Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

Resumo

O protocolo apresentado utiliza citometria de fluxo para quantificar o número de células proliferantes e mortas em enteróides de camundongos cultivados. Este método é útil para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a proliferação organoide e a sobrevivência.

Resumo

O epitélio intestinal atua como uma barreira que impede a entrada de conteúdo luminal, como microbiota patogênica e toxinas, de entrar no resto do corpo. A função da barreira epitelial requer a integridade das células epiteliais intestinais. Enquanto a proliferação de células epiteliais mantém uma camada contínua de células que forma uma barreira, danos epiteliais levam à disfunção da barreira. Como resultado, o conteúdo luminal pode atravessar a barreira intestinal através de uma via irrestrita. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a muitas doenças intestinais, como doença inflamatória intestinal. As criptas intestinais de camundongos isolados podem ser cultivadas e mantidas como estruturas semelhantes a criptografia, que são chamadas de organoides intestinais ou "enteróides". Os enteróides são ideais para estudar a proliferação e a morte celular de células epiteliais intestinais in vitro. Neste protocolo, descrevemos um método simples para quantificar o número de células proliferativas e mortas em enteróides cultivados. 5-etilôndeus-2'-desoxuridina (EdU) e iodeto de propídio são usados para rotular células proliferantes e mortas em enteróides, e a proporção de proliferação e células mortas são então analisadas por citometria de fluxo. Esta é uma ferramenta útil para testar os efeitos do tratamento medicamentoso na proliferação de células epiteliais intestinais e na sobrevivência celular.

Introdução

Uma função fundamental das células epiteliais intestinais é proteger a entrada de conteúdos luminários como bactérias patogênicas e toxinas^1,2. Para realizar tal função, as células-tronco intestinais proliferam e se diferenciam continuamente em uma variedade de células epiteliais, incluindo enterócitos e células secretas, que formam uma barreira formando conexões apertadas³. A rápida renovação das células epiteliais intestinais requer coordenação rigorosa da proliferação celular, diferenciação celular e morte celular^4,5. A redução da proliferação celular ou a morte celular excessiva leva a danos epiteliais e a função de barreira comprometida^1,6. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a doenças inflamatórias intestinais^7,8.

Um método para cultivar criptas intestinais foi desenvolvido anteriormente. Usando essa técnica, as criptas de camundongos isolados crescem em organoides intestinais (enteróides), que possuem criptosas como estruturas e contêm toda a linhagem celular epitelial intestinal^9,10. 5-Etilnyl-2'-deoxyuridina (EdU) é um analógico de timmidina capaz de substituir a timina (T) no DNA que está passando por replicação durante a proliferação celular. As células proliferativas podem ser rotuladas de forma rápida e precisa pela coloração de EdU. Propidium iodeto (PI) é um análogo de brometo de etídio que libera fluorescência vermelha após inserção em DNA de dupla cadeia. Pi detecta especificamente células mortas, uma vez que só passa pela membrana celular danificada.

Neste protocolo, primeiro descrevemos como isolar criptas do intestino delgado murina e depois cultimá-las como enteróides in vitro. Descrevemos então como analisar as células proliferativas e mortas em enteróides por incorporação e citometria de fluxo da EdU e PI.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) na Universidade Soochow.

