Fase sólida 11C-metilação, purificação e formulação para a produção de traçadores PET

Resumo

Relatamos uma técnica eficiente de radiorotulagem de carbono-11 para produzir traçadores clinicamente relevantes para tomografia por emissão de pósitrons (PET) usando cartuchos de extração de fase sólida. ¹¹ O agente c-metilante é passado através de um cartucho pré-carregado com precursor e a elução sucessiva com etanol aquoso fornece traçadores quimicamente e radioquimly puros do PET em rendimentos radioquímicos elevados.

Resumo

A produção rotineira de radiotracers utilizados na tomografia por emissão de pósitrons (PET) depende principalmente da química úmida, onde o synthon radioativo reage com um precursor não radioativo na solução. Essa abordagem exige a purificação do traçador por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), seguida de reformulação em um solvente biocompatível para administração humana. Recentemente desenvolvemos uma nova abordagem de ^{metilação C 11}para a síntese altamente eficiente de radiofármacos PET rotulados por carbono-11, aproveitando os cartuchos de fase sólida como unidades descartáveis "3-em-1" para a síntese, purificação e reformulação dos traçadores. Essa abordagem evita o uso do preparative HPLC e reduz as perdas do traçador nas linhas de transferência e devido à decaimento radioativo. Além disso, a técnica baseada em cartuchomelhor a confiabilidade da síntese, simplifica o processo de automação e facilita o cumprimento dos requisitos de Boas Práticas de Fabricação (GMP). Aqui, demonstramos esta técnica no exemplo da produção de um traçador PET Pittsburgh composto B^([11C]PiB), um padrão ouro in vivo agente de imagem para placas amilóides no cérebro humano.

Introdução

A tomografia por emissão de pósitrons (PET) é uma modalidade de imagem molecular que depende da detecção do decaimento radioativo de um isótopo ligado a uma molécula biologicamente ativa para permitir a visualização in vivo de processos bioquímicos, sinais e transformações . Carbono-11 (t_1/2 = 20.3 min) é um dos radioisótopos mais comumente usados no PET por causa de sua abundância em moléculas orgânicas e meia-vida curta que permite várias administrações traçadoras no mesmo dia para o mesmo sujeito humano ou animal e reduz a carga de radiação sobre os pacientes. Muitos traçadores rotulados com este isótopo são usados em estudos clínicos e em pesquisas básicas de saúde para imagens pet in vivo de alvos clássicos e emergentes biologicamente relevantes - [¹¹C] raclopride para receptores D_2/D3, [¹¹C] PiB para placas amilóides, [¹¹C]PBR28 para proteína translocator - para citar apenas alguns.

Os traçadores PET rotulados em carbono-11 são predominantemente produzidos através de ¹¹c-metilação de precursores não radioativos contendo -OH (álcool, fenol e ácido carboxílico), -NH (amina e amida) ou -SH (thiol) grupos. Resumidamente, o isótopo é gerado no alvo de gás de um ciclotron através de uma reação nuclear de ¹⁴N (p,α)¹¹C na forma química de [¹¹C]CO₂. Este último é então convertido em [¹¹C] iodeto metilo^([11C]CH₃I) através de química molhada (redução para [¹¹C]CH₃OH com LiAlH₄ seguido por saciar com HI)¹ ou seco química (redução catalítica para [¹¹C]CH₄ seguido de iodenação radical com molecular I₂)². [¹¹C] CH₃Eu posso então ser convertido para o triflate mais reativo ¹¹C-metil ([11 C]CH₃OTf), passando-o sobre uma coluna triflate prata³. O ¹¹C-metilação é então realizada por qualquer borbulhante do gás radioativo em uma solução de precursor não-radioativo em solvente orgânico ou através do mais elegante solvente em cativeiro "loop" método^4,5. O ¹¹C-tracer é então purificado por meio de HPLC, reformulado em um solvente biocompatível, e passou por um filtro estéril antes de ser administrado a seres humanos. Todas essas manipulações devem ser rápidas e confiáveis, dada a curta meia-vida do carbono-11. No entanto, o uso de um sistema HPLC aumenta significativamente as perdas do traçador e do tempo de produção, muitas vezes necessita do uso de solventes tóxicos, complica a automação e, ocasionalmente, leva a sínteses falhadas. Além disso, a limpeza necessária dos reatores e da coluna HPLC prolonga os atrasos entre as sínteses dos lotes traçadores subsequentes e aumenta a exposição do pessoal à radiação.

