Detectando estabelecimento de suprimento de sangue compartilhado em camundongos parabióticos por injeção de glicose em veia caudal

Resumo

Aqui descrevemos um novo método de detecção de estabelecimento bem sucedido de circulação sanguínea compartilhada de dois parabiontes através de uma injeção de veia caudal de glicose, o que causa danos mínimos e não é fatal para os parabiontes.

Resumo

A parabiose é um método experimental para combinar cirurgicamente dois animais paralelos ao longo do eixo longitudinal do corpo. Apresentamos um protocolo para detectar o estabelecimento bem sucedido de chimerismo sanguíneo em parabiontes por uma injeção de glicose na veia caudal. Foram construídos camundongos parabióticos. A glicose foi injetada no camundongo doador através da veia traseira, e a flutuação do nível de glicose no sangue foi medida em ambos os camundongos usando um glucometer de sangue em diferentes pontos de tempo. Nossos resultados mostraram que após a injeção de glicose, o nível de glicose no sangue em camundongos doadores aumentou acentuadamente após 1 min e diminuiu lentamente depois disso. Enquanto isso, o nível de glicose no sangue dos camundongos receptores atingiu 15 min após a injeção. Resultados semelhantes foram obtidos com o azul Evans, usado como um controle positivo para a glicose. A flutuação síncrona dos níveis de glicose no sangue indica que o fluxo sanguíneo entre os dois camundongos foi estabelecido com sucesso.

Introdução

A parabiose é um método de modelagem no qual dois organismos vivos são unidos cirurgicamente e se desenvolvem como um único sistema fisiológico com um sistema circulatório compartilhado¹. Tais modelos têm sido amplamente utilizados para estudar fisiologia devido à vantagem de que as substâncias produzidas por um único indivíduo podem atuar em ambos os animais ao mesmo tempo através do sistema circulatório compartilhado. Desde meados da década de 1800, quando experimentos parabióticos foram pioneiros por Paul Bert², os métodos para a construção de modelos parabióticos tornaram-se padronizados. No entanto, um método simples e conveniente para verificar o estabelecimento bem sucedido do chimerismo sanguíneo está faltando. Foi relatado que a circulação cruzada pode ser avaliada com sucesso por injetar intraperitoneicamente 0,5% de tinta azul Evans em um dos parabiontes seguido pela medição da absorção do azul Evans no sangue de ambos os parabiontes com um leitor de microplaca³. Outro método requer uma raça específica do mouse que contém CD45.1⁺- e monocitos rotulados por CD45.2⁺em cada parabionte. A citometria celular é então usada para determinar o chimerismo sanguíneo medindo a frequência dos dois marcadores em monocitos do baço ou sangue⁴. No entanto, esses métodos são muitas vezes letais ou complicados para os animais, e um método seguro e simples para verificação rápida e confiável de modelos parabióticos é altamente desejável. Neste estudo, estabelecemos um novo método para esse fim, que foi validado em um modelo de parabiose de camundongos. A concentração de glicose em amostras de sangue retiradas de uma veia traseira é medida usando um glucometer, e o padrão de mudanças do nível de glicose em camundongos doadores e receptores é considerado uma indicação de chimerismo de circulação. Nomeamos este método de "método de flutuação de glicose". A aplicação deste método de validação não se limita aos camundongos, mas pode ser estendida a diversos modelos patológicos, exceto aqueles com grave disregulação do metabolismo da glicose. O procedimento é simples, economizando tempo e seguro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais e seus cuidados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica harbin.

NOTA: As ferramentas e equipamentos necessários para o método estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de materiais e animais

1. Peça C57BL/6 camundongos machos com peso entre 20 g-25 g de um fornecedor animal de laboratório padrão.
2. Abrigar os ratos em um ciclo de 12h de luz: 12h de escuridão a 24-26 °C com acesso a délibitum à água e à comida.

