Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Resumo

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

Resumo

Ubiquitina (ub) e ubiquitina-like (ubl) modificações pós-translacionais dependentes de proteínas desempenham papéis fundamentais de regulamentação biológica dentro da célula, controlando a estabilidade de proteínas, atividade, interações e localização intracelular. Eles permitem que a célula responda aos sinais e se adapte às mudanças em seu ambiente. Alterações nesses mecanismos podem levar a situações patológicas graves, como doenças neurodegenerativas e cânceres. O objetivo da técnica descrita aqui é estabelecer perfis de PTMs dependentes ub/ubls, de forma rápida e precisa, a partir de linhas celulares cultivadas. A comparação de diferentes perfis obtidos de diferentes condições permite a identificação de alterações específicas, como as induzidas por um tratamento, por exemplo. A transdução de células mediadas lentivirais é realizada para criar linhas celulares estáveis expressando uma versão de duas tags (6His e Flag) do modificador (ubiquitina ou um ubl como SUMO1 ou Nedd8). Essas marcas permitem a purificação da ubiquitina e, portanto, de proteínas ubiquitinadas das células. Isso é feito através de um processo de purificação de duas etapas: O primeiro é realizado em condições de desestruturação usando a tag 6His, e o segundo em condições nativas usando a tag Flag. Isso leva a um isolamento altamente específico e puro de proteínas modificadas que são posteriormente identificadas e semiquantificadas por cromatografia líquida seguida saqueade sem espectrometria de massa (LC-MS/MS) tecnologia. A análise de informática fácil dos dados de EM usando o software Excel permite o estabelecimento de perfis PTM eliminando sinais de fundo. Esses perfis são comparados entre cada condição, a fim de identificar alterações específicas que serão estudadas mais especificamente, começando com sua validação por técnicas de bioquímica padrão.

Introdução

O método aqui proposto é dedicado ao estudo de PTMs mediados pelos membros da família ubiquitina de células de mamíferos cultivadas, a fim de identificar potenciais alterações associadas a uma condição específica (tratamento, diferenciação, etc). Os PTMs representam o último passo da regulação das funções das proteínas^1. De fato, uma vez produzido pelas máquinas translacionais, a maioria, se não todas as proteínas, passam por diferentes tipos de PTMs que modulam sua atividade, interações moleculares e localização intracelular^1. Entre a pletora de PTMs estão os mediados pela família ubiquitinde de proteínas, ubiquitina em si e todos os ubiquitina-likes, têm o potencial de regular todas as proteínas intracelulares ou parcialmente citoplasmic². Por serem proteínas, elas podem ser conjugadas entre si, formando cadeias homogêneas e heterogêneas de diversas topologias, cada uma associada a funções regulatórias específicas^2. Ferramentas são necessárias para tentar decifrar e entender essa máquina complexa. Muitas abordagens foram desenvolvidas em todo o mundo, tendo suas próprias vantagens e desvantagens, e aqui propomos uma com alto desempenho adequado para células cultivadas.

A principal vantagem deste método é a sua precisão. Na verdade, a pureza das proteínas modificadas isoladas é altamente melhorada pelo uso combinatório das duas tags (6His e Flag) e os dois passos de procedimento e, portanto, é muito mais seletivo do que uma única marca de fusão Ub / Ubl^3,4. A presença da tag 6Sua permite um primeiro passo de purificação em uma condição totalmente desativação, evitando assim qualquer co-purificação de proteínas contendo domínios de ligação ubiquitina ou outras proteínas que se ligam aos ubiquitinados. Este é um problema técnico encontrado por várias outras abordagens com base na purificação de afinidade de proteomas ubiquitinados usando anticorpos específicos⁵ ou elementos de ligação à ubiquitina tandem (TUBEs)⁶. Importante, esta técnica não é tendenciosa em favor da purificação de um certo tipo de ubiquitinação, como poderia ser o caso de algumas outras abordagens, uma vez que tanto mono e diferentes tipos de polionionciações foram identificados⁷. Consequentemente, uma vez encontrado, uma alteração da ubiquitinação terá que ser estudada em mais detalhes por abordagens bioquímicas padrão, a fim de identificar o tipo exato de ubiquitinação envolvida.

Finalmente, outra vantagem técnica deste protocolo é o uso de lentivírus, que cria facilmente e rapidamente linhas celulares expressantes estáveis com nível razoável de expressões de modificador marcado sem interferir com o comportamento celular normal.

Considerando que um papel importante da ubiquitinação é direcionar proteínas para degradação proteassômica, sabe-se agora que tem muitas outras propriedades regulatórias para proteínas potencialmente intracelulares ou parcialmente intracelulares¹. O número dessas funções é ainda mais aumentado pela existência de muitas ubiquitinas como proteínas, formando uma família de proteínas que regulam quase todos os mecanismos celulares^1. Suas alterações podem ter impacto drástico na biologia celular e podem levar ou participar de situações patológicas^8,como o câncer^9. Assim, são necessárias ferramentas para explorar esta vasta paisagem e identificar as alterações associadas a uma condição patológica que poderia servir como novos alvos terapêuticos.