1. Isolamento organoide intestinal e cultura

1. Isolamento das criptas intestinais e da cultura enteróide
   1. Eutanize um rato selvagem de 8 semanas com inalação de CO_2. Use fórceps de tecido e tesouras de íris finas para dissecar aproximadamente 8 cm de ileum.
   2. Saia usando uma seringa com agulha de alimentação de gavage com cerca de 40 mL de soro soro tampão de fesfato frio (DPBS), em seguida, corte longitudamente com tesouras e abra o íleum.
   3. Corte o ileum em pequenas peças (0,5-1,0 cm). Coloque as peças em 5 mL de DPBS frios estéreis em um tubo cônico de 15 mL, em seguida, rocha por 5 min no gelo.
   4. Use um controlador pipette para aspirar o DPBS e substituí-lo por 10 mL de tampão frio 1 (2 mM EDTA em DPBS). Pedra por 30 min no gelo.
   5. Use o controlador pipette para aspirar buffer 1 e substitua por 10 mL de tampão frio 2 (54,9 mM D-sorbitol, sacarose de 43,4 mM em DPBS). Agite por 2-3 min à mão (~80 shakes/min).
   6. Pegue uma gota de 20 μL de conteúdo buffer 2 depois de tremer e inspecione um microscópio.
   7. Filtrar o conteúdo buffer 2 com um filtro de célula estéril de 70 μm e, em seguida, coletar o buffer filtrado com um tubo cônico de 50 mL.
   8. Pipette 20 μL de filtragem no slide para contar as criptas. Transfira um volume suficiente de buffer 2 da etapa 1.1.7 para garantir que existam ~500 criptas/bem.
   9. Gire para baixo a 150 x g por 10 min a 4 °C. Uma vez que a fiação é concluída, cuidadosamente aspirar o supernatant.
   10. Suspenda as criptas em 50 μL de matriz de membrana do porão (por exemplo, Matrigel) por 500 criptas, pipette para cima e para baixo (tendo o cuidado de evitar bolhas), em seguida, coloque uma gota de 50 μL de matriz de membrana do porão/mistura de cripta no centro de um poço em uma placa de poço de 24. Incubar por 30 min a 37 °C para polimerizar a matriz de membrana do porão.
   11. Após 30 minutos de polimerização, adicione cuidadosamente 600 μL de mídia minigut (avançado o meio águia modificado de Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamina, caneta/estreptococo [100 unidades/mL], 10 mM Hepes, Suplemento N2 [1:100], suplemento B27 [1:50] com fator de crescimento epidérmico [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], e Y27632 [10 μM]) para cada poço, em seguida, devolver a placa para a 37 °C/ incubadora C. Observe um microscópio todos os dias, e mude a mídia a cada 2-3 dias.
2. Passaging enteróide
   NOTA: Para culturas longas, os enteróides devem ser divididos aproximadamente a cada semana.
   1. Para passar os enteróides, coloque a placa de cultura do tecido no gelo. Aspirar a mídia e adicionar 1 mL de DPBS frio a cada poço. Use uma ponta P1000 para pipette para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão.
   2. Passe para cima e para baixo uma vez através de uma seringa de insulina de 1 mL (27 G) e em um tubo cônico de 15 mL. Gire para baixo por 5 min a 150 x g a 4 °C.
   3. Use pipeta para remover DPBS. Resuspender em 50 μL de matriz de membrana do porão/bem.
   4. Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C por 30 min para permitir que a matriz de membrana do porão seja polimerizado. Sobreponha cada poço com 600 μL de mídia ENR (mídia de minigut, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), em seguida, devolva a placa para a incubadora.

2. Análise de Citometria de Fluxo de Células EdU-positivas em Enteróides

NOTA: A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células EdU-positivas em enteróides.