2. Parabiose

1. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-2-tribromoetanol a uma concentração de 0,1 mL/10 g. Confirme a anestesia adequada, como indicado pelo relaxamento muscular, respiração lenta e constante, perda de reflexo da estimulação da pele e desaparecimento do reflexo córnea.
2. Aplique pomada oftalma com uma ponta Q para evitar olhos secos.
3. Realizar o procedimento de parabiose como descrito anteriormente⁵.
   1. Coloque os ratos na posição supina. Raspe completamente o lado esquerdo de um rato e o lado direito do outro mouse começando a aproximadamente 1 cm acima do cotovelo a 1 cm abaixo do joelho com uma barbeador elétrica. Use creme depilatório para limpar totalmente a pele na pele raspada.
   2. Limpe as áreas raspadas com iodophor. Coloque os ratos em uma almofada aquecida coberta por uma almofada estéril.
   3. Crie incisões longitudinal de pele a partir de 0,5 cm acima do cotovelo para 0,5 cm abaixo da articulação do joelho usando um par de tesouras afiadas no lado raspado de cada animal.
   4. Desative a pele da fáscia subcutânea gentilmente após a incisão.
   5. Conecte o olecranon e o joelho do parabionte com uma sutura 3-0.
   6. Sutura a pele raspada com uma sutura contínua 5-0.
4. Injete 0,5 mL de 0,9% naCl subcutâneamente em cada mouse para evitar desidratação.
5. Injete tramadol (10 mg/25 g/dia) intramuscularmente a cada rato para aliviar a dor.

3. Validação do chimerismo de circulação

1. Método de flutuação da glicose
   NOTA: Verifique a construção bem sucedida do chimerismo de circulação entre parabiontes usando o método de flutuação da glicose (sem jejum) no 10º dia após a cirurgia de parabiose.
   1. Anestesiar os parabiontes por injeção intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-2-tribromoetanol a cada camundongo com concentração de 0,1 mL/10 g.
   2. Conserte os ratos doadores em um fixador de cauda de rato visual venoso.
   3. Esfregue as veias caudais no flanco de uma das caudas do parabionte com uma bola de algodão encharcada em 70-75% de álcool para limpar a cauda e dilatar os vasos sanguíneos.
   4. Segure uma seringa de 1,0 mL contendo glicose na mão direita e mantenha a agulha paralela à veia (menos de 15°).
   5. Insira a agulha em uma posição de aproximadamente 2-4 cm da ponta da cauda.
   6. Injete 100 μL de glicose (1,2 g/kg) no doador dentro de 10 s.
      NOTA: O termo doador refere-se ao parabionte que recebe a injeção de glicose através da veia traseira. O beneficiário é o outro parabionte, que não recebe glicose diretamente.
   7. Limpe os dedos dos dedos com iodophor. Corte os dedos dos camundongos doadores e receptores com uma tesoura e colete uma gota de sangue em diferentes pontos de tempo após a injeção de glicose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min e 60 min). Remova o coágulo sanguíneo em cada ponto de coleta para evitar mais danos.
      NOTA: O volume de sangue coletado foi de 10-25 ul para um teste, e 90-225 ul no total.
   8. Escorra o sangue para o centro das tiras de teste de gliccometer para detecção do nível de glicose.
2. Use o Contrastain azul de Evan como um controle positivo³.
   1. Injete 200 μL de 0,5% o Contrastain azul de Evan intraperitonely no mouse doador.
   2. 2 h depois, eutanize os parabiontes por injeção intraperitoneal de 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol a cada camundongo com uma concentração de 0,2 mL/10 g, e coletar sangue de ambos os parabiontes por punção cardíaca.
   3. Centrífuga as amostras de sangue em 916 x g por 15 min.
   4. Colete soro do supernatante.
   5. Diluir o soro com 0,9% de NaCl às 1:50.
   6. Meça a absorção das amostras de soro diluídas em 620 nm com espectrofofômetro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Em seis camundongos doadores, os níveis de glicose no sangue aumentaram acentuadamente para 26,5 μmol/L (aumento de 173%) em uma média de 1 min após a injeção de 100 μL de glicose (1,2 g/kg) através da veia traseira e, em seguida, gradualmente diminuíram para 13,3 μmol/L a 60 min. Em camundongos receptores, a glicemia aumentou lentamente após a injeção e atingiu o primeiro pico de nível de 15 min (aumento de 47%, 12,2 μmol/L). Com base nos resultados acima, o padrão de qui...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

A parabiose refere-se à técnica cirúrgica de conectar dois animais vivos para estabelecer um sistema vascular comum por meioexperimental^6,7,8. A vantagem deste modelo é que as substâncias produzidas por um único indivíduo podem atuar em ambos os animais ao mesmo tempo. Assim, o modelo de parabiose pode ser usado para explorar o papel de uma substância ou fator em uma doença relacionada, produzindo muitas conclusões sig...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#