Aplicação da tensão na análise dinâmica do tamanho da partícula de dispersão de luz

Resumo

Aqui, um protocolo para aplicar tensão à solução durante medidas dinâmicas de tamanho de partículas de dispersão de luz com a intenção de explorar o efeito das alterações de tensão e temperatura na agregação do polímero é apresentado.

Resumo

A dispersão dinâmica de luz (DLS) é um método comum para caracterizar a distribuição de tamanho de polímeros, proteínas e outras nano-e micropartículas. A instrumentação moderna permite a medição do tamanho das partículas em função do tempo e/ou temperatura, mas atualmente não há um método simples para a realização de medições de distribuição de tamanho de partículas DLS na presença de tensão aplicada. A capacidade de realizar tais medidas seria útil no desenvolvimento de polímeros eletroativos e responsivos a estímulos para aplicações como sensoriamento, robótica macia e armazenamento de energia. Aqui, uma técnica utilizando tensão aplicada aliada ao DLS e uma rampa de temperatura para observar alterações na agregação e tamanho da partícula em polímeros termoresponsivos com e sem monômeros eletroativos é apresentada. As mudanças no comportamento de agregação observadas nesses experimentos só foram possíveis através da aplicação combinada de controle de tensão e temperatura. Para obter esses resultados, um potenciostat foi conectado a um cuvette modificado, a fim de aplicar tensão a uma solução. Alterações no tamanho da partícula de polímero foram monitoradas utilizando DLS na presença de tensão constante. Simultaneamente, foram produzidos dados atuais, que poderiam ser comparados com dados de tamanho de partículas, para entender a relação entre o comportamento atual e das partículas. O polímero poly(N-isopropylacrilamida) (pNIPAM) serviu como polímero de teste para esta técnica, já que a resposta do pNIPAM à temperatura é bem estudada. Alterações no comportamento de agregação de solução de menor crítica (LCST) de pNIPAM e poli(N-isopropylacrylamide)-bloco-poli (metocrilato ferrocenylme), um conpolímero de bloco eletroquimicamente ativo, na presença de tensão aplicada são observadas. Entender os mecanismos por trás dessas mudanças será importante ao tentar alcançar estruturas de polímeros reversíveis na presença de tensão aplicada.

Introdução

A dispersão dinâmica de luz (DLS) é uma técnica para determinar o tamanho das partículas através do uso de alterações aleatórias na intensidade da luz espalhadas pela solução¹. O DLS é capaz de medir a agregação de polímeros determinando o tamanho das partículas. Para este experimento, o DLS foi associado a mudanças de temperatura controladas para observar quando um polímero agregado, o que indica superar a temperatura de solução crítica mais baixa (LCST)^2,3. Abaixo do LCST, existe uma fase líquida homogênea; acima do LCST, o polímero torna-se menos solúvel, agregados e condensa-se fora da solução. Uma tensão aplicada (ou seja, potencial aplicado ou campo elétrico) foi introduzida em todo o campo de dispersão para observar os efeitos do campo elétrico no comportamento de agregação e LCST. A aplicação de tensão em medições de dimensionamento de partículas permite novas percepções sobre o comportamento de partículas e aplicações subsequentes nos campos de sensores, armazenamento de energia, sistemas de entrega de medicamentos, robótica macia e outros.

Neste protocolo, foram utilizados dois exemplos de polímeros. Poly (N-isopropilacrilamida), ou pNIPAM, é um polímero sensível térmico, que contém um grupo de amida hidrofílica e um grupo isopropílico hidrofóbico na cadeia macromolecular^4,5. Materiais de polímero de resposta térmica como pNIPAM têm sido amplamente utilizados na liberação controlada de medicamentos, separação bioquímica e sensores químicos nos últimos anos^3,4. O valor da literatura LCST do pNIPAM gira em torno de 30-35 °C⁴. pNIPAM normalmente não é eletroquimicamente ativo. Portanto, como uma segunda amostra de polímero um bloco eletroquimicamente ativo foi adicionado ao polímero. Especificamente, o metocrilado de ferrocenylmefoi foi usado para criar umpoli(N-isopropylacrilamida)-bloco-poliscenylme methacrilate, ou p(NIPAM-b-FMMA)^6,7. Ambos os exemplos os polímeros foram sintetizados pela polimerização de fragmentação reversível de fragmentação com comprimento de cadeia controlada^8,9,10. O polímero não eletroquimicamente ativo, pNIPAM, foi sintetizado como 100 mer puro pNIPAM. O polímero eletroquimicamente ativo, p (NIPAM-b-FMMA), também tinha 100 mers comprimento sacada, que contém 4% de metocrilato de ferrocentileme (FMMA) e 96% NIPAM.