A radioquímica da flúor-18 (t_1/2 = 109,7 min), o outro isótopo PET amplamente utilizado, foi recentemente avançada através do desenvolvimento de kits à base de que evitam a necessidade de purificação de HPLC. Ao empregar cartuchos de extração de fase sólida (SPE), esses kits totalmente descartáveis permitem a produção de rotina confiável de ¹⁸traçadores F, incluindo [¹⁸F]FDG, [¹⁸F]FMISO, [¹⁸F]FMC e outros, com síntese mais curta tempos, redução do envolvimento pessoal e manutenção mínima do equipamento. Uma das razões pelas quais o carbono-11 continua a ser um isótopo menos popular na imagem pet é a falta de kits semelhantes para a produção de rotina de ¹¹c-traçadores. Seu desenvolvimento melhoraria significativamente a confiabilidade sintética, aumentaria os rendimentos radioquímicos e simplificaria a automação e a manutenção preventiva dos módulos de produção.

Kits de produção atualmente disponíveis aproveitam os cartuchos de SPE baratos, descartáveis, em vez de colunas HPLC para a separação do radiotracer de isótopos radioativos não reajados, precursores e outros subprodutos radioativos e não radioativos. Idealmente, a reação de rotulagem de rádio também prossegue no mesmo cartucho; por exemplo, a fluorometilação^dedimetiloetanol com gasoso [¹⁸F]CH₂BrF na produção de rastreamento pet de imagem de câncer de próstata [¹⁸F]fluorometilcolina ocorre em um cartucho de resina de troca de cation ^6.Embora procedimentos semelhantes para a rotulagem de vários ¹¹C-traçadores em cartuchos tenham sido relatados^7,8 e se tornaram especialmente poderosos para a radiossíntese de [¹¹C]colina⁹ e [¹¹C]methionine¹⁰, estes exemplos permanecem limitados aos traçadores oncológicos do PET onde a separação do precursor não é exigida frequentemente. Recentemente, relatou o desenvolvimento de^"[11C] kits" para a produção de [¹¹C]CH₃I¹¹ e subseqüente ¹¹C-metilação, bem como a síntese contínua fase suportada¹² em nossos esforços para simplificar a produção de rotina de ¹¹C-traçadores. Aqui, queremos demonstrar o nosso progresso usando o exemplo da radiossíntese suportada em fase sólida de [¹¹C]PiB, um radiotracer para imagens de Aβ que revolucionou o campo da imagem da doença de Alzheimer (DA) quando foi desenvolvido pela primeira vez em 2003 ( Figura 1) ^13,14. Neste método, volátil [¹¹C]CH₃OTf (bp 100 °C) é passado sobre 6-OH-BTA-0 precursor depositado na resina de um cartucho descartável. Pet tracer [¹¹C]PiB é então separado das impurezas precursoras e radioativas por elução do cartucho com etanol aquoso biocompatível. Além disso, automatizamos este método de radiossíntese [¹¹C]PiB usando um módulo de síntese de radioquímica operado remotamente e kits de descartáveis. Especificamente, implementamos essa radiosíntese em um módulo de radioquímica de 20 válvulas, equipado com acionamento de seringas (dispensador) que se encaixa seringa plástica descartável padrão de 20 mL, controlador de fluxo de gás, bomba de vácuo e medidor. Devido à simplicidade deste método, estamos confiantes de que ele pode ser modificado para a maioria dos sintetizadores automatizados disponíveis comercialmente, seja à base de ou aqueles equipados com válvulas estacionárias. Esta técnica suportada por fase sólida facilita a conformidade com a produção de¹¹C]PiB com os regulamentos da Good Manufacturing Practice (GMP) e melhora a confiabilidade da síntese. A técnica descrita aqui também reduz a quantidade de precursor necessária para a radiossíntese, usa apenas solventes biocompatíveis "verdes" e diminui o tempo entre lotes consecutivos de produção.

Protocolo

1. Preparação de amortecedores e eluentes

1. Dissolva 2,72 g de trato de acetato de sódio em 100 mL de água para preparar a solução de acetato de sódio de 0,2 M (solução A).
2. Dissolva 11,4 mL de ácido acético glacial em 1 L de água para preparar solução de ácido acético de 0,2 M (solução B).
3. Combine 50 mL de solução A com 450 mL de solução B para preparar o tampão de acetato em pH 3.7 (buffer 1) de acordo com o centro de referência tampão¹⁵. Verifique o pH do buffer com tiras de pH ou um medidor de pH.
4. Combine 12,5 mL de etanol absoluto com 87,5 mL de buffer 1 para fazer 12,5% solução EtOH aquosa (lavagem 1) em uma garrafa de 100 mL.
5. Combine 15 mL de etanol absoluto com 85 mL de buffer 1 para fazer 15% de solução EtOH aquosa (lavagem 2) em uma garrafa de 100 mL.
6. Combine 5 mL de etanol absoluto com 5 mL de buffer 1 para fazer 50% de solução EtOH aquosa (eluente final) e desenhe 2,5 mL desta solução em uma seringa de 10 mL.

