Integração de abordagens de bioinformática e validações experimentais para entender o papel da sinalização de notch no câncer de ovário

Resumo

A bioinformática é uma maneira útil de processar conjuntos de dados em larga escala. Através da implementação de abordagens de bioinformática, os pesquisadores podem obter aplicações perspicazes e de forma eficiente e de forma rápida. Este artigo demonstra a utilização da bioinformática na pesquisa do câncer de ovário. Ele também valida com sucesso os achados de bioinformática através da experimentação.

Resumo

A sinalização de notch é uma via regulatória altamente conservada envolvida em muitos processos celulares. A desregulação desta via de sinalização muitas vezes leva à interferência com o desenvolvimento adequado e pode até resultar em iniciação ou progressão de cânceres em certos casos. Porque este caminho sere funções complexas e versáteis, pode ser estudado extensivamente com muitas aproximações diferentes. Destes, a bioinformática fornece um método de estudo inegavelmente econômico, acessível e amigável. A bioinformática é uma maneira útil de extrair informações menores de conjuntos de dados em larga escala. Através da implementação de várias abordagens de bioinformática, os pesquisadores podem interpretar de forma rápida, confiável e eficiente esses grandes conjuntos de dados, produzindo aplicações perspicazes e descobertas científicas. Aqui, um protocolo é apresentado para a integração de abordagens bioinformáticas para investigar o papel da sinalização notch no câncer de ovário. Além disso, os achados bioinformática são validados por meio de experimentação.

Introdução

A via de sinalização notch é uma via altamente conservada que é importante para muitos processos de desenvolvimento dentro de organismos biológicos. Notch sinalização tem sido mostrado para desempenhar um papel significativo na proliferação celular e auto-renovação, e defeitos na via de sinalização Notch pode levar a muitos tipos de cânceres^1,2,3,4,5,6. Em algumas circunstâncias, a via de sinalização notch tem sido associada ao crescimento do tecido e câncer, bem como a morte celular e supressão do tumor⁷. Vários receptores Notch (NOTCH 1-4) e co\u2012ativator Mastermind (MAML 1-3), todos com funções diversas, adicionam um nível adicional de complexidade. Quando o caminho de sinalização do entalhe for sofisticado nos termos das funções, seu caminho do núcleo é simples em uma base molecular^8. Receptores de entalhe atuam como proteínas transmembranacompostas de regiões extracelulares e intracelulares^9. Uma ligação para a região extracelular dos receptores Notch facilita a clivagem proteolítica, o que permite que o domínio intracelular Notch (NICD) seja liberado no núcleo. NICD, em seguida, liga-se a co\u2012activatetor Mastermind para ativar a expressão genética a jusante¹⁰.

Nos últimos anos, notch sinalização tem sido mostrado para desempenhar uma variedade de papéis na iniciação e progressão de vários tipos de cânceres em diferentes espécies^6,11. Por exemplo, a sinalização de Notch tem sido associada à tumorigênese envolvendo o gene NOTCH1 humano^12. Recentemente, os genes NOTCH2, NOTCH3, Delta-like 3 (DLL3), Mastermind\u2012like protein 1 (MAML1), e um domínio dedesintegrina e metalloproteinase\u2012contendo genes de proteína 17 (ADAM17) mostraram-se fortemente associados ao câncer de ovário, especialmente com a má sobrevida geral dos pacientes^13.

À medida que a quantidade de dados experimentais e associados ao paciente aumenta continuamente, a demanda por análise dos dados disponíveis também aumenta. Os dados disponíveis estão espalhados por publicações e podem fornecer descobertas inconsistentes ou até contraditórias. Com o desenvolvimento de novas tecnologias nas últimas décadas, como o sequenciamento de última geração, a quantidade de dados disponíveis cresceu exponencialmente. Embora isso represente avanços rápidos na ciência e oportunidades para a pesquisa biológica contínua, avaliar o significado dos dados disponíveis publicamente para resolver questões de pesquisa é um grande desafio¹⁴. Acreditamos que a bioinformática é uma maneira útil de extrair informações menores de conjuntos de dados em larga escala. Através da implementação de várias abordagens de bioinformática, os pesquisadores podem interpretar de forma rápida, confiável e eficiente esses grandes conjuntos de dados, produzindo descobertas perspicazes. Essas descobertas podem variar desde a identificação de potenciais novos alvos de terapia medicamentosa ou biomarcadores de doenças, até tratamentos personalizados para pacientes^15,16.