Neste artigo, é demonstrado um protocolo e metodologia para estudar o efeito da tensão aplicada na agregação de polímeros. Este método também poderia ser estendido a outras aplicações de LLS, como a análise do dobrável/desdobramento de proteínas, interações proteica-proteína e aglomeração de partículas eletrostáticas carregadas para citar algumas. A amostra foi aquecida de 20 °C a 40 °C para identificar o LCST na ausência e presença de um campo aplicado de 1 V. Em seguida, a amostra foi ressada de 40 °C a 20 °C sem interromper o campo aplicado para estudar quaisquer efeitos histeréticos ou de equilíbrio.

Protocolo

1. Exemplo preparações de polímero

1. síntese de polímero pNIPAM
   NOTA: Esta preparação produz 10 mL de solução 1 g/L, o que é suficiente para experimentos 3-4.
   1. Prepare o aparelho de linha Schlenk. Certifique-se de que o frasco de deguerra de guerra está cheio de um chorume de gelo seco e acetona, ou se uma armadilha mecânica de refrigeração for usada, certifique-se de que a armadilha tenha atingido uma temperatura apropriada.
   2. Em um frasco de fundo redondo de 50 mL, adicione 0,566 g de n-isopropylacrylamide (NIPAM), 0,016 g de agente de polimerização da cadeia de fragmentação reversível (RAFT) agente (phthalimidotil butyl trithiocarbonato), 0,0008 g de 2,2-azobis (2-metilpropionitrile) (AIBN) e 10 mL de 1,4-dioxano. Coloque uma barra de rebuliço no frasco. Selar o frasco com um septo de borracha, embrulhar com fita de vinil e dissolver os monômeros em 1,4 dioxano.
   3. Realizar desgassagem de bomba congelante da seguinte forma: Congele a solução imersando o frasco de fundo redondo em um frasco de Dewar contendo um chorume de gelo seco e metanol. Uma vez que todo o material esteja congelado, use a coletora a vácuo da linha Schlenk para evacuar o frasco para uma pressão interna abaixo de 100 kPa. Isole o frasco e descongele vácuo estático, usando água morna. Volte o frasco à pressão atmosférica usando a coletora de nitrogênio da linha Schlenk.
   4. Repita o passo 1.1.3 três vezes para minimizar a concentração interna de oxigênio.
   5. Esparsar a solução com nitrogênio para equilibrar a pressão para a atmosfera. Aqueça a mistura a 85 °C usando um banho de óleo e mexa a 200 rpm por 36 h.
   6. A um béquer de 50 mL, adicione 40 mL de hexano. Em seguida, adicione a mistura de polímero ao hexano dropwise. O pNIPAM deve precipitar-se como floccule branco.
      NOTA: O monomer NIPAM é solúvel em hexano, mas pNIPAM tem uma solubilidade ruim no hexano.
   7. Despeje a mistura nublada em um funil Büchner para coletar o pó branco pNIPAM. Transfira o pó para um frasco de 20 mL e coloque-o em um forno a vácuo durante a noite para remover sobras de solvente. Guarde em um recipiente selado à temperatura ambiente até que seja necessário.
2. pNIPAM-bloco-poli (ferrocenylmememe) sintetização de copolímero de bloco (p(NIPAM-b-FMMA))
   NOTA: Esta preparação produz 10 mL de solução 1 g/L, o que é suficiente para experimentos 3-4.
   1. Prepare o aparelho de linha Schlenk. Certifique-se de que o frasco de deguerra de guerra está cheio de um chorume de gelo seco e acetona, ou se uma armadilha mecânica de refrigeração for usada, certifique-se de que a armadilha tenha atingido uma temperatura apropriada.
   2. Em um frasco de 50 mL de fundo redondo, adicione 0,057g de metocrilato de ferrocentileme (FMMA), 0,016 g de agente RAFT, 0,0008 g de AIBN e 10 mL de 1,4-dioxano. Coloque uma barra de rebuliço no frasco. Selar o frasco com um septo de borracha, embrulhar com fita de vinil e dissolver os monômeros em 1,4 dioxano.
   3. Realizar desgassagem de bomba congelante da seguinte forma: Congele a solução imersando o frasco de fundo redondo em um frasco de Dewar contendo um chorume de gelo seco e metanol. Uma vez que todo o material esteja congelado, use a coletora a vácuo da linha Schlenk para evacuar o frasco para uma pressão interna abaixo de 100 kPa. Isole o frasco e descongele vácuo estático, usando água morna. Volte o frasco à pressão atmosférica usando a coletora de nitrogênio da linha Schlenk.
   4. Repita o passo 1.2.3 três vezes para minimizar a concentração interna de oxigênio.
   5. Esparsar a solução com nitrogênio para equilibrar a pressão para a atmosfera. Aqueça a mistura a 85 °C usando um banho de óleo e mexa por 10 h.
   6. Dissolva 0,543 g de NIPAM e 0,0002 g de AIBN em 3 mL de 1.4 dioxano. Adicione a solução no frasco nitrogênio e esparte por 30 min. Aqueça a mistura a 85 °C usando um banho de óleo e mexa a 200 rpm por mais 36 h.
   7. Adicione 40 mL de hexano a um béquer de 50 mL. Em seguida, adicione a mistura de polímero ao hexano dropwise. O p (NIPAM-b-FMMA) deve precipitar como pó marrom porque o monomer FMMA tem uma cor amarela escura.
      NOTA: Os monômeros NIPAM e FMMA são solúveis em hexano, mas p(NIPAM-b -FMMA) tem má solubilidade no hexano.
   8. Despeje a mistura amarela nublada em um funil Büchner para coletar o pó marrom p(NIPAM-b -FMMA). Transfira o pó para um frasco de 20 mL e coloque-o no forno a vácuo durante a noite para remover sobras de solvente. Guarde em um recipiente selado à temperatura ambiente até que seja necessário.

