Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Resumo

A integridade da barreira hematoencefálica é fundamental para a função do sistema nervoso. Na Drosophila melanogaster, a barreira hematoencefálica é formada por células gliais durante a embriogênese tardia. Este protocolo descreve métodos para o ensaio para a formação e a manutenção da barreira do sangue-cérebro em embriões do melanogaster do D. e em larvas do terceiro instar.

Resumo

O desenvolvimento do sistema nervoso adequado inclui a formação da barreira hemato-encefálica, a barreira de difusão que regula firmemente o acesso ao sistema nervoso e protege o tecido neural de toxinas e patógenos. Os defeitos na formação desta barreira foram correlacionados com os neuropathies, e a avaria desta barreira foi observada em muitas doenças neurodegenerativas. Portanto, é fundamental identificar os genes que regulam a formação e manutenção da barreira hemato-encefálica para identificar potenciais alvos terapêuticos. A fim compreender os papéis exatos que estes genes jogam no desenvolvimento neural, é necessário ensaiar os efeitos da expressão de gene alterada na integridade da barreira do sangue-cérebro. Muitas das moléculas que funcionam no estabelecimento da barreira hemato-encefálica foram encontradas para serem conservadas em espécies eucarióticas, incluindo a mosca da fruta, a Drosophila melanogaster. As moscas da fruta provaram ser um sistema modelo excelente para examinar os mecanismos moleculars que regulam o desenvolvimento e a função do sistema nervoso. Este protocolo descreve um procedimento passo a passo para o ensaio da integridade da barreira hematoencefálica durante os estágios embrionário e larval do desenvolvimento de D. melanogaster .

Introdução

Durante o desenvolvimento, a comunicação celular e as interações são críticas para o estabelecimento da estrutura e função do tecido e do órgão. Em alguns casos, essas interações célula-célula selar fora órgãos do ambiente circundante para garantir a função adequada do órgão. Este é o caso para o sistema nervoso, que é isolado pela barreira sangue-cérebro (BBB). A disfunção do BBB em humanos tem sido associada a distúrbios neurológicos, incluindo epilepsia, e a quebra da barreira tem sido observada em doenças neurodegenerativas, incluindo esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica¹. Nos mamíferos, o BBB é formado por junções apertadas entre as células endoteliais^2,3. Outros animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, têm um BBB composto de células gliais. Estas células gliais formam uma barreira seletivamente permeável para controlar o movimento de nutrientes, produtos residuais, toxinas e grandes moléculas dentro e fora do sistema nervoso⁴. Isto permite a manutenção do gradiente eletroquímico necessário ao fogo potencial de ação, permitindo a mobilidade e coordenação⁴. Em D. melanogaster, o glia proteger o sistema nervoso do potássio-rico, sangue-como hemolinfa⁵.

No sistema nervoso central (SNC) e no sistema nervoso periférico (PNS) de D. melanogaster, duas camadas gliais exteriores, a glia subperinelares e o perinurais glia, bem como uma rede externa de matriz extracelular, a lamela neural, formam a hemolinfa-cérebro e hemolinfa-barreira nervosa⁶, referido como o BBB ao longo deste artigo. Durante o desenvolvimento subperinurais glia tornar-se poliploide e ampliar para cercar o sistema nervoso^{5,6,7,8,9,10,11} . As junções septadas do formulário do glia de subperinurais, que fornecem a barreira principal da difusão entre o hemolinfa e o sistema nervoso^5,6,12. Estas junções são molecularmente similares às junções septate-like encontradas nos paranodes de glia de nos vertebrados, e executam a mesma função que junções apertadas no BBB dos mamíferos^{13,14, 15 anos} de ^{, 16 anos} de ^{, 17}. o perinurais glia divide, cresce, e envolve em torno da glia subperinurais para regular a difusão de metabólitos e grandes moléculas^6,10,18,19. A formação de BBB é completa por 18,5 h após a colocação do ovo (AEL) em 25 ° c^5,8. Estudos prévios identificaram genes que são reguladores críticos da formação BBB^20,21,22. Para compreender melhor os papéis exatos destes genes, é importante examinar o efeito da mutação destes reguladores potenciais na integridade de BBB. Embora estudos prévios tenham delineado abordagens para a integridade do BBB em embriões e larvas, um protocolo abrangente para este ensaio ainda não foi descrito^5,7. Este protocolo passo a passo descreve métodos para ensaio a integridade BBB durante estágios larvares embrionário e terceiro instar D. melanogaster .

Protocolo

1. coleta de amostras

1. Coleção do embrião
   1. Em cada gaiola da coleção do embrião, use um mínimo de 50 fêmeas virgens com os 20 − 25 machos para coleções. Incubar estas moscas em uma garrafa com alimentos de farinha de milho-Agar (tabela de materiais) por 1 − 2 dias antes de iniciar as coletas²³.
      Nota: Mais moscas podem ser usadas, mas a relação feminino-masculino deve ser mantida em 2:1.
   2. Placas de ágar de sumo de maçã pré-quentes (tabela 1) a 25 ° c durante a noite.
      Nota: Isso é necessário para o preparo adequado de embriões. Se as placas estão secando rapidamente, adicione uma bacia com água à incubadora para aumentar a umidade da câmara.
   3. Anestesizar moscas do passo 1.1.1 com CO₂ e transferência voa para uma gaiola de coleta. Coloque uma placa de ágar de sumo de maçã pré-aquecida com uma pequena mancha de pasta de levedura na extremidade aberta e prenda-a à gaiola com a manga vermelha (tabela de materiais). A fim de limpar os embriões mais velhos, permitir que moscas para colocar os embriões/ovos em uma placa de ágar suco de maçã para 1 h a 25 ° c.
   4. Retire a gaiola de coleta da incubadora. Inverta o lado da malha da gaiola para baixo e a torneira voa para baixo à parte inferior da gaiola. Substitua o ágar suco de maçã com uma nova placa de agar suco de maçã pré-aquecido com uma pequena mancha de pasta de levedura. Descarte a primeira placa.
   5. Permitir moscas para colocar embriões/ovos na placa de ágar novo suco de maçã para 1 h a 25 ° c. Descarte esta placa após a coleta de 1 h e prossiga para o próximo passo para coletar embriões para injeção.
   6. Para recolher os embriões do estágio atrasado 17 (20 − 21 h AEL), permita moscas do genótipo desejado dos passos 1.1.1 − 1.1.5 para colocar em um novo pré-aquecido suco de maçã Agar placas com um pequeno esfregaço de pasta de levedura a 25 ° c para 1 h. placa de idade para 19 h em uma incubadora de 25 ° c , assim os embriões serão 20 − 21 h da idade na altura da imagem latente.
      Nota: Esta etapa pode ser repetida como desejado para várias rodadas de coleta de amostra, injeção e imagem.
   7. Colete embriões de placas em um filtro de células com malha de nylon de 70 μm adicionando soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) com surfactante não iônico 0,1% (PBTx; Tabela 1) para cobrir a superfície da placa e soltar os embriões da superfície usando um pincel.
   8. Embriões dechorionados coletados no filtro celular em uma solução de lixívia de 50% (tabela 1) em um prato de Petri de 100 mm por 5 min com agitação ocasional à temperatura ambiente. Enxágüe os embriões 3x girando o filtro da pilha em PBTx em uma placa de Petri, usando um prato fresco de PBTx cada vez.
   9. Se todos os embriões forem do genótipo correcto, avance directamente para o passo 1.1.10. Se a geração de embriões do genótipo correcto necessitar de uma cruz com moscas heterozzygous, selecione os embriões do genótipo correcto utilizando a presença ou ausência de cromossomas de equilibrador marcados fluorescentamente. Use um estereomicroscópio com capacidades fluorescentes para a seleção do genótipo.
      Nota: Cromossomas de balanceador marcados com proteína fluorescente amarela deformada; Kruppel-Gal4, proteína fluorescente UAS-verde (GFP); e Twist-Gal4, UAS-GFP funcionam bem para a seleção de genótipos na embriogênese tardia (tabela 2)^24,25,26.
   10. Utilizando uma pipeta de vidro, transfira embriões em PBTx para uma laje de gel de agarose a 2% (tabela 1). Remova o excesso de líquido com papel de filtro. Alinhar ~ 6 − 8 embriões na laje de gel de agarose a 2% com posterior para o lado direito e dorsal virado para cima (Figura 1B).
       Nota: O micropyle, o furo pequeno através de que os espermatozóides entram no ovo, são situados na extremidade anterior do embrião. A extremidade posterior é mais arredondada. A traquéia aparece branca e está localizada no embrião, permitindo a distinção dos lados dorsal e ventral do embrião (Figura 1B).
   11. Prepare um slide com um pedaço de fita dupla face. Pressione firmemente o slide em cima dos embriões para transferi-los para a fita dupla face.
   12. Embriões de dessecação por incubação à temperatura ambiente durante ~ 25 min (não é utilizado dessecante). Após a dessecação, cubra os embriões com óleo de halocarbono.
       Nota: Os períodos de dessecação podem variar dependendo da temperatura, umidade e ventilação na sala. O período de incubação deve ser utilizado para configurar o aparelho para injeção e o microscópio confocal para a imagem, conforme descrito nas secções 2 e 3 deste protocolo.
2. Coleção larval
   1. Configurar uma cruz com 5 − 10 moscas fêmeas virgens do genótipo desejado e metade do número de machos do genótipo pretendido num frasco para injetáveis com alimentos de farinha de milho-agar e incubar a 25 ° c²³.
   2. Após 5 − 7 dias, dependendo do genótipo, coletar larvas de terceiro instar vagando do frasco suavemente com fórceps. Enxágüe larvas em 1X PBS para remover alimentos presos às larvas. Transfira larvas para uma placa de agar de sumo de maçã para genotipagem conforme descrito na etapa 1.1.9 se necessário.
   3. Larvas do rolo em um tecido usando um pincel para secá-los fora. Transfira 6 − 8 larvas para um slide preparado com fita dupla face usando fórceps.

2. preparação de agulhas e injeção de amostra

1. Puxe as agulhas em um extrator de micropipeta antes da iniciação deste protocolo. Fixe os tubos capilares no extrator da agulha e puxe de acordo com a forma padrão da agulha e os parâmetros para injeções de D. melanogaster (tabela 3)²⁷. Armazene as agulhas em uma placa de Petri ancorando na argila até o uso para a injeção.
2. Coloque uma agulha com 5 μL de 10 kDa dextrano conjugados a sulforhodamina 101 cloreto de ácido (tabela de materiais) utilizando uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 20 μl durante o período de dessecação de 25 min para embriões (passo 1.1.12), ou imediatamente após a transferência de larvas para o slide (passo 1.2.3).
3. Coloque a agulha em um suporte de agulha e posicione-a em um micromanipulador fixado a uma base de aço (tabela de materiais).
   Nota: A agulha deve ser quase paralela ao estágio do microscópio para a injeção do embrião e angular ligeiramente para baixo para injeções larval.
4. Ajuste o aparelho de injeção (tabela de materiais) para 50 psi, 5 − 10 ms com uma faixa de 10.
   Nota: Pode ser necessário alterar essas configurações para o aparelho de injeção em particular que está sendo usado.
5. Coloque a corrediça no estágio e a borda da escova da agulha de encontro à borda da fita frente e verso em um ângulo de 45 ° para criar uma ponta angular, quebrada.
   Nota: Para os embriões só é necessário quebrar a ponta suficiente para permitir o fluxo de 10 kDa Dextran. Uma agulha perfeita tem uma ponta ligeiramente angular e somente uma gota pequena da tintura virá para fora com cada injeção. Para as larvas, é necessário quebrar a ponta mais, mas com uma ponta angular para penetrar na parede do corpo larval. Uma gota maior da tintura virá para fora.
6. Bombear o pedal do pé até que o corante esteja na ponta da agulha.
7. Alinhe a agulha para que seja paralela com o embrião ou ligeiramente inclinada para baixo em direção à larva.
8. Mova a agulha para perfurar a extremidade posterior da amostra e injete o espécime bombeando o pedal do pé. Injete ~ 2 nL de corante em embriões, e ~ 220 nL de corante em larvas.
   Nota: O embrião ou larva deve inundar com corante se a injeção for bem-sucedida.
9. Anote o tempo de injeção para fins de incubação. Incubar embriões por 10 min à temperatura ambiente. Incubar larvas por 30 min à temperatura ambiente.
10. Continue o slide para injetar espécimes adicionais, observando o tempo de injeção para cada espécime.
    Nota: Dependendo da velocidade com que as etapas subseqüentes da dissecção e da imagem latente podem ser executadas, 4 − 8 espécimes podem ser injetados em um momento.

3. preparação de amostras para imagens

1. Imagem latente dos embriões
   1. Após a injecção, prepare embriões para imagiologia. Aplique a geléia de petróleo com um aplicador com ponta de algodão nos lados direito e esquerdo das amostras na corrediça como um espaçador para impedir dano aos embriões em cima da colocação da lamínula.
   2. Amostras da imagem usando um microscópio confocal durante todo a profundidade do embrião com um objetivo 20x. Calcule a porcentagem de amostras totais com corante observado no cabo do nervo ventral (VNC) utilizando a seguinte equação:% de amostras com BBB comprometida = número de amostras com acúmulo de corante no VNC/número total de amostras ensaiadas.
2. Dissecção e imagem de larvas
   1. Prepare slides para amostras larval antes do tempo. Monte duas coberturas espaçadas aproximadamente 0,5 cm para além da corrediça com esmalte.
      Nota: Os COVERSLIP funcionam como espaçadores para o cérebro, por isso não é danificado durante o processo de montagem.
   2. Após a incubação de 30 min, dissecar as larvas em 1X PBS diretamente na corrediça que será usada na imagem latente. Primeiro, use um par de fórceps para agarrar a larva no meio do corpo larval, e usar um segundo par de fórceps para separar as metades anteriores e posteriores da larva.
   3. Em seguida, use um par de fórceps para segurar a região anterior na boca ganchos, e usar um segundo par de fórceps para inverter a parede do corpo sobre a ponta da pinça segurando os ganchos da boca. O cérebro e o VNC serão expostos.
   4. Separe o cérebro e o VNC da parede do corpo cortando os nervos, e retire a parede do corpo da corrediça (Figura 1C, D). Remova os discos imaginal, se desejar.
   5. Cubra a amostra com 10 μL de 80% de glicerol e coloque uma lamínula na parte superior da amostra para a imagem.
   6. Imagem através da profundidade do tecido do sistema nervoso usando um objetivo 20x. Calcule a percentagem de amostras totais com corante observado no VNC.

Resultados

Os métodos aqui descritos permitem a visualização da integridade do BBB em todo o SNC em embriões e larvas de D. melanogaster (Figura 1). Após a conclusão da formação BBB na embriogênese tardia, as funções BBB para excluir grandes moléculas do cérebro e VNC⁵. Este protocolo aproveita esta função para o ensaio de formação BBB. Quando o Wild-Type (Oregon R) os embriões do estágio atrasado 17 (20 − 21 h velhos) foram injetados com 10 kDa dex...

Discussão

Este protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas necessárias para o ensaio para a integridade BBB durante os estágios larvares embrionário e terceiro instar tardio do desenvolvimento de D. melanogaster . Abordagens semelhantes têm sido descritas em outro lugar para o ensaio da integridade do BBB durante o desenvolvimento, bem como em estágios adultos^5,7,29,30. No entant...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran	ThermoFisher Scientific	D1863	Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips	Eppendorf	22351656
100% Ethanol (200 proof)	Pharmco-Aaper	11000200
Active Dry Yeast	Red Star
Agar	Fisher Scientific	BP1423
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Air Compressor	DeWalt	D55140
Apple Juice	Mott's Natural Apple Juice
Bleach	Household Bleach		1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Bottle Plugs	Fisher Scientific	AS-277
Cell Strainers	BD Falcon	352350
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator	Puritan	19-062614
Double-Sided Tape 1/2"	Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip	Roboz	RS-5015
Fly Food Bottles	Fisher Scientific	AS-355
Fly Food Vials	Fisher Scientific	AS-515
Foot Pedal	Treadlite II	T-91-S
Gel Caster	Bio-Rad	1704422
Gel Tray	Bio-Rad	1704436
Glass Pipette	VWR	14673-010
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Granulated sugar			Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil	Lab Scientific, Inc.	FLY-7000
Light Source	Schott	Ace I
Manipulator Stand	World Precision Instruments	M10
Micromanipulator	World Precision Instruments	KITE-R
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Needle Holder	World Precision Instruments	MPH310
Nightsea Filter Sets	Electron Microscopy Science	SFA-LFS-CY	For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head	Electron Microscopy Science	SFA-RB	For visualization of GFP
Paintbrush	Simply Simmons	Chisel Blender #6
Pipetter	Fisher Scientific	13-683C
Pneumatic Pump	World Precision Instruments	PV830	This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Small Embryo Collection Cages	Genesee Scientific	59-100
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Steel Base Plate	World Precision Instruments	5052
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000	Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source	Baytronix		Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)	Genesee Scientific	20-258
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	Nonionic surfactant
Vial Plugs	Fisher Scientific	AS-273