1. Incubação de enteróides com EdU
   1. Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.
   2. Defina o grupo controle (enteróides não tratados) e o grupo experimental (enteróides tratados com interleucina de 5 ng/mL 22 [IL-22]). Prepare pelo menos três réplicas para cada grupo.
   3. Adicione EdU ao meio ENR para preparar o meio EdU com uma concentração de 50 μM. Adicione 600 μL de edu médio a cada poço e incuba por 2 h em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de UEd como um controle negativo para subtração de fundo.
2. Colheita de enteróides da matriz de membrana do porão
   1. Use um controlador pipette para aspirar o meio EdU e lave 1x com DPBS. Adicione 1 mL de DPBS.
   2. Use ponta de pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão. Transfira para um tubo de 15 mL e gire para baixo a 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.
   3. Adicione 500 μL de enzimas de dissociação celular(Tabela de Materiais)e incuba por 15 min a 37 °C. Use ponta de pipeta P200 e pipeta para cima e para baixo para quebrar enteróides em células únicas.
   4. Adicione 3 mL de meio DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e repetidamente pipette com uma ponta de pipette P1000.
   5. Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o meio supernatante. Resuspender as células com 1 mL de DPBS.
3. Fixação e permeabilização das células
   1. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL, gire para baixo a 300 x g por 5 min e descarte o supernatante.
   2. Resuspender as células com 1 mL de 4% paraformaldeído (PFA), fixar por 15 min à temperatura ambiente (RT) e girar para baixo a 300 x g por 5 min. Aspirar o supernatante com uma ponta de pipeta, lavar 1x com DPBS, e girar para baixo para remover o supernatante.
   3. Resuspenda as células com 1 mL de 0,5% de surfactante nonionic. Incubar por 10 min na RT.
   4. Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o supernatant. Lave 1x com DPBS e gire para baixo para remover o supernatante.
4. Detecção de EdU
   1. Prepare soluções de estoque para cada componente com antecedência: 1) solução de trabalho do azide Alexa Fluor, 2) solução de trabalho do buffer de reação 1x EdU e 3) solução de estoque de 10x de aditivo tampão EdU.
   2. Prepare 1x aditivo tampão EdU diluindo a solução 10x 1:10 em água desionizada. Prepare esta solução de novo.
   3. Prepare o coquetel de reação de acordo com a Tabela 1.
      NOTA: Adicione os ingredientes na ordem listada na tabela. Use o coquetel de reação dentro de 15 minutos de preparação.
   4. Adicione 100 μL de coquetéis de reação a cada tubo de 1,5 mL. Resuspender as células, proteger da luz, incubar por 30 min na RT.
   5. Centrífuga a 300 x g por 5 min e aspirar a solução de reação com ponta de pipeta suavemente.
   6. Adicione 0,5% de penetrante surfactante nonionic a cada tubo para lavar 1x na RT. Centrifuge a 300 x g por 5 min, aspirar o supernatante com ponta de pipeette suavemente, e resuspender as células em 1 mL de DPBS.
5. Análise das células por citometria de fluxo
   1. Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e, em seguida, colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL. Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível.
      NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias.
   2. Selecione o canal apropriado (de acordo com o tipo de Azide Alexa Fluor no kit EdU; aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.
   3. Estratégia gating
      1. Desenhe um gráfico pseudocolor FSC-A (eixo x) vs. SSC-A (eixo y) e distribua a maioria das células para a faixa visível do mapa de pontos ajustando a tensão. Selecione a população celular (R1) e exclua os detritos celulares no canto inferior esquerdo.
      2. A partir da população celular R1, estabeleça um FSC-A (eixo x) vs. FSC-H (eixo y) pseudocolor, e definir o portão para selecionar células únicas (R2) para excluir aglomerados celulares.
      3. A partir da população celular R2, estabeleça a intensidade da fluorescência (eixo x) vs. enredo de número de celular (eixo y) e use o controle negativo para definir o portão. A região do sinal fluorescente é uma região celular positiva (R3). Compare a proporção de células EdU-positivas (R3) entre os grupos experimentais e de controle.

3. Análise de Citometria de Fluxo de Células PI-positivas em Enteróides

NOTA: A figura 2 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células PI-positivas em enteróides.

1. Incubação de células enteróides com PI
   1. Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.
   2. Defina o grupo controle (não tratado) e o grupo experimental (tratado IL-22), usando pelo menos três réplicas para cada grupo.
   3. Adicione PI ao meio ENR para preparar o meio PI com uma concentração de 3 μM.
   4. Adicione 600 μL de pi médio a cada poço e incuba por 30 min em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de PI como um controle negativo para subtração de fundo.
2. Colher enteróides da matriz de membrana do porão seguindo as etapas 2.2.1-2.2.5.
3. Análise das células por citometria de fluxo
   1. Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL.
   2. Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível.
      NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias.
   3. Selecione o canal apropriado (aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.
   4. Use a mesma estratégia de gating descrita na seção 2.5.3.

Resultados

Pequenas criptas intestinais foram isoladas e cultivadas como enteróides na matriz de membrana do porão. Os enteróides começaram a formar brotos 2 dias após o isolamento. No 6º dia, os enteróides tinham muitos botões com muitos detritos (células mortas) no lúmen. Os enteróides estavam prontos para serem passagens nesta fase (Figura 3).

Inúmeros estudos têm demonstrado que citocinas inflamatórias são essenciais para a manutenção da homeostase epite...

Discussão

Este protocolo detalha as etapas necessárias para a cultura de enteróides in vitro e quantificação de células EdU e PI-positivas nos enteróides por citometria de fluxo. Há várias vantagens dessa estratégia. Primeiro, a rotulagem EdU é usada para detectar células proliferadoras em enteróides. Em comparação com o ensaio tradicional da BrdU, o método de rotulagem EdU é mais rápido, mais sensível e mais preciso. EdU é muito semelhante à timina (T), que substitui a timina na síntese de DNA durante a divis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049