2. Amostra dLS e preparação de cuvette

NOTA: Esta seção prepara o cuvette para tensão aplicada e a amostra para medições DeDS.

1. Meça 10 mg de pó de polímero e dissolva-se em 10 mL de água desionizada filtrada (DI). Coloque a mistura em uma geladeira durante a noite. Quando estiver pronto para iniciar o experimento, mantenha a amostra no gelo.
   NOTA: A concentração de polímeros utilizadas nesses experimentos foi de 1 g/L, mas a gama ideal de concentrações para cada amostra será única. Além disso, a melhor prática é manter o polímero abaixo do LCST até que esteja pronto para testes.
2. Corte duas peças de 6,3 mm x 7 cm de fita de cobre unilaterais(Figura 1). Use pinças para enfiar cada peça em lados opostos do interior da amostra DLS cuvette, perpendicular ao caminho da luz. A parte inferior da fita deve chegar perto da parte inferior do cuvette. Dobre as bordas da fita de cobre sobre o topo do cuvette. Certifique-se de que a fita de cobre está próxima/embrulhada na parte superior da amostra cuvette para garantir um bom contato elétrico. Certifique-se também de que a fita de cobre não se conecte com os contatos metálicos associados ao equipamento DLS usado para medidas potenciais Zeta.
3. Lave o cuvette com água DI três vezes, depois despeje o excesso de água com um Kimwipe.

3. Controles de instrumentos DLS e configuração

NOTA: Três controles são recomendados para serem concluídos antes de executar cada experimento DLS: (1) solução de água em branco; (2) um padrão de tamanho; (3) medição do polímero antes do início de uma rampa de temperatura ou tensão aplicada. Consulte o manual do instrumento antes de operar para orientar sobre a preparação de uma amostra, escolher configurações e avaliar a qualidade da amostra e dos dados.

1. Transfira 1,5 mL de solvente filtrado para o cuvette. Use água DI.
2. Insira o cuvette no suporte cuvette, garantindo que a pequena seta na parte superior do cuvette esteja alinhada com o suporte cuvette. Feche a tampa.
3. Dentro do software Zetasizer, selecione Medir na barra de ferramentas. Foram criadas medições manuais para os controles. Coloque a temperatura no ponto de partida experimental. Selecione 20 °C para este experimento.
4. Uma vez que o texto na parte inferior da janela diz, insira a célula e pressione quando estiver pronto,aperte o botão de partida do triângulo verde na parte superior da tela. Isso inicia o experimento, e o titular do cuvette não deve ser aberto depois disso.
5. Clique na guia Multi-view para observar os resultados em tempo real. Monitore continuamente a qualidade da amostra e dos dados observando a taxa de contagem e a função de correlação. Como esta amostra é apenas solvente, nenhum sinal claro correspondente à presença de partículas deve ser observado.
6. Adicione duas gotas de uma solução padrão ao cuvette ou apenas use o controle de água e repita as etapas 3.2-3.6. Use um padrão de tamanho de poliestireno rastreável de 20 nm NIST para este experimento.
   NOTA: Se o controle de água ou solução padrão for executado mostrar dados inconsistentes com os resultados esperados, solucionar o erro e repetir até que os controles leiam como esperado.
7. Enxágue o cuvette e adicione a solução filtrada de polímero/teste. Repita os passos 3.2-3.5. Deve ser observada uma medição clara da solução inicial de teste. Recomenda-se fazer isso antes de qualquer rampa de temperatura ou tensão aplicada para uma medição de linha de base.