2. Aplicação do precursor do cartucho

1. Passe 10 mL de água seguido por 5 mL de acetona através do cartucho tC18 para pré-condicionar isso.
2. Seque o cartucho com um fluxo de nitrogênio a 50 mL/min por 1 min.
3. Dissolva 2 mg do precursor 6-OH-BTA-0 em 1 mL de acetona de anidro.
4. Segurando uma seringa de vidro de precisão Luer-ponta 250 μL para baixo, retire 100 μL da solução precursora e 50 μL de almofada de ar em cima do líquido. Retire a agulha e aplique a solução precursora no cartucho tC18 do final feminino, empurrando lentamente o desentupidor todo o caminho. Não empurre a solução mais!

3. Configurando o múltipla para síntese automatizada

1. Proteja o material descartável padrão de 5 porções no módulo de síntese e monte-o de acordo com a Figura 2 e os passos 3.2 - 3.5 abaixo.
   NOTA: Recomendamos o uso de múltiplas resistentes à acetona (ver Tabela de Materiais).
2. Porto 1 tem duas posições. Conecte a entrada horizontal ao dispensador automatizado equipado com uma seringa de 20 mL. Conecte a entrada vertical à garrafa com a lavagem 1.
3. Conecte a saída do módulo que produz [¹¹C]CH₃OTf ao porto 2 do reprodutor.
4. Instale o cartucho tC18 carregado com precursor 6-OH-BTA-0 entre as portas 3 e 4.
5. O Porto 5 tem duas posições. Conecte a tomada horizontal à garrafa de resíduos que deve conter pelo menos 200 mL. Conecte a tomada vertical ao frasco estéril para a coleção do traçador através do filtro estéril.

4. Radiossíntese de [¹¹C]PiB

CUIDADO: Todas as manipulações envolvendo isótopos radioativos devem ser realizadas em uma célula quente protegida por chumbo por pessoal com treinamento adequado para trabalhar com materiais radioativos.
NOTA: Este protocolo não abrange os detalhes da produção de [¹¹C]CO₂ no ciclotron e sua conversão em [¹¹C]CH₃OTf usando o módulo de radioquímica. Esses procedimentos dependerão do equipamento individual do laboratório de radioquímica e estão fora do escopo desse protocolo. Nosso centro PET está equipado com um ciclotron IBA, que produz carbono-11 na forma química de [¹¹C]CO₂através da reação nuclear ¹⁴N (p,α)¹¹C com uma mistura de gás N_2/O2 (99,5:0.5) no gás alvo, e um módulo comercialmente disponível para a produção de [¹¹C]CH₃I através do "método seco" (redução catalítica para [¹¹C]CH₄ seguido por iodenação radical). [¹¹C] CH₃OTf é produzido passando [¹¹C]CH₃I sobre uma coluna triflate prata aquecida a 175 °C em 20 mL/min.

1. Entregar [¹¹C]CH₃OTf no coletor através do porto 2 e passá-lo através do cartucho tC18 carregado em 20 mL/ min fluxo de saída regulada pelo [¹¹C]CH₃OTf módulo, através das portas 3 e 4 e para o frasco de resíduos, como mostrado em Figura 2A.
2. Uma vez que toda a radioatividade foi transferida e presa no cartucho tC18, conforme monitorado pelo detector de radioatividade atrás do suporte do cartucho, pare o fluxo de gás fechando o porto 2. Deixe o cartucho sentar-se por 2 min para completar a reação.
3. Retire 19 mL de lavagem 1 solução (ver passo 1.4) da garrafa de 100 mL na seringa distribuidor através do porto 1 a 100 mL/min, como mostrado na Figura 2B.
4. Dispensar 18,5 mL de lavagem 1 solução do dispensador através do cartucho tC18 através dos portos 3 e 4 e para a garrafa de resíduos em 50 mL/min, como mostrado na Figura 2C. Assegure a ausência de bolhas de ar no ressoqueiro, pois eles podem diminuir a eficiência da separação.
5. Repita os passos 4,3 e 4,4 quatro vezes, retirando e dispensando 18,5 mL de lavagem 1 solução de cada vez. O volume total de solução de lavagem 1 passado pelo tC18 é de 92,5 mL; no entanto, pode variar dentro da faixa de 90 a 100 mL, dependendo do módulo de síntese específico usado.
6. Mude a linha de entrada na porta 1 da lavagem 1 para lavar a solução 2 (ver passo 1.5).
7. Repita os passos 4,3 e 4,4 três vezes, retirando e dispensando 18,5 mL de lavagem 2 solução de cada vez. O volume total de solução de lavagem 2 passado pelo tC18 é de 55,5 mL. No entanto, pode variar dentro da faixa de 50 a 60 mL, dependendo do módulo de síntese específico usado.
8. Válvula de alternância 5 para o frasco final, como mostrado na Figura 2D. Desconecte a linha do dispensador e conecte-a à seringa de 10 mL contendo 2,5 mL da solução eluent final (50% aquosa EtOH, ver passo 1.6) e 7,5 mL de ar.
9. Segurando a seringa para baixo, empurre manualmente a solução eluente final (2,5 mL), seguida de ar (7,5 mL) através do cartucho tC18 através das portas 3 e 4 e para o frasco estéril para coleta de rastreadores através do filtro estéril, como mostrado na Figura 2D.
10. Desligue a seringa vazia, conecte a seringa de 10 mL contendo 10 mL do tampão de fosfato estéril (receita não incluída, pois pode variar) e empurre todo o volume através do cartucho tC18 no frasco estéril, conforme descrito acima (Figura 2D ). Desligue a seringa e lave a linha com 10 mL de ar usando a mesma seringa.
11. Retire 0,7 mL da formulação final do traçador e colete amostras para procedimentos de controle de qualidade (0,1 mL), teste de endotoxina bacteriana (0,1 mL) e esterilidade (0,5 mL).