Este protocolo é dedicado às células da cultura, uma vez que precisam ser transduzidas para expressar ub/Ubl marcados exógenos. Uma vez criadas, essas linhas celulares estáveis podem ser usadas para gerar perfis Ubl a partir da cultura em 2D ou 3D ou xenoenxertos, ampliando assim o horizonte dos diferentes modelos experimentais que podem ser aplicados para estudar perfis de PTMs.

Protocolo

1. Geração de linhas celulares estáveis expressando 6His-Flag-Ubl

NOTA: Co-transfecção de células HEK-293T com pCCL-6HF-Ubl, pVSVG e delta-Helper.

1. Dia 0: Células de sementes 293T em uma placa de 6 poços para obter confluência de 50-70% no dia seguinte.
2. Dia 1: Co-transfect 50-70% de células confluentbiáticas com uma mistura de 1 μg de pCCL-6HF-Ubl ou pCCL-GFP, 1 μg de pVSVG e 1 μg de vetores delta-Helper, usando um reagente de transfecção e protocolo para produção de lentivírus. Após 6 h de transfecção, alterar o meio para um fresco correspondente às células a serem transduzidos. Sementes as células a serem transduzidas em uma placa de 6 poços, a fim de obter uma confluência de 10-20% no dia seguinte (o dia de iniciar a transdução).
3. Dia 2: 24 h após a transfecção, recuperar o meio contendo partículas lentivirais e filtro usando filtros de 0,45 μm. Se necessário, adicione o meio fresco neste momento, a fim de produzir um segundo lote de lentivírus. Substitua o meio das células a serem transduzidas (confluência de 10-20%) pela que contém lentivírus.
   NOTA: O meio lentiviral pode ser mantido em +4 °C por vários dias antes da transdução ou armazenado a -80 °C por meses.
4. Incubar as células com lentivírus entre 24 h e 72 h em uma incubadora padrão (37 °C, 5% CO_2),e depois alterar o meio para um padrão fresco. Se possível, verifique a expressão gfp usando um microscópio fluorescente invertido para avaliar a eficiência da transdução: porcentagem de células expressas e nível relativo de expressão por célula. Se nenhuma fluorescência for detectada, aguarde mais 2-3 dias, pois a expressão pode levar mais tempo dependendo do tipo de células a ser transduzida.
5. Se o controle gfp é positivo, crescer todas as células até ter o suficiente para realizar um controle de expressão de 6HF-Ubl por imunofluorescência e mancha ocidental usando anticorpo anti-bandeira.

2. Dupla purificação de proteínas modificadas

NOTA: Buffer 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Buffer 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glicerol, pH 8.0.
Buffer 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. Lise celular: Uma vez pronto, lavar pratos cultura pelo menos uma vez com fisiológico tampão de fosfato (PBS) à temperatura ambiente (RT) e proceder à lise celular ou, alternativamente, congelamento flash em líquido N₂ e armazenar a -80 ° C. Para a lysis, adicione 2 mL de Buffer 1 por um prato de 15 cm na RT. Use um raspador de células para recuperar todas as lysates em tubos cônicos de centrífuga de 50 mL (volume final de cerca de 20 mL).
2. Sonicate as lysates três vezes para 30 s separados por uma pausa de 1 minuto.
3. Centrífuga sonora a sonoridade sonora a 15.000 x g por 15 min.
4. Transfira o supernatant a um tubo novo usando um filtro da pilha (40 μm).
5. Determine a concentração das amostras e ajuste, se necessário, para obter a mesma quantidade de proteínas e o mesmo volume. Use uma quantidade total de proteína entre 50 e 100 mg (10 pratos com 15 cm de diâmetro para células MiaPaCa-2).
6. Adicionar Ni^{2 +}-NTA contas, usando 2 μL de contas por 1 mg de proteína.
7. Gire a 30 rpm durante 2.5 h em RT.
8. Pelotas as contas em 500 x g por 5 min.
9. Lave as contas com 1 mL de Buffer 1, transferindo as amostras para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, em seguida, transfira os tubos no gelo. Executar todos os próximos passos no gelo ou em 4 °C.
10. Lave duas vezes com 1 mL de tampão gelado 2 contendo 10 mm imidazole.
11. Para elute proteínas encadernadas, adicione 600 μL de Buffer 2 contendo 250 mM imidazole e gire para 2 h a 4 °C.
12. Pelotas as contas por centrífuga a 500 x g para 1 min. Transfira as supernatants para novos tubos pré-resfriados, de 1,5 mL e adicione 50 μL de contas conjugadas de anticorpos anti-Bandeira M2.
13. Gire a 30 rpm para 2,5 h a 4 °C, em seguida, lave 2 vezes com 500 μL de Buffer 2, em seguida, 2 vezes com 500 μL de Buffer 3.
14. Para a lusão final, adicione 100 μL de Buffer 3 contendo um peptídeo de bandeira em 0,1 μg/μL e gire a 4 °C para 1,5 h.
15. Centrífuga a 500 x g por 1 min e transferir as supernatants para novos tubos pré-resfriados.
16. Pegue 10% (10 μL) para carregar no SDS-PAGE e realize uma coloração prateada do gel para controlar a qualidade da purificação. Se a purificação parecer boa, analise os 90% deixados pela LC-MS/MS.