A bioinformática em si está evoluindo rapidamente, e as abordagens estão em constante mudança à medida que os avanços tecnológicos varrem a ciência médica e biológica. Atualmente, abordagens comuns de bioinformática incluem a utilização de bancos de dados e programas de software acessíveis ao público para analisar sequências de DNA ou proteínas, identificar genes de particular relevância ou importância e determinar a relevância de genes e produtos genéticos por meio da genômica funcional¹⁶. Embora o campo da bioinformática certamente não se limite a essas abordagens, elas são significativas para ajudar clínicos e pesquisadores a gerenciar dados biológicos para o benefício dos pacientes como um todo.

Este estudo tem como objetivo destacar vários bancos de dados importantes e seu uso para pesquisas sobre a via de sinalização Notch. NOTCH2, NOTCH3,e seu co\u2012activator MAML1 foram usados como exemplos para o estudo de banco de dados. Estes genes foram usados porque a importância do caminho de sinalização notch no câncer de ovário foi validada. Análises sistemáticas de dados recuperados confirmaram a importância da sinalização de Notch no câncer de ovário. Além disso, como a sinalização de Notch é bem conservada entre as espécies, confirmou-se que a superexpressão da Drosophila melanogaster NICD e Mastermind juntos pode induzir tumores nos ovários de Drosophila, apoiando os achados do banco de dados e o papel significativo e conservado da sinalização de Notch no câncer de ovário.

Protocolo

1. Previsão de resultados clínicos de perfis genômicos (PRECOG)

NOTA: O portal PRECOG (precog.stanford.edu) acessa dados disponíveis publicamente de 165 conjuntos de dados de expressão de câncer, incluindo níveis de expressão gênica e resultados clínicos do paciente¹⁷. Ele fornece especificamente a análise Meta\u2012Z, que incorpora grandes conjuntos de dados para fornecer Z\u2012scores de genes diferentes em 39 tipos de câncer para indicar a sobrevivência geral do paciente. As taxas de sobrevivência pobres e boas são indicadas por valores positivos e negativos de Z\u2012score, respectivamente.

1. Crie uma conta com um e-mail afiliado acadêmico para acessar esse banco de dados. Digite o endereço de e-mail e senha associada com a conta.
2. Clique no botão Detalhes de Visualização localizado embaixo do título de análise Meta-Z.
3. Insume o gene do interesse na barra da busca.
4. Use a barra de rolagem localizada na parte inferior da tela para obter a sobrevivência Z-score para o tipo específico de câncer de interesse.

2. CSIOVDB CSIOVDB

NOTA: CSIOVDB(csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html)é um banco de dados de microarray desenvolvido pelo Cancer Science Institute of Singapore para estudar o câncer de ovário¹⁸. Este banco de dados contém dados de carcinomas de diferentes locais tumorais, bem como dados normais do tecido do ovário. Além disso, o CSIOVDB fornece parcelas de sobrevivência Kaplan\u2012Meier para avaliar a sobrevivência do paciente com níveis diferenciais de expressão gênica. Csiovdb pode ser aplicado para investigar a associação entre os níveis de expressão gênica e estágios/notas de câncer de ovário.