5. Procedimentos de controle de qualidade

CUIDADO: Cada lote do radiotracer deve ser submetido aos procedimentos apropriados do controle de qualidade (QC) antes da liberação ao local da imagem latente do PET para a administração em assuntos humanos ou animais. Os autores deste manuscrito não são responsáveis pela conformidade do radiotracer produzido em outros centros com os regulamentos das autoridades de saúde locais.

1. Realizar procedimentos qc pré-lançamento, que devem incluir testes para identidade radioquímica (RCI), pureza radioquímica (RCP), pureza química e atividade molar do traçador, bem como conteúdo solvente residual e pH da formulação.
2. Determine o RCI, RCP, pureza química e atividade molar por meio do sistema hplc analítico equipado com UV (monitoramento de 350 nm) e detectores de radioatividade, e uma coluna de fase invertida. Determine os tempos de retenção de 6-OH-BTA-0 e 6-OH-BTA-1 e calibrar o instrumento para quantificar o conteúdo de cada composto.
3. Determine o conteúdo solvente residual por meio do sistema de cromatografia analítica de gás equipado com uma coluna capilar. Determinar os tempos de retenção de acetona e etanol e calibrar o instrumento para quantificar o conteúdo de cada solvente.
4. Realize o teste bacteriano das endotoxinas usando um leitor do cartucho equipado com os cartuchos apropriados.
5. Realize a análise esterilidade da amostra pelo menos 14 dias após a síntese para garantir a ausência de crescimento bacteriano ou enviar a amostra de esterilidade para um laboratório credenciado pela autoridade de saúde local.

Resultados

Para resumir uma radiossíntese típica de [¹¹C]PiB, gasoso [¹¹C]CH₃OTf é passado pela primeira vez através de um cartucho tC18 pré-carregado com uma solução de precursor (Figura 1). A separação da mistura de reação é então alcançada por sucessivas eluções com soluções de etanol aquoso da seguinte forma. Primeiro, 12,5% EtOH elutes a maioria dos não reagidos [¹¹C]CH₃OTf e 6-OH-BTA-0, em s...

Discussão

Apesar do recente surgimento e aprovação da FDA de vários 18 traçadores PET rotulados por ^F,como florbetapir, florbetaben e flutemetamol, [¹¹C]PiB continua a ser um traçador padrão ouro para imagens amilóides devido à rápida captação cerebral e baixa não específica Ligação. Atualmente, este traçador é sintetizado através de química molhada¹⁶ ou usando um "loop seco" abordagem^4,17. Ambos os ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	Analytical HPLC system
Ethanol absolute	Commercial alcohols	432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system	Perkin Elmer	Clarus 480	Gas chromotograph
polycarbonate manifold	Scintomics	ACC-101	Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm)	Restek	70625-273	Analytical GC column
Scintomics GRP module	Scintomics	Scintomics GRP	Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold	Scintomics	ACC-201	Synthesis manifold
Spinal needle	BD	405181
Sterile extension line	B. Braun	8255059
Sterile filter	Millipore	SLLG013SL
Sterile vial (20mL)	Huayi	SVV-20A
Sterile water	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL)	BD	309604
Syringe (1mL)	BD	309659
Syringe (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dispenser syringe
Vent filter	Millipore	TEFG02525