Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico

Resumo

Este relatório descreve um método chip-baseado microfluídicos para estabelecer uma única experiência da cultura da pilha em que o emparelhamento de alta eficiência e a análise microscópica de pilhas únicas múltiplas podem ser conseguidos.

Resumo

Os ensaios de cocultura celular têm sido amplamente utilizados para estudar as interações célula-célula entre diferentes tipos de células para entender melhor a biologia das doenças, incluindo o câncer. No entanto, é desafiador esclarecer o complexo mecanismo de interações intercelulares em populações de células altamente heterogêneas usando sistemas de cocultura convencionais, pois a heterogeneidade da subpopulação celular é obscurecida pelos valores médios; os sistemas convencionais da cocultura podem somente ser usados para descrever o sinal da população, mas são incapazes de controlar o comportamento individual das pilhas. Além disso, os métodos experimentais convencionais de célula única têm baixa eficiência na manipulação celular por causa da distribuição de Poisson. Os dispositivos microfabricados são uma tecnologia emergente para estudos de célula única porque eles podem manipular com precisão células individuais em alta taxa de transferência e podem reduzir o consumo de amostras e reagentes. Aqui, nós descrevemos o conceito e a aplicação de uma microplaqueta microfluídicos para coculturas da único-pilha múltipla. A microplaqueta pode eficientemente capturar tipos múltiplos de únicas pilhas em uma câmara da cultura (~ 46%) e tem um espaço de cultura suficiente útil para estudar o comportamento das células (por exemplo, migração, proliferação, etc.) interação célula-célula no nível de célula única. As pilhas endothelial linfáticas e a carcinoma de pilha Squamous oral foram usadas para executar um experimento da cocultura da único-pilha na plataforma microfluídicos para estudos múltiplos vivos da interação da único-pilha.

Introdução

A captura eficiente de diferentes tipos de células individuais e o fornecimento de espaço de cultura suficiente são necessários para experimentos de cocultura de célula única de vários tipos de células individuais¹. A diluição limitante é o método mais comumente utilizado para preparar as células individuais para tais experimentos, devido ao baixo custo do equipamento necessário. No entanto, devido à limitação da distribuição de Poisson, a probabilidade máxima de aquisição de célula única é de apenas 37%, tornando a operação experimental trabalhosa e demorada². Por outro lado, usar a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) pode superar a limitação de distribuição de Poisson para preparar as células únicas³de alta eficiência. No entanto, o FACS pode não estar acessível a alguns laboratórios devido à dispendiosa instrumentação e custo de manutenção. Os dispositivos microfabricados foram desenvolvidos recentemente para a única pilha que interceptação⁴, única pilha que emparelha⁵, e únicas aplicações da cultura da pilha. Esses dispositivos são vantajosos com base em sua capacidade de manipular com precisão as células únicas⁶, realizar experimentos de alta taxa de transferência ou reduzir o consumo de amostras e reagentes. No entanto, realizar experimentos de cocultura de célula única com vários tipos de células com os atuais dispositivos microfluílicos ainda é desafiador devido à limitação da distribuição de Poisson^1,7,8ou incapacidade de os dispositivos para capturar mais de dois tipos de células individuais^4,5,6,9,10.

Por exemplo, Yoon et al. relataram um dispositivo microfluídico para o estudo de interação célula-célula¹¹. Este dispositivo usa o método probabilístico para emparelhar as células em uma câmara. No entanto, ele só pode alcançar o emparelhamento de dois tipos de células diferentes devido a restrições geométricas na estrutura do dispositivo. Outro relato de Lee et al. demonstrou um método determinístico para capturar e emparelhar células individuais¹². Este dispositivo é aumenta a eficiência de emparelhamento pelo método determinístico mas é limitado pelo tempo prolongado da operação exigido para emparelhar pilhas. Especificamente, a segunda captura de célula só pode ser realizada depois que a primeira célula capturada é anexada à superfície após 24 h. Zhao et al. relataram um dispositivo microfluídico baseado em gotas para capturar dois tipos de uma única célula¹³. Podemos encontrar que o dispositivo microfluídico baseado em gotas ainda está limitado à distribuição de Poisson e só pode ser usado em células não anexadas, e não é possível alterar a solução de cultura durante o processo de cultivo.

Anteriormente, desenvolvemos um microfluídico "chip de shuttling hidrodinâmico" que utiliza forças hidrodinâmicas determinísticas para capturar vários tipos de célula única na câmara de cultura e pode subsequentemente realizar experimento de cocultura celular para analisar comportamento de migração de células individuais em interações Cell-Cell¹⁴. O chip de shuttling hidrodinâmico compreende um conjunto de unidades vestiu que cada um contém um canal de passagem por serpentina, um local de captura e uma câmara de cultura. Usando a diferença na resistência do fluxo entre a canaleta serpentina do by-pass e a câmara da cultura, e um procedimento especialmente projetado da operação, os tipos diferentes de únicas pilhas podem repetidamente ser capturados na câmara da cultura. Notavelmente, o amplo espaço da câmara de cultura não só pode impedir que a célula seja lavada durante a captura de células, mas também fornecer espaço suficiente para as células se espalham, proliferam e migram, permitindo a observação de interações de células únicas ao vivo. Neste artigo, nós nos concentramos na produção deste dispositivo e etapas detalhadas do protocolo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. fabricação de um molde da bolacha pela litografia macia

Nota: os dados do padrão de máscara estão disponíveis em nossa publicação anterior¹⁴.

1. Desidratar uma bolacha de silício de 4 polegadas num forno a 120 ° c durante 15 min.
2. O revestimento da rotação 4 g do fotororesist negativo SU-8 2 em um wafer do silicone de 4 polegadas em 1.000 rpm para 30 s para criar uma camada grossa de 5 μm (camada #1).
3. A camada macia do Bake #1 em um fogão de 65 ° c por 1 minuto e transfere então a camada #1 a um fogão de 95 ° c por 3 minutos.
4. A camada fresca #1 à temperatura ambiente, coloc a no suporte do alinhador semiautomático da máscara, e alinhe-a com a camada #1 a máscara de cromo-chapeada (camada da captação-local).
5. Expor camada #1 com 365 nm de luz UV em uma dose de 150 mJ/cm².
6. Remova a camada #1 do alinhador e pós-assar em uma placa de 65 ° c por 1 min. camada de transferência #1 para uma placa de 95 ° c por 1 min.
7. Camada fresca #1 à temperatura ambiente. Mergulhe em uma solução de acetato de propileno glicol monometil éter para lavar afastado o fotoresistente reticulado por 2 min. seque suavemente com gás nitrogênio para revelar uma camada #1 marca de alinhamento.
8. Cubra a camada #1 marca de alinhamento por uma fita adesiva, revestimento da rotação 4 g de fotoresistista negativo SU-8 10 na camada #1 em 1.230 rpm por 30 s para criar uma camada grossa de 25 μm #2.
9. Retire a fita, Soft Bake Layer #2 em uma placa de 65 ° c por 3 min e, em seguida, transfira a camada #2 para uma placa de 95 ° c por 7 min.
10. A camada fresca #2 à temperatura ambiente, coloc a camada #2 no suporte do alinhador semiautomático da máscara, e alinhe a camada #2 a máscara de cromo-chapeada (camada do canal do desvio) à marca da camada #1 do alinhamento.
11. Expor camada #2 com 365 nm de luz UV em uma dose de 200 mJ/cm².
12. Remova a camada #2 do alinhador e pós-asse em uma placa de 65 ° c durante 1 min e transfira a camada #2 para uma placa de fogão de 95 ° c por 3 min.
13. A camada fresca #2 à temperatura ambiente, e cobre a camada #1 a marca do alinhamento pela fita adesiva. O revestimento da rotação 4 g do fotororesist negativo SU-8 2050 na camada #2 em 1.630 rpm para 30 s para criar uma camada grossa de 100 μm #3.
14. Retire a fita, Soft Bake Layer #3 em uma placa de 65 ° c por 5 min e, em seguida, transfira a camada #3 para uma placa de 95 ° c por 20 min.
15. A camada fresca #3 à temperatura ambiente, coloc a camada #3 no suporte do alinhador semiautomático da máscara, e alinhe a camada #3 a máscara cromada do Fotomáscara (camada da câmara da cultura) à marca da camada #1 do alinhamento.
16. Expor camada #3 com 365 nm de luz UV em uma dose de 240 mJ/cm².
17. Retire a camada #3 do alinhador e pós-assar em uma placa de 65 ° c para 5 min. camada de transferência #3 para uma placa de 95 ° c por 10 min.
18. Camada fresca #3 à temperatura ambiente. Mergulhe em uma solução de acetato de propileno glicol monometil éter para lavar afastado o fotoresistente reticulado por 10 min, e seque suavemente com gás nitrogênio.

