Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Resumo

Os efeitos de inibidores migrastatic na migração da pilha do cancro do glioma em ensaios tridimensionais da invasão (3D) usando um inibidor do do histone do histona (HDAC) são caracterizados pela microscopia confocal de alta resolução.

Resumo

Descoberta de drogas e desenvolvimento em pesquisa de câncer está sendo cada vez mais baseado em telas de drogas em um formato 3D. Os inibidores novos que visam o potencial migratório e invasor de pilhas de cancro, e conseqüentemente a propagação metastática da doença, estão sendo descobertos e considerados como tratamentos complementares em cancros altamente invasores tais como gliomas. Assim, é necessário gerar dados que permitam a análise detalhada das células em um ambiente 3D após a adição de uma droga. A metodologia descrita aqui, combinando ensaios de invasão esferóide com captura de imagem de alta resolução e análise de dados por microscopia de varredura por laser confocal (CLSM), permitiu a caracterização detalhada dos efeitos do potencial inibidor antimigratório MI-192 em células de glioma. Os spheroids foram gerados das linhas de pilha para ensaios da invasão em placas 96-well aderentes baixas e preparadas então para a análise de CLSM. O fluxo de trabalho descrito foi preferível em relação a outras técnicas geradoras de spheroóides comumente usadas, devido à facilidade e reprodutibilidade. Isto, combinado com a definição aumentada da imagem alcançada pela microscopia confocal comparada às aproximações convencionais do largo-campo, permitiu a identificação e a análise de mudanças morfológicas distintas em pilhas migratórias em um ambiente 3D que segue tratamento com a droga migrastatic MI-192.

Introdução

As tecnologias esferóide tridimensionais para a descoberta pré-clínica da droga e o desenvolvimento de drogas cancerosas potenciais estão sendo favorecidas cada vez mais sobre telas convencionais da droga; assim, há mais desenvolvimento de migração migrastatic-e prevenção de invasão-drogas. A lógica subjacente a esses desenvolvimentos no tratamento do câncer são claras: ensaios de esferóide 3D representam uma abordagem mais realista para a triagem de drogas anti-câncer potenciais como eles imitam a arquitetura do tumor 3D mais fielmente do que as culturas monocamada celular, recapitular interações do droga-tumor (cinética) mais exatamente, e permita a caracterização da atividade da droga em um ajuste tumor-relacionado. Além disso, o aumento da resistência a medicamentos quimiotóxicos em muitos tipos de câncer e altas taxas de mortalidade entre pacientes oncológicos devido à metástase potenciada pela capacidade das células cancerosas de migrar para sítios tumorais distantes suporta a inclusão de agentes quimioterapêuticos visando o potencial migratório das células cancerosas como tratamento adjuvante em futuros ensaios clínicos de câncer¹. Este é particularmente o caso em cânceres altamente invasivos, tais como glioblastomas de alto grau (GBM). A gerência de GBM inclui a cirurgia, a radioterapia, e a quimioterapia. No entanto, mesmo com o tratamento de combinação, a maioria dos pacientes recaída dentro de 1 ano do diagnóstico inicial com uma sobrevida mediana de 11-15 meses^2,3. Enormes avanços no campo da tecnologia 3D foram feitos ao longo dos últimos anos: sistemas rotativos, estruturas microfabricadas e scaffolds 3D, e outros ensaios individuais estão sendo continuamente melhorados para permitir testes de rotina em uma grande escala^{4, 5,6,7}. No entanto, os resultados obtidos desses ensaios devem ser analisados de maneira significativa, pois a interpretação dos dados é muitas vezes dificultada pelas tentativas de analisar dados gerados em 3D com sistemas de análise de imagem 2D.

Apesar de ser preferível em termos de velocidade de aquisição de imagem e redução de foto-toxicidade, a maioria dos sistemas de campo largo permanecem limitados pela resolução⁸. Assim, além dos dados lidos-outs relacionados à eficácia da droga, os efeitos detalhados da ação da droga em estruturas celulares 3D de células migratórias são inevitavelmente perdidos se imaged usando um sistema de campo largo. Por outro lado, a microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) captura imagens de alta qualidade, opticamente seccionadas que podem ser reconstruídas e renderizadas em 3D pós-aquisição usando software de computador. Assim, o CLSM é prontamente aplicável às estruturas celulares 3D complexas da imagem latente, assim permitindo a interrogação dos efeitos de inibidores antimigrastatic em estruturas 3D e em análises detalhadas de mecanismos da migração da pilha. Isto indubitavelmente guiará o desenvolvimento migrastatic futuro da droga. Aqui, um fluxo de trabalho combinado da geração do esferóide, do tratamento da droga, do protocolo de mancha, e da caracterização pela microscopia confocal de alta resolução é descrito.

