na janela Opções de importação, selecione a visualização do Hyperstack e habilite canais Split em Dividir em janelas separadas. Esta opção permitirá o acesso de todos os arquivos em um determinado canal (por exemplo, DAPI, mitotracker, etc.). Não selecione Usar pilha virtual no gerenciamento Memória.
      NOTA: É preferível usar o canal DAPI como "poeira" em imagens, pois o meio de cultura é reduzido em comprimento de onda UV (por exemplo, 405 nm).
    3. Ajuste o tamanho do pixel(Analyze > Set Scale)se ele não foi carregado de acordo com os valores incorporados no arquivo .flex. Aplique um filtro Gaussian Blur para remover o excesso de ruído e evitar irregularidades no contorno de forma. Processo > Filtros > Gaussian Blur. Um alto valor de Sigma (raio) entre 2.0 e 3.0 é ideal para a maioria dos casos. Se a pilha tiver várias imagens, aplique-se a todas elas (selecione Sim na janela Process Stack).
    4. Gere uma imagem binária para separar fundos e organoides (objetos) usando um limiar. Clique em Imagem > Ajuste > Limiar. Use a máscara vermelha para ajustar os valores de acordo com a intensidade da imagem, para se encaixar na forma organoide, mantendo a morfologia intacta. Desabilitar fundo escuro se a imagem tiver um fundo branco. Clique em Aplicar.
    5. Na janela Converter pilha para binário, escolha o método Limiar. Normalmente, Padrão ou Triângulo são preferidos neste tipo de processamento de imagem. Mantenha o fundo como escuro. Selecione Calcular limiar para cada imagem se houver várias imagens na pilha.
    6. Selecione Processo > Binário > Preencher furos. Opcionalmente, remova os orifícios do fundo. Em Process > Binary > Options, selecione fundo preto e execute Fill Holes novamente. Desabilitar a opção de fundo Black antes de prosseguir para o próximo passo.
    7. Objetos separados. Para organoides, o método da bacia hidrográfica é uma boa escolha. Clique em Process > Binary > Watershed. Execute a análise de forma.
      1. Selecione Analisar > Definir medidas. Várias opções estão disponíveis (detalhes em https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Para organoides, selecione Área, Valor cinza médio, valor cinza min & max e descritores de forma. Opcionalmente, selecione Exibir rótulo para identificar objetos na imagem e notação científica. Clique em OK.
      2. Selecione Análise > Analisar partículas. Escolha os limites de tamanho e circularidade. Mantenha 0-infinito e 0.00-1.00, respectivamente para medir todos os objetos na imagem. Em Show, escolha Contornos para que os objetos sejam identificados. Habilitar os resultados do Display para os resultados de saída; Excluir nas bordas para excluir objetos que toquem fronteiras; Inclua furos para que eventuais orifícios internos nos objetos sejam considerados como parte da forma principal.
    8. Análise de forma repetida para cada pilha de imagens e os resultados serão anexados em uma única tabela. Tabela de resultados de exportação no arquivo > Salvar Como... como arquivo Valores Separados de Vírgula (.csv).
  5. PCR em tempo real
    1. Extrair RNA de equivalentes teciduais usando uma solução monofásica de isothiocnato de fenol e guanidina, seguindo as instruções do fabricante.
    2. Realize a síntese cDNA por transcrição reversa de 1 – 2 μg de RNA total.
    3. Amplie todos os alvos usando primers específicos de genes(Tabela 5) para executar PCR quantitativo em tempo real. Cada qRT-PCR contém 30 ng de RNA transcrito reverso e 100 nM de cada primer.
    4. Siga as condições do PCR: 50 °C por 3 minutos (1 ciclo); 95 °C por 5 minutos (1 ciclo); 95 °C durante 30 segundos, 59 °C durante 45 segundos e 72 °C por 45 segundos (35 - 40 ciclos).
  6. Ensaio CYP
    1. Siga a seção 2.2 para montagem de fígado 2-OC. Os grupos experimentais são controle sem células, tratamentos APAP 2 μM para 12 h, 24 h e controle do veículo. Siga as seções 3.3 e 4.2 para preparação e tratamento APAP 2 μM.
      NOTA: Para garantir que todas as amostras estejam prontas ao mesmo tempo para o ensaio CYP, inicie o tratamento de 12h 12 horas após o início do tratamento de 24h. Trate o controle sem células da atividade CYP com solução de etanol de 0,5%, bem como o controle do veículo.
    2. Descongele a solução de estoque de substrato luminogênico de 3 mM à temperatura ambiente e faça uma diluição de 1:1000 no William's E S. Proteja da luz.
    3. Colete esferoides e transfira cada grupo experimental para um poço de placa de 96 poços. Retire o meio, lave duas vezes com 100 μL de 1x DPBS e adicione 80 μL de solução de substrato de 3 μM por poço. Mantenha o controle sem células no meio E S do William. Salve um poço sem esferoides ou solução de substrato para um controle de fundo. Incubar por 30-60 min a 37 °C com 5% de CO2,protegido da luz.
    4. Reagente de detecção de lúciferina liofilizada (LDR) utilizando o Buffer de Reconstituição com esterase. Misture girando ou invertendo. Armazene o volume apropriado à temperatura ambiente até o próximo passo.
      NOTA: O LDR reconstituído pode ser armazenado em temperatura ambiente por 24 horas ou a 4 °C durante 1 semana sem perda de atividade. Para armazenamento a longo prazo, armazene a -20 °C.
    5. Transfira 25 μL de supernanato de spheróides intactos em três poços diferentes de uma microplape branca opaca de 96 poços, após a incubação. Adicione 25 μL de LDR por poço e homogeneize.
    6. Incubar a placa branca em temperatura ambiente por 20 minutos. Leia a luminescência em um luminômetro. Não use um fluorômetro.
    7. Calcule sinais líquidos subtraindo valores de luminescência de fundo (controle sem célula) dos valores tratados por compostos de teste e não tratados (controle do veículo). Calcule a variação percentual da atividade CYP3A4 dividindo os valores líquidos tratados pelos valores líquidos não tratados e multiplicando por 100.
  7. Mancha ocidental
    1. Transfira os esferoides hepáticos para um microtubo identificado de 1,5 mL. Retire o meio e lave duas vezes com 100 μL de 1x DPBS.
    2. Lise os esferoides hepáticos em 100 μL de tampão RIPA de lise celular a 4 °C por 20 minutos. Centrífuga por 15 min, 4 °C e 11000 rpm. Transfira o supernatante para outro microtubo identificado de 1,5 mL.
    3. Quantifique a quantidade de proteína obtida através do método Bradford. Carregue entre 10 e 50 μg de proteína do lysato celular quantificado por poço de um gel de poliacrilamida gradiente 3-15% e realize um SDS-PAGE.
    4. Transfira a proteína carregada do gel para uma membrana PVDF de 0,22 μm através do equipamento do sistema semi-seco. Use uma solução de transferência de 50 mM Tris-HCl e 192 mM de glicacina. Defina os parâmetros do equipamento de acordo com o número de géis a serem transferidos (1 a 2 de cada vez).
    5. Bloqueie interações não específicas na membrana PVDF com uma solução de leite desnatado de 3-5% no buffer TBS-T: Soro fisiológico tris-tampão (50 mM Tris pH 7,6, 150 mM cloreto de sódio) complementado com 0,1% de Tween 20. Mantenha a membrana sob suavemente agitação constante por 1 hora em temperatura ambiente.
    6. Lave com TBS-T sob agitação suavemente constante por 3-5 min em temperatura ambiente. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
    7. Diluir albumina e vinculin anticorpos primários para 1:1000 e 1:2000, respectivamente, no TBS-T. Incubar a membrana com anticorpos primários durante a noite a 4 °C, sob agitação suavemente constante.
      NOTA: Siga sempre as instruções do fabricante para diluir anticorpos.
    8. Remova o anticorpo primário e lave a membrana 3 vezes (passo 6.7.6). Diluir o anticorpo secundário IgG anti-mouse da ECL para 1:5000 no TBS-T. Incubar a membrana com um anticorpo secundário sob agitação suavemente constante por 2 horas em temperatura ambiente.
    9. Remova o anticorpo secundário e lave a membrana (passo 6.7.6). Realize a detecção de proteínas usando o Substrato de Mancha Ocidental ECL. Expor os filmes autordiográficos por 30 a 30 min. Realize a detecção de imunoblotting em triplicado.

Resultados

Para realizar os testes PK APAP no MPS de 2-OC, o primeiro passo é fabricar o intestino humano e equivalentes hepáticos (organoides). Eles são integrados ao dispositivo microfluido 2-OC(Figura 1A) 24 h antes do início do ensaio PK APAP. No dia seguinte, o meio é alterado, e o modelo é exposto ao APAP. A Figura 1 ilustra os equivalentes do intestino e fígado colocados dentro do dispositivo 2-OC(Figura 1B) e do curso de tempo d...

Discussão

A avaliação precisa e confiável das propriedades farmacológicas de novas drogas investigativas é fundamental para reduzir o risco nas seguintes etapas de desenvolvimento. O MPS é uma tecnologia relativamente nova, que visa melhorar o poder preditivo e reduzir os custos e o tempo gasto com testes pré-clínicos. Nosso grupo está avançando na avaliação de propriedades farmacocinéticas e toxicológicas, principalmente necessárias para otimização de chumbo. Trabalhamos com o dispositivo microfluido 2-OC, que po...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Christie Guguen-Guillouzo, ao Dr. Philippe Gripon na Unidade 522 INSERM e ao Dr. Christian Trepo na Unidade 271 INSERM pelo uso do Material Biológico (células Hepa RG) e por disponibilizar para nós, a fim de realizar a pesquisa acadêmica.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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