2. preparação do dispositivo PDMS para captura de célula única múltipla

1. Coloque o molde da bolacha e o prato de pesagem contendo 100 μL de triclorosilano num dessecador (apenas para silanização) e aplique um vácuo (-85 kPa) durante 15 min.
   Nota: silanize a superfície da bolacha com o triclorosilano para criar propriedades hidrofóbicas da superfície antes do castingso de PDMS que pode facilmente ser descascado fora do molde do PDMS da bolacha.
2. Pare o vácuo, e então, silanize o molde da bolacha no exsicador (somente para o silanization) em 37 ° c por pelo menos 1 h.
3. Misture a base de PDMS e o agente de cura de PDMS em uma relação de 10:1. Despeje um total de 20 g de PDMS mista sobre o molde wafer em um prato de 15 cm.
4. Coloque o prato de 15 cm em um dessecador e aplique vácuo (-85 kPa) por 1,5 min. Em seguida, retire o prato de 15 cm do dessecador. Manter por 20 min à temperatura ambiente. Finalmente, remova as bolhas de ar residuais em PDMS com gás de nitrogênio.
5. Coloque o prato de 15 cm em um forno a 65 ° c por 2-4 h para curar o PDMS.
6. Retire a réplica do PDMS do molde da bolacha e, em seguida, perfure uma entrada de 1,5 mm e uma tomada de 0,5 mm no PDMS utilizando um diâmetro interno de 1,5 mm e um perfurador de diâmetro interno de 0,5 mm (Figura 1C).
7. Limpe a réplica do PDMS e a superfície do slide com fita removível e, em seguida, trate a superfície com plasma de oxigênio (100 W para 14 s).
8. Alinhe manualmente as réplicas do PDMS com o slide e coloque-as em contato entre si.
9. Coloque o slide PDMS em um forno de 65 ° c por 1 dia.
   Nota: a ligação permanente entre o diapositivo e a réplica do PDMS é conseguida para formar o dispositivo.
10. Mergulhe o dispositivo PDMS em um recipiente preenchido com tampão fosfato salina e coloque em um dessecador. Em seguida, aplique vácuo (-85 kPa) por 15 min para remover as bolhas de ar.
11. Coloc o dispositivo de PDMS em uma capa da cultura da pilha e esterilize o dispositivo com luz UV (comprimento de onda claro: 254 nanômetro) por 30 minutos.
12. Substitua o tampão do dispositivo PDMS por meio (meio basal DMEM-F12 contendo 1% de antibiótico e 10% de soro bovino fetal) e incubar o dispositivo PDMS a 4 ° c durante 1 dia. Isso impede que as células aderindo à superfície PDMS.

3. preparação de uma suspensão de uma única célula

Nota: os tipos de células incluem células endoteliais linfáticas humanas (LECs), células OSCC TW 2.6 humanas expressando shRNA WNT5B-specific (WNT5B SH4) e controle vetorial (pLKO-GFP) que foram obtidas em nosso estudo anterior¹⁵. Refira por favor nossa publicação precedente para etapas detalhadas do cultivation.

1. Remova o meio de cultura quando as células alcançarem 70-80% de confluência. Em seguida, lave suavemente as células com 5 mL de PBS estéril três vezes.
2. Adicione 1 mL de meio DMEM-F12 contendo 1 μM de corante fluorescente em células WNT5B sh4 e pLKO-GFP (use MV2 Medium para LECs) e, em seguida, incubar as células por 30 min à temperatura ambiente.
   Nota: os LECs foram manchados com corante verde do diacetato do chloromethylfluorescein (CMFDA), WNT5B sh4 as pilhas foram manchadas com o corante azul de 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) e as pilhas de pLKO-GFP foram manchadas com o corante fluorescente do Dil vermelho.
3. Lave suavemente as células com 5 mL de PBS estéril três vezes.
4. Retire o PBS e adicione 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA (0, 5% Trypsin-EDTA para LECs).
5. Incubar as células por 4 min à temperatura ambiente e, em seguida, Bata suavemente o prato de cultura do tecido para promover o destacamento de células.
6. Adicione 4 mL de meio DMEM-F12 para dispersar as células WNT5B sh4 e pLKO-GFP (para LECs use 3 mL de meio MV2 e 1 mL de solução de neutralizador de tripsina). Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mL e Centrifugue a 300 x g durante 3 min.
7. Retire o sobrenadante, e ressuscitem a pelota da pilha em 1 mL do meio DMEM-F12 delicadamente. Conte o número de células ao vivo em um hemocitometro usando o método de exclusão padrão trypan Blue¹⁶. Prepare 1 mL de suspensão celular a 3 x 10⁵ células/ml de concentração no meio DMEM-F12 e, em seguida, mantenha as células no gelo para evitar a agregação celular.
   Nota: a fim melhorar a eficiência da captação da único-pilha, a preparação cuidadosa da única suspensão da pilha com bem-Dissociated é exigida.

4. múltipla única-célula de captura e tripla single-cultura de células

1. Conecte um tubo de poli-tetrafluoroethene (PTFE) entre a tomada do dispositivo e a bomba da seringa. Retire o meio e adicione 1 μL de suspensão celular a uma concentração de 3 x 10⁵ células/ml na entrada do dispositivo PDMS.
2. Coloque a suspensão da célula no dispositivo por uma bomba de seringa a um caudal de 0,3 μL/min (Figura 2a). O sentido do fluxo é da entrada à tomada.
   Nota: carregue imediatamente após ter adicionado a suspensão da pilha na entrada para impedir o sedimentation da pilha.
3. Adicione 1 μL de meio DMEM-F12 na entrada do dispositivo PDMS após a etapa 4.2. Carregue o meio DMEM-F12 no dispositivo por uma bomba de seringa a um caudal de 0,3 μL/min (Figura 2B). O sentido do fluxo estava fluindo da entrada à tomada.
4. Carregar 0,3 μL de meio DMEM-F12 no dispositivo por uma bomba de seringa a um caudal de 10 μL/min (Figura 2C). O sentido do fluxo estava fluindo da tomada à entrada.
5. Repita as etapas 4,1 a 4,4 para carregar outros tipos de célula no dispositivo.
6. Após ter terminado a captação da pilha, use um microscópio com a lente 4x à imagem cada câmara da cultura.
   Nota: as emissões de fluorescência das células foram utilizadas para identificar e contar o número de células individuais em cada câmara de cultura.
7. Retire o tubo de PTFE e sele a entrada e a tomada com fita de poliolefina para criar um sistema de cultura fechado.
8. Mova o dispositivo PDMS para um prato de cultura de 10 cm e adicione 10 mL de PBS estéril em torno do dispositivo PDMS para evitar a evaporação do meio do dispositivo.
9. Transfira o prato de cultura para uma incubadora (37 ° C, 5% CO₂ e 95% de umidade) para a cultura de célula única tripla.
10. Microscopicamente observar e fotografar o crescimento celular a cada 12 h.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O dispositivo tem uma estrutura de três camadas, como mostrado pela fotografia de seção transversal de um dispositivo PDMS cortado (Figura 1a). A primeira camada contém um local de captura (6,0 μm de largura e 4,6 μm de altura) que conecta a câmara de cultura e o canal de passagem. A diferença na resistência de fluxo entre a câmara de cultura e o canal de passagem faz com que as células fluam para a posição de captura e preencham...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

As interações intercelular de várias pilhas no microambiente do tumor jogam um papel importante na progressão do tumor¹⁷. A fim compreender o mecanismo de interações da pilha-pilha, os sistemas da cocultura são usados como um método analítico comum. Entretanto, os tipos múltiplos da pilha e a heterogeneidade das pilhas elas mesmas conduziram à complexidade experimental e às dificuldades analíticas.

O chip de shuttling hidrodinâmico permite o carregamento m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape	3M Company	9795R
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye	Invitrogen	C2110
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium	Gibco	11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2	PromoCell	C-22022
Fetal bovine serum Hyclone	Thermo	SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )	Hamilton	80630	100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15075	with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15071	with 0.5mm inner-diameter
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
Oxygen plasma	NORDSON MARCH	AP-300
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
SU-8 10 negative photoresist	MicroChem	Y131259
SU-8 2 negative photoresist	MicroChem	Y131240
SU-8 2050 negative photoresist	MicroChem	Y111072
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution	Gibco	R-002-100