4. DLS SOP configurado

NOTA: Esta seção refere-se especificamente à operação de rampa de temperatura de um instrumento Malvern Zetasizer NanoZS DLS. Antes de iniciar os experimentos, recomenda-se consultar extensivamente o manual do instrumento para orientação sobre a seleção de uma célula, preparar uma amostra, escolher configurações de medição e avaliar a qualidade da amostra e dos dados.

1. Dentro do software Zetasizer (versão 7.11), escolha Arquivo, em seguida clique em Novo para configurar um novo SOP (Figura 2).
2. Clique no tipo medição para selecionar Trend > Temperatura > Tamanho.
3. No Material,escolha o material adequado e o índice refrativo. Escolha protein e o índice refrativo (RI) de 1.450 para este experimento. Se os valores exatos para o índice refrativo forem desejados para um cálculo mais preciso da distribuição de volume, o experimentador deve determinar o índice refrativo de sua amostra experimentalmente.
4. Em Dispersante,escolha o solvente apropriado. Escolha água como solvente neste experimento.
5. Em Cell,escolha o cuvette sendo usado. Use cuvettes descartáveis (DTS0012) para este experimento.
6. Em Sequência,coloque temperatura de partida e temperatura de fim. Para experimentos de aquecimento, coloque a temperatura iniciar em 20 °C e definir a temperatura final como 40 °C. Para experimentos de resfriamento, escolha o oposto. Desverifique o retorno à caixa de temperatura inicial.
7. Selecione um intervalo para cada mudança de etapa de temperatura. Para estes experimentos, selecione 1,5 °C.
8. Na medição de tamanho, defina o tempo de equilíbrio. Para esses experimentos, defina a duração para 120 s. Escolha o número de medições. Escolha 3 medidas e Automático para duração de medição.
9. Salve o SOP e feche o arquivo.
10. Se a tensão aplicada for usada, configure o potenciosstat(Seção 5) antes de continuar.
11. Uma vez configurado o potenciostat, ou se a tensão aplicada não for usada, retorne ao software Zetasizer e clique em Medir na barra de ferramentas e clique em Iniciar o SOP.
12. Uma vez que o texto na parte inferior da janela SOP diz, insira a célula e pressione quando estiver pronto,aperte o botão de partida do triângulo verde na parte superior da tela. Isso inicia o experimento, e o titular do cuvette não deve ser aberto depois disso.
13. Clique na guia Multi-view para observar os resultados em tempo real. Monitore continuamente a qualidade da amostra e dos dados observando a taxa de contagem e a função de correlação. Veja números 3-5 para resultados experimentais representativos.

5. Configuração potentiostat

NOTA: Recomenda-se usar o mesmo computador para o tamanho de partículas e operações de tensão aplicadas para sincronizar o tempo dos dados e, assim, facilitar a avaliação posterior. Consulte os manuais de instrumentos de tensão aplicados para orientação sobre configuração da fiação, consulta de software e escolha dos parâmetros apropriados. Um potenciostat gamry foi usado nesses experimentos.

1. Prepare dois fios finos o suficiente para caber através da pequena fenda na borda superior direita da área de suporte de cuvette DLS(Figura 6). Em uma extremidade do fio preparado, retire o isolamento para permitir uma conexão com o potencialiostat. Na extremidade oposta, solde um grampo curto de jacaré no fio e conecte-se ao cuvette. Certifique-se de que a tampa da amostra DLS está fechada.
2. Aperte o chumbo potente de referência branca e o contra-poderoso vermelho leve juntos a um dos fios preparados. Fixar o chumbo potente de trabalho verde e o sentido de trabalho azul potente levam ao outro fio preparado. Para este experimento, não use o sentido de contador laranja e as pistas de potencialiostat do solo negro e deixe-as flutuando. Para garantir que o circuito não acurto, esses fios não devem tocar em qualquer outra superfície condutora ou de chumbo.
   NOTA: Não importa para qual lado cada chumbo está conectado.
3. Dentro da barra de ferramentas de software, clique em Experimentar,clique na opção E Physical Electrochemistrye selecione Cronoamperometria. Para efeitos deste protocolo, use uma tensão aplicada simples aplicando uma única tensão com resposta atual medida ao longo do tempo (ou seja, cronoamperometria). Independentemente da metodologia eletroquímica específica, recomenda-se monitorar a resposta do sistema ao longo do tempo.
   1. Definir pré-passo, passo 1e tempo 2 de tensão vs referência. Esta será a tensão aplicada em todo o campo/cuvette. Defina a Voltagem para 1 V vs Referência para as três etapas.
   2. Definir o tempo de atraso pré-passo. Para esses experimentos, definido s de 0,5 para garantir que o sistema esteja estável na tensão desejada antes de gravar um sinal.
   3. Defina o tempo tanto para o Passo 1 quanto para o tempo passo 2. Isso controla quanto tempo a tensão será aplicada. Coloque ambos em 14.400 s para garantir que a tensão aplicada continue durante todo o experimento DLS.
   4. Definir o período de amostra. É com que frequência o gráfico lerá e registrará valores de corrente e tensão. Use 10.0 s neste experimento.
      NOTA: As outras configurações não são significativas para os dados aqui apresentados. Foram utilizados os valores padrão no sistema.
4. Clique em OK. A barra de ferramentas superior exibirá um sinal ativo, indicando que a tensão está sendo aplicada. A corrente deve dar uma resposta moderada (μA), e não sobrecarregar o potencialiostat. Se não for observado nenhum sinal ou sinal excessivo, o sistema poderá ser conectado incorretamente e, portanto, solucionar o erro e repetir até que a corrente esperada seja observada.
5. Volte ao passo 4.10 para iniciar o DLS SOP.

6. Análise de dados

NOTA: Esta seção detalha análises preliminares para entender os dados obtidos.

1. Importe dados em software saque preferido de análise de dados e gráficos.
2. Para cada corrida dentro de um conjunto de medições a uma determinada temperatura, determine o tamanho do volume de partículas do pico com o maior volume por cento.
3. Calcule o desvio médio e padrão do tamanho do volume sobre as três medidas registradas a uma determinada temperatura.
4. Para cada experimento, plote tamanho médio ± desvio padrão no eixo Y (escala de log) versus temperatura no eixo x (escala linear).
5. Import Gamry dados atuais para análise. Traçar dados atuais com tempo no eixo X e corrente (em microamps) no eixo Y.
6. Para relacionar dados atuais com dados de tamanho de partículas, compare o carimbo de tempo dos dados zetasizer com o carimbo de tempo atual do Gamry. Isso é possível se os dois tipos de dados forem coletados no mesmo computador. Caso contrário, a partida registrou tempos da melhor forma possível.

Resultados

A saída de arquivo em tempo real de cada execução na rampa de temperatura é apresentada como uma tabela, como visto na Figura 3. Cada registro pode ser escolhido independentemente para ver o tamanho do volume (Figura 4) e coeficiente de correlação (Figura 5). A distribuição do tamanho da partícula de volume (PSD) é o dado mais preciso para interpretar a distribuição global e o LCST, mas a...

Discussão

A aplicação da tensão às soluçõespNIPAM ou p (NIPAM-b -FMMA) alterou o comportamento de agregação de polímeros em resposta à temperatura. Com ambos os materiais, quando uma tensão aplicada estava presente, o tamanho do volume dos polímeros permaneceu alto mesmo quando as soluções foram resfriadas abaixo de seu LCST. Este foi um resultado inesperado, pois os ensaios sem tensão mostraram os polímeros retornando aos seus tamanhos originais. Esses experimentos nos permitem concluir que para nossa fai...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Isopropylacrylamide	Tokyo Chemical Industry CO., LTD	I0401-500G
1,4-Dioxane	Alfa Aesar	39118
2,2"-Azobis(2-methylpropionitrile)	SIGMA-ALDRICH	441090-100G
Cuvette	Malvern	DTS0012
Dynamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer NanoZS
Ferrocenylmethyl methacrylate	ASTATECH	FD13136-1G
Phthalimidomethyl butyl trithiocarbonate	SIGMA-ALDRICH	777072-1G
Potentiostat	Gamry	Reference 600