1. Insumo gene de interesse, em seguida, clique no botão de pesquisa.
2. Clique na guia estado da doença.
   NOTA: Esta guia fornece estatísticas sumárias da expressão gênica do gene-alvo de interesse em estados de doença do câncer de ovário.
3. Clique na guia Histologia.
   NOTA: Esta guia fornece estatísticas sumárias da expressão gênica do gene-alvo de interesse em grandes histologias de câncer de ovário.
4. Clique na aba Clinico-patológico parâmetros.
   NOTA: Esta guia fornece uma comparação dos níveis de expressão gênica entre diferentes estágios de câncer de ovário, notas e respostas clínicas com testes Mann-Whitney.
5. Clique na aba Survival.
   NOTA: Esta guia fornece parcelas Kaplan-Meier associadas com a sobrevivência global e sobrevivência livre de doenças. Para este banco de dados, a sobrevida livre de doenças é considerada a sobrevivência livre de progressão e recorrência^18. Análises multivariadas para sobrevivência global e sobrevivência livre de doenças também são encontradas esta guia. As análises multivariadas comparam características relacionadas ao prognóstico do câncer de ovário (estágio, grau, desmaioria cirúrgico, histologia, idade) e o gene de interesse.
6. Clique na aba Subtype.
   NOTA: Esta guia fornece estatísticas sumárias e testes Mann-Whitney para o nível de expressão do gene de interesse em subtipos moleculares de câncer de ovário. Esta guia também fornece parcelas Kaplan-Meier associadas com a sobrevivência global e sobrevivência livre de doenças do gene de interesse em subtipos moleculares de câncer de ovário.

3. Expressão gênica em tecido normal e tumoral (GENT)

NOTA: O portal GENT (médico\u2012genome.kribb.re.kr/GENT) é desenvolvido e mantido pelo Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)¹⁹. Ele coleta 16.400 (U133A; 241 conjuntos de dados) e 24.300 (U133plus2; 306 conjuntos de dados) amostras disponíveis publicamente. Após a padronização, o GENT oferece dados de expressão gênica em diversos tecidos, que são ainda mais divididos em tumores e tecidos normais.

1. Clique na guia de pesquisa na parte superior da tela.
2. Na seção rotulada 1. Palavra-chave, selecione o símbolo gene para os termos do menu dropdown, entrada do símbolo genético do gene de interesse na área em branco da seção palavra-chave, e selecionar tecido para a opção tipo.
3. Clique no botão de pesquisa na parte inferior do 1. Seção de palavras-chave. Ele mostra os gráficos sumários da expressão gênica em tecidos normais e tumorais de diferentes tipos de câncer com base nas plataformas U133A e U122Plus2.
   NOTA: É opcional selecionar a opção de filtragem de dados na parte superior do gráfico sumário para destacar um banco de dados específico para estudar.
4. Clique no link ao lado do Download de Dados de Resultado para acessar as informações detalhadas sobre os valores de expressão gênica, tipos de tecidos e fontes de dados.

4. Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) 4. Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)

NOTA: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) foi criado pelo Instituto Broad e fornece perfis genômicos e mutações de 947 linhas de células cancerosas humanas²⁰.

1. Insira os genes desejados na barra de pesquisa e, em seguida, clique no botão de pesquisa.
2. Na seção rotulada Select Dataset,clique na opção de expressão mRNA (RNAseq) do menu de desistente.
   NOTA: Outras opções incluem expressão mRNA (Affy), knockdown de Aquiles shRNAe número de cópia.
3. Clique no botão Toggle All Traces. Selecione o tipo de tecido de interesse da caixa cinza à direita. Desça para a parte inferior da tela e clique no botão de expressão Download mRNA.
4. Abra o documento de texto baixado. Copiar e colar todo o texto na Folha 1. Copiar todo o texto na Folha 1.
5. Clique na folha na conta de software de planilha Folha 2 na parte inferior da planilha. Clique à direita na coluna A, selecione Colar Especiale, em seguida, selecione a opção Transpose na Folha 2.
6. Uma vez que o texto é transposto em duas colunas na Folha 2,clique na seta de queda para a posição da opção Sort & Filter e, em seguida, selecione a opção Filtro. Uma seta aparecerá na área de posição rotulada gene. Clique na seta e digite o tipo de tecido de interesse.
   NOