Ensaio Light Spot-Based para análise de Drosophila larval Phototaxis

Resumo

Este protocolo introduz um ensaio do luz-ponto para investigar o comportamento phototática da Drosophila larval. Neste ensaio, um ponto luminoso é gerado como a estimulação clara, e o processo da vacância clara larval é gravado por um sistema Light-based infravermelho da imagem latente.

Resumo

As larvas de Drosophila melanogaster mostram um comportamento óbvio de evitar a luz durante o estágio de forrageamento. Os Phototaxis de Drosophila larval podem ser usados como um modelo para estudar o comportamento da vacância animal. Este protocolo introduz um ensaio do luz-ponto para investigar o comportamento phototática larval. A set-up experimental inclui duas partes principais: um sistema de estimulação visual que gera o ponto de luz, e um sistema de imagem à base de luz infravermelha que registra o processo de evasão de luz larval. Este ensaio permite o rastreamento do comportamento da larva antes de entrar, durante o encontro, e depois de deixar o ponto de luz. Detalhes de movimento larval incluindo desaceleração, pausa, fundição de cabeça e torneamento podem ser capturados e analisados usando este método.

Introdução

As larvas de Drosophila melanogaster mostram um comportamento óbvio de evitar a luz durante o estágio de forrageamento. Drosophila larval Phototaxis tem sido investigação, especialmente nos últimos 50 anos^{1,2,3,4,5,6,7 ,8}. Nos últimos anos, apesar do fato de que 1) muitos neurônios que mediando a vacância clara larval foram identificados^{4,5,9,10,11,12} e 2) o conectoma completo do sistema visual larval na definição das sinapses foi estabelecido¹³, os mecanismos neural que subjacente Phototaxis larval permanecem pela maior parte obscuros.

Vários ensaios comportamentais têm sido utilizados no estudo de fototaxia larval. Podem ser divididos em grande parte em duas classes: um que envolve gradientes claros espaciais e o outro que envolve inclinações claras temporais. Para ensaios espaciais de gradiente de luz, a arena é dividida em número igual de seções em claro e escuro. A arena pode ser dividida em metades claras e escuras^2,4ou quadrantes claros e escuros^{14,15, ou pode} mesmo ser separado em quadrados claros e escuros alternativos como em um tabuleiro de damas⁷. Geralmente, as placas de agar são usadas para o ensaio de gradiente de luz espacial, mas os tubos que são divididos em seções leves e escuras alternadas também podem ser usados^10,14.

Na versão mais antiga dos ensaios, a iluminação luminosa geralmente origina-se abaixo das larvas. Entretanto, a iluminação em umas versões mais novas origina pela maior parte de acima, desde que os olhos larval (por exemplo, os órgãos de bolwig que são sensíveis às intensidades claras baixas ou médias¹⁶) são contidos no esqueleto esqueleto opaco com aberturas para na frente superior. Isso faz com que as larvas mais sensíveis à luz de direções frontais superiores do que de baixo para trás direções⁷. Para ensaios de gradiente de luz temporal, a intensidade da luz é espacialmente uniforme na arena, mas a intensidade muda ao longo do tempo. Além do que a luz de onda quadrada temporal (isto é, piscando de ligar/desligar ou luz forte/fraca^{3,7), a}luz temporally de variação que se conforma a uma rampa linear na intensidade é usada igualmente⁸ para medir a sensibilidade das larvas a um estímulo de luz temporalmente em mudança.

Um terceiro tipo de ensaio Phototaxis é a navegação luz direcional Scape, que envolve a iluminação de cima em um ângulo de 45 °⁷. Antes do trabalho de Kane et al.⁷, apenas parâmetros grosseiros como o número de larvas em regiões claras e escuras, frequência de torneamento e comprimento da trilha foram calculados em ensaios de fototaxia larval. Desde o trabalho deste mesmo grupo, com a análise de registro de vídeo de alta resolução temporal para Phototaxis larval, dinâmica detalhada do movimento larval durante Phototaxis (ou seja, velocidades instantâneas de diferentes partes do corpo larval, direção de posição, ângulo de giro e velocidade angular correspondente) foram analisados⁷. Assim, mais detalhes do comportamento larval Phototaxis têm sido capazes de ser descoberto. Nestes ensaios, as larvas são testadas em grupos para que os efeitos de grupo não sejam excluídos.

Este protocolo introduz um ensaio do luz-ponto para a investigação de respostas comportáveis larval à estimulação clara individual. O principal conjunto experimental consiste em um sistema de estimulação visual e sistema de imagem à base de luz infravermelha. No sistema de estimulação visual, uma fonte de luz LED gera um ponto de luz redondo de 2 cm de diâmetro em uma placa de ágar, onde a larva é testada. A intensidade da luz pode ser ajustada usando um driver LED. O sistema de imagem inclui uma câmera infravermelha que captura o comportamento da larva, além de 3 850 nm LEDs infravermelhos que fornecem iluminação para a câmera. A lente da câmera é coberta por um filtro de banda-Pass 850 nm para bloquear a luz do sistema de estimulação visual de entrar na câmera, enquanto a luz infravermelha é permitida para entrar na câmera. Assim, a interferência da estimulação visual na imagem latente é impedida. Neste ensaio, os detalhes comportamentais das respostas rápidas de larvas individuais dentro de um período que inclui antes, durante, e após a entrada da luz são gravados e analisados.

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Protocolo

1. preparação de larvas de Drosophila

1. Prepare o meio padrão constituído por farinha de milho cozida (73 g), Agar (5,6 g), farelo de soja (10 g), levedura (17,3 g), xarope (76 mL) e água (1000 mL).
2. Levante todas as moscas a 25 ° c no meio padrão em um quarto com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.

2. preparação de placas de agar

1. Prepare 1,0% de solução de agar. Pesar 3 g de agar em um copo de 500 mL com um equilíbrio, em seguida, adicione 300 mL de água destilada. Coloc um papel da folha sobre o disjuntor para impedir que a água evoque. Aqueça o copo em um microondas para ferver.
2. Tire o copo e mexa bem com uma haste de vidro, em seguida, aqueça em um forno de microondas para ferver. Repita até que o líquido seja completamente transparente e fluido.
   Nota: a solução de agar quente final deve estar livre de bolhas de ar; caso contrário, despejar o agar na placa resultará em superfície irregular e amolgada da placa de agar, que afetará os testes de comportamento larval subsequentes. A concentração da solução de agar não deve ser demasiado alta ou baixa. Se a concentração é demasiado elevada, a reflexão difusa clara na placa do ágar será forte e manchar o limite claro/escuro. Se a concentração for muito baixa, as larvas deixarão vestígios na placa. Ambos os erros irão dificultar o processamento de vídeo mais tarde no protcol.
3. Despeje lentamente a solução de agar quente em uma placa de Petri (diâmetro 15 cm) até que o fundo é uniformemente coberto com uma camada de agar (~ 4 mm de espessura), e esfriar à temperatura ambiente (RT) até que a solução de agar é solidificada.
4. A placa do agar deve ser usada quando é preparada recentemente. Se não for, despeje uma camada de água na superfície e guarde-a no refrigerador a 4 ° c para uso posterior.

3. set-up do sistema de estimulação visual

1. Selecione a fonte de luz LED: luz azul collimada LED a 470 nm ou luz branca quente.
   Nota: a fonte de luz pode ser substituída com luz LED de qualquer outro comprimento de onda. Neste experimento, o LED de luz azul é usado como exemplo.
2. Role uma parte grossa de folha de alumínio ou de cartão preto (assegure a opacidade) para dar forma a um cilindro aberto de 12 cm do comprimento com um diâmetro similar àquele do diodo emissor de luz azul com um diâmetro de 3 cm. Deixe a extremidade superior do cilindro cobrir a extremidade dianteira do LED de luz azul. Cubra a extremidade inferior com um cartão preto com um pequeno furo redondo (0,5 cm de diâmetro) no centro. Isto constitui a fonte de luz do sistema de set-up.
3. Fixar a fonte de luz preparada para o quadro de ferro com um clipe, certificando-se a luz LED projeta para baixo em direção ao desktop. Incline ligeiramente o cilindro. O ângulo entre o plano do cilindro e o plano vertical é de cerca de 10 ° (ver Figura 1). Ligue a luz LED azul 470 nm à ficha "LED1" do controlador LED de alta potência. Ligue o driver, gire o botão no canto superior direito do driver para selecionar o canal 470 nm, em seguida, clique em LED. Em seguida, quando a tela exibe "√", um ponto de luz azul aparecerá na área de trabalho.
   Nota: se o cilindro de vazamentos de luz, além do pequeno buraco redondo, recomenda-se usar fita preta sobre as peças vazando para se certificar de que apenas o furo pode passar a luz através.
4. Clique em OK e gire o botão para ajustar a intensidade da luz. Gire o botão para uma intensidade de luz maior de 50 mA. Meça e registre o espectro da luz com um espectrómetro.
5. Mova a posição da fonte de luz para cima e para baixo para ajustar o diâmetro do ponto de luz para 2 cm. O ambiente de trabalho deve ser preto para um melhor efeito de contraste.
6. Gire o botão para escolher a intensidade da luz de acordo com as necessidades experimentais. Use um console compacto do medidor de poder com um sensor padrão do poder do fotodiodo para medir o poder claro máximo e mínimo no ponto, grava-o, mede três vezes, e toma o valor médio.
   Nota: recomenda-se usar um sensor do poder do fotodiodo para medir a intensidade de luz para a luz de um comprimento de onda específico e para usar um sensor térmico da potência para medir a intensidade de luz para a luz branca.
7. Calcule a intensidade da luz no ponto de luz dividindo a potência de luz medida pela área do sensor.
   Nota: por exemplo, se a potência de luz medida na etapa 2,6 é de 20 pW e área do sensor é 0,81 mm², a intensidade de luz é 24,69 PW/mm² (dividindo 20 PW por 0,81 mm²).

4. set-up do sistema de imagem

1. Fixe uma câmara Web de alta resolução com um clip de ferro, a cerca de 10 cm acima do ponto de luz no ambiente de trabalho (Figura 1).
2. Ajuste a orientação da lente da câmera para a área de trabalho. Ligue a câmara a um computador através de uma interface USB.
3. Coloque uma placa de agar na área de trabalho logo abaixo da câmera.
4. Abra o software "AMCAP 9.22" no computador com o Windows 7, e o ponto de luz será mostrado automaticamente na janela do AMcap. Mova a câmera ligeiramente para a esquerda ou para a direita para garantir que o ponto luminoso esteja próximo ao centro da janela. Certifique-se de que a câmera não bloqueia o caminho de luz. O ponto luminoso deve ser completo e redondo.
   Nota: o software pode ser encontrado em http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fixe um filtro passa-banda de 850 nm ± 3 Nm com um clipe a 5-7 mm logo abaixo da câmara.
   Nota: o diâmetro do filtro é de cerca de 2,5 cm, e a lente da câmera é inferior a 1 cm de diâmetro, de modo que o filtro pode cobrir o campo visual da câmera. Com o filtro abaixo da câmera, o ponto de luz não deve ser visto na janela do AMcap.
6. Coloque três LEDs geradores de luz infravermelha (comprimento de onda central = 850 nm) uniformemente em torno da placa de agar. Cada LED deve ser cerca de 5 cm de distância da borda da placa de agar, e a face da lente do LED deve estar em um ângulo de 70 ° para baixo em direção à placa de agar. Ligue os LEDs à alimentação através do conversor AC-to-DC.
   Nota: é melhor fixar as posições e ângulos dos LEDs de luz infravermelha para garantir a consistência do brilho do campo em vários ensaios experimentais e facilitar o processamento de vídeo posterior.
7. Coloque uma placa preta entre o computador e o dispositivo. Defina o brilho da tela do computador para evitar que a luz da tela do computador afete o experimento.
   Nota: Mantenha o ambiente escuro quando medir o comprimento de onda ou a intensidade da luz.

5. definindo parâmetros de imagem

1. No menu do software AMcap, escolha Options | Dispositivo de vídeo | Formato de captura, e definir o tamanho do pixel do vídeo capturado para 800 x 600 e taxa de quadros para 60 fps.
2. Remova o filtro a câmera, coloque uma régua a câmera e ajuste o foco da câmera para tornar a linha de escala clara e paralela à largura do campo de exibição de vídeo.
3. Clique em capturar | Configurar | Captura de vídeo para selecionar o caminho de salvamento, clique em Iniciar gravação, registre a distância real correspondente a 600 pixels e calcule a proporção de cada pixel para a distância real.

6. gravação video do comportamento da vacância clara

1. Manter uma temperatura de 25,5 ° c através de todos os experimentos. Controle a temperatura ambiente com um condicionador de ar, se necessário. Mantenha a umidade constantemente em 60% com um humidificador.
2. Faça um pequeno vídeo da posição do ponto de luz denominado "lightarea1". Em seguida, mova o filtro 850 nm ± 3 Nm de volta para cobrir a lente da câmera.
   Nota: ao gravar o comportamento larval, a lente da câmera é coberta pelo filtro 850 nm ± 3 Nm para que o ponto de luz não seja mostrado no vídeo. O ponto de luz pode ser reconstruído em vídeos com larvas mais tarde com o MATLAB. Não altere a posição da câmera e evite alterar a proporção de cada pixel para a distância real medida na etapa 4,3.
3. Gire sobre uma luz (isto é, uma luz do quarto) faraway do dispositivo experimental. Abaixe a luz o mais baixo possível, contanto que as larvas possam claramente ser vistas com os olhos. Retire as larvas do meio de cultura com uma colher, gentilmente escolha uma larva de terceiro instar, e lave-a limpa com água destilada. Tenha cuidado para lavar a larva um de cada vez para evitar a interferência da fome. Um único experimento requer pelo menos 20 larvas.
4. Transfira a larva para o centro da placa de agar colocada a câmera durante a etapa 3,3. Remova delicadamente o excesso de água da larva com uma escova ou use o papel blotting para remover a água da larva para impedir a reflexão da luz a lente. Desligue a luz do quarto e permita que a larva aclimatar por 2 minutos no ambiente escuro.
5. Ligue a luz LED para gerar luz infravermelha, e escovar suavemente a larva para o centro da placa. Quando a larva começa a rastejar em linha reta, gire a placa para fazer a cabeça da larva em direção ao ponto de luz. Certifique-se de que ele rastreia direto desde o início, ou então ele pode não obter acesso ao ponto de luz.
6. Clique em capturar | Configurar | Captura de vídeo para selecionar o caminho de salvamento e clique em Iniciar gravação para gravar. Permita que a larva rasteje para o ponto claro, incorpore o ponto claro, a seguir deixe o ponto claro até que esteja quase fora do campo de visão. Clique em parar gravação. Se a larva se afastar do ponto de luz antes de chegar perto, clique diretamente em parar a gravação.
7. Afaste o filtro da câmara. Faça um pequeno vídeo da posição do ponto de luz denominado "lightarea2" e compare-o com "lightarea1" para garantir que a posição do ponto de luz não seja alterada. Se uma alteração de posição óbvia for observada, descarte os dados.

7. análise de dados

1. Use SOS¹⁷ para extrair contorno do corpo animal e parâmetros de movimento de vídeos usando métodos de processamento de imagem como descrito anteriormente¹⁷.
   Nota: parâmetros incluindo headSpeed (velocidade da cabeça larval), tailSpeed (velocidade da cauda larval), midSpeed (velocidade do ponto médio larval da linha de esqueleto), e cmSpeed (velocidade do centroide larval) foram usados para medir a velocidade de movimento larval. Os parâmetros que incluem o headTheta (o ângulo entre as linhas de cabeça-ponto médio e Midpoint-Tail) e headOmega (a velocidade de mudança de headTheta) foram usados para medir a dobra larval do corpo e a velocidade angular da dobra.

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Resultados

De acordo com o protocolo, o ensaio de ponto de luz foi utilizado para investigar o comportamento de evitação de luz de larvas de terceiro instar que foram levantadas a 25 ° c em meio padrão em uma sala com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. Uma única larva de w¹¹¹⁸ foi testada usando o ensaio do ponto claro em 25,5 ° c. A intensidade luminosa média do ponto luminoso gerado por um diodo emissor de luz de 460 nanômetro era 0,59 μW/cm². Todo o processo de larval entrando e saindo d...

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Discussão

Este protocolo apresenta o ensaio de ponto de luz para testar a capacidade de larvas de Drosophila para escapar da luz. Este ensaio permite rastrear o comportamento das larvas antes de entrar, durante o encontro, e depois de deixar um ponto de luz. Detalhes do movimento larval podem ser capturados e analisados. O ensaio do ponto claro é muito simples e possui a pratiqubilidade forte. O custo de todo o dispositivo não é alto. No experimento, a luz LED é usada como fonte de luz. Ele pode ser substituído por f...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%