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Protocolo

1. geração de spheroids da pilha

Dia 1

1. Prepare o meio de cultura padrão conforme exigido pela linha de célula investigação.
2. Realize todas as etapas associadas à cultura tecidual em uma capa de cultura tecidual usando técnicas de manuseio estéril.
3. Trypsinize e contagem de células cancerosas. Use 20 mL de suspensão celular por placa. Mantenha as suspensões da pilha em tubos universais estéreis claramente etiquetados.
4. Adicione um número predeterminado de células a cada poço. Tanto o número inicial de células quanto o tamanho de esferóide final exigido dependem da taxa de proliferação da linha celular que está sendo investigada.
   Nota: Para linhas celulares de glioma estabelecidas como U251 e KNS42^9,10, 5 x 10³ células/ml produzirá um esferóide microscopicamente visível (200 ou 800 μm) após 4 dias de incubação.
5. Ressuscitar as células em tubos universais por inversão suave para evitar aglutina celular. Pipete 200 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Se todos os poços não são exigidos, é aconselhável adicionar 200 μL de 1X PBS a cada poço vazio para evitar a evaporação.
6. Incubar as células em uma incubadora como normal em 37 ° c.
   Nota: As linhas celulares, como linhas de células de câncer de glioma, formarão esferóides dentro de 24 h. permita que a arquitetura celular 3D se forme incubando o esferoide por 72 h.

Dia 2

7. Verifique as células por microscopia de campo brilhante após 24 h. dependendo da linha celular, as células podem ter formado um esferóide detectável na parte inferior do poço.
   Nota: Linhas de células de câncer de glioma estabelecidas prontamente formam esferóides dentro de 24 h. as linhas celulares de câncer de glioma derivado do paciente podem levar até 1-2 semanas.

2. ensaio de invasão de colágeno

Dia 3

1. Coloc o colagénio, meio de cultura 5x, 1 M NaOH, e 1 20 mL de tubo no gelo.
2. Cuidadosamente e lentamente adicionar 10,4 mL de colágeno frio em um tubo de cultura refrigerada. Evite bolhas. Esta quantidade de colágeno é suficiente para 1 96-bem placa. O upscaling é possível, mas recomenda-se que o tubo de 1 20 mL por a placa esteja preparado em um momento.
3. Adicione suavemente 1,52 mL de meio de cultura de 5x estéril frio. Evite bolhas.
4. Pouco antes de usar, adicione delicadamente 72 μL de NaOH estéril frio de 1 M. Mantenha a solução no gelo.
5. Misture suavemente com pipetagem. Evite bolhas. A mistura eficiente conduz a uma mudança da cor (do vermelho ao alaranjado-vermelho (pH 7,4) no meio. Deixe a mistura no gelo até o uso.
6. Etapa crucial: Remova 190 μL do sobrenadante da placa 96-well preparada no dia 1. Tenha muito cuidado para não perturbar os esferóides que se formaram no fundo do poço. Use a pipeta em um ângulo para o lado, não o centro, do poço.
7. Adicione delicadamente 100 μL da mistura do colagénio a cada poço. Para evitar qualquer distúrbio esferóide, pipeta a mistura para baixo do lado do poço. Evite bolhas. Mantenha toda a mistura restante do colagénio no tubo de 20 mL na temperatura ambiente para avaliar a polimerização.
8. Incubar a placa na incubadora por pelo menos 10 minutos para permitir que o colagénio polimerize. Como um Guideline, se o colagénio restante ajustou-se, tornando-se semi-sólido e esponja-como, os esferoides estão prontos para ser tratados com o inibidor.
9. Adicione os fármacos ou inibidores na concentração de 2x para o meio de cultura. Adicione o meio suavemente a cada poço (100 μL por poço). Outra vez, pipeta o meio para baixo o lado do poço para evitar o distúrbio esferóide.
10. Observe e imagem cada esferóide por microscopia de campo brilhante às vezes T = 0 h, 24 h, 48 h e 72 h para avaliar a atividade medicamentosa. Em seguida, devolva a placa para a incubadora.
    Nota: Dependendo do comportamento invasivo da linha celular, a migração para longe do núcleo esferóide original pode ser observada a partir de 24 h em diante.

3. preparação de colágeno embutido spheroids e células migratórias para microscopia confocal

1. Coloc a placa em uma capa da cultura do tecido e remova delicadamente o sobrenadante (200 μL). Mais uma vez, tome cuidado para não perturbar o esferóide e evitar tocar o colágeno, pois isso pode interferir com o plugue de colágeno.
2. Substitua o sobrenadante por 100 μL de 1X PBS. Repita este passo de lavagem 3x.
3. Retire a lavagem final e substitua por 4% de formaldeído em 1X PBS (100 μL por poço).
   Atenção: O formaldeído é um potencial carcinógeno. Manuseie com cuidado de acordo com as diretrizes de saúde e segurança.
4. Coloc a placa 96-well em um banco do laboratório, cubra com a folha, e deixe-a para 24 h na temperatura ambiente.
5. Retire cuidadosamente o formaldeído e substitua por 1X PBS. Repita este 1X PBS lavagem 3x.
6. Prepare 0,1% Triton X-100 em 1X PBS. Retire a lavagem de 1X PBS e substitua-a por 100 μL da solução Triton X-100. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare a solução de bloqueio com 1X PBS e 0, 5% de leite em pó desnatado e misture completamente.
7. Remova Triton X-100 e lave 3x com 1X PBS. Adicionar 100 μL de solução de bloqueio a cada poço e incubar durante 15 min.
8. Diluir o anticorpo primário requerido no bloqueio do tampão na concentração predeterminada. Aqui, use anticorpo anti-rato IgG acetilado tubulina (1:100).
9. Centrifugue a mistura principal do amortecedor do anticorpo-bloqueio por 5 minutos em 15.682 x g. Retire cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione o sobrenadante (25 − 50 μL) a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 1 h.
10. Retire a solução de anticorpos e lave 3x com 1X PBS (100 μL por poço).
11. Diluir o anticorpo secundário no tampão de obstrução na concentração recomendada ou predeterminada além do que todas as manchas fluorescentes adicionais. Aqui, use 1:500 anticorpo conjugado fluorophore-488 do anti-rato, Phalloidin-594 (1:500) para a mancha do actina, e a mancha do ADN (DAPI).
12. Mais uma vez, centrifugue a solução secundária do anticorpo por 5 minutos em 13.000 rpm.
13. Remova a solução de obstrução de cada poço e adicione 25 − 50 μL da mistura secundária do anticorpo/Phalloidin/DAPI. Incubar no escuro para 1,5 h em temperatura ambiente.
14. Remova a solução secundária do anticorpo-corante e lave 3x com 1X PBS (100 μL por o poço).
15. Levante com cuidado plugues individuais do colagénio pela sucção com uma pipeta plástica (200 μL) no centro de uma corrediça de vidro Lisa de alta qualidade.
16. Adicione uma gota de um lamínula apropriado ao plugue do colagénio, assegurando-se de que a tomada esteja coberta completamente. Evite bolhas.
17. Aplique a lamínula da espessura óptima para o objetivo do microscópio que será usado para a imagem latente e permita ajustar durante a noite. Guarde as lâminas à temperatura ambiente no escuro.

4. microscopia de fluorescência

1. Capture imagens fluorescentes usando um microscópio confocal apropriado.

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Resultados

A tecnologia de esferóide tridimensional está avançando a compreensão de interações do droga-tumor porque é mais representativa do ambiente cancro-específico. A geração de esferóides pode ser alcançada de várias maneiras; as placas da baixa aderência 96-well foram usadas neste protocolo. Depois de testar vários produtos de diferentes fabricantes, as placas usadas aqui foram escolhidos porque eles consistentemente realizada melhor em termos de produção de esferóide bem su...

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Discussão

Uma maneira nova de criar esferoides da pilha de cancro para a identificação da atividade migrastatic da droga usando a microscopia confocal de alta resolução é descrita. O uso de placas aderentes baixas sobre outras técnicas, como gotas suspensas¹⁵, facilitou um meio de gerar esferóides reprodutíveis e uniformes para uso nos ensaios de migração e invasão de colágeno. Os pontos críticos neste protocolo são a remoção do meio de crescimento da placa 96-well antes do esferóide da pil...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.