3. Processamento de dados de espectrometria de massa para gerar perfis de PTMs Ub/Ubls e identificar diferenças significativas entre eles

NOTA: Os resultados da análise de EM contêm muitas informações, incluindo o número total de peptídeos, bem como os valores de área de pico (média de área de peptídeo TOP 3¹⁰⁾para cada proteína identificada em cada amostra. Esses dados podem ser processados usando os números de contagem de peptídeos ou os valores de área de pico, ou ambos. Para cálculo com áreas de pico, porque esses valores são geralmente na faixa de 10^6,é necessário dividi-los por esta ordem antes de aplicar as mesmas fórmulas abaixo. Os resultados obtidos com ambas as metodologias de contagem devem mostrar uma forte correlação como geralmente acontece. Para cada proteína identificada, use as seguintes fórmulas onde:
v1 valores peptídeos na amostra de ubiquitina não tratada (por exemplo, Ub - droga)
valores de peptídeos v2 na amostra de ubiquitina tratada por Gemcitabina (por exemplo, Ub + droga)
k1 valores peptídeos na amostra GFP de controle não tratada (por exemplo, GFP - droga)
k2 valores peptídeos na gemcitabina tratado samostra gfp controle (por exemplo, GFP + droga).

1. Normalização: Normalizar os valores entre células tratadas com medicamentos e células não tratadas para Ubiquitin e GFP usando as seguintes fórmulas. Normalizado v = V e normalizado k = K.
   V1=v1. (v1+ v2) / (2. v1) ; V2=v2. (v1+ v2) / (2.
   K1=k1. (k1+ k2) / (2. k1) ; K2=k2. (k1+ k2) / (2.
2. Remoção de antecedentes: Usando as seguintes fórmulas, subtrai os valores na amostra de controle (GFP) dos valores na amostra de ubiquitina para obter valores específicos (V'1 e V'2) para cada proteína identificada em ambas as condições.
   V'1=V1-K1 se V1-K1≥0; V'1=0 se V1-K1<0
   V'2=V2-K2 se V2-K2≥0; V'2 =0 se V2-K2<0
3. Variação (Var) de ubiquitinação. Para obter uma pontuação (entre -100 e +100) para variações positivas e negativas de PP induzidas por um medicamento, use a seguinte fórmula em que a diferença entre valores específicos de amostras tratadas e não tratadas é dividida pela soma de todos os valores, incluindo aqueles em controle (penalizar proteínas também identificadas no controle gfp), e multiplicar por 100.
   Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ; -100Variações abaixo de -50 (repressão ao PTM) ou acima de 50 (indução de PTM) são geralmente consideradas significativas.
4. Confiança (Conf). Use a seguinte fórmula para obter um valor de confiança entre 0 e 100%,:
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0 se <0
   Valores acima de 50 são geralmente considerados confiantes.
5. Para obter uma distribuição mais agradável dos valores de indução/repressão e considerar os parâmetros de variação e confiança, multiplique os valores var e conf usando a seguinte fórmula onde V Var e C Conf
   =SI (V2>0;((V2*C2)^2)/(10^6);-((V2*C2)^2)/(10^6))
   NOTA: Como os valores de área de pico são geralmente mais precisos do que a contagem de peptídeos, é possível usar um software específico que se dedica à interpretação desse tipo de dados, como Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), seguindo recomendações de uso.

Resultados

Transdução de células de mamíferos culturais para criar células expressantes GFP e 6HF-Ub
Para produzir lentivírus que serão usados mais tarde para transduzir células MiaPaCa-2, 70% das células de confluentes HEK-293T são co-transfeccionadas com uma quantidade igual dos três vetores, pCCL-6HF-Ubiquitin ou GFP/Delta-Helper/pvSvG. Após 24 h de produção, o meio contendo partículas lentivirais é recuperado e filtrado. É possível neste momento controlar a ...

Discussão

Desenvolvemos uma metodologia robusta e confiável para gerar perfis de proteínas modificadas pelos principais membros da família ubiquitina. Na verdade, aplicamos com sucesso esse protocolo para gerar perfis de PTMs por ubiquitina, e também pela SUMO e Nedd8, e para detectar alterações associadas a um tratamento^7,em resposta à expressão excessiva ou knockdown de um determinado gene (dados não mostrado) e em células que adquiriram um fenótipo resistente a diversos medicamentos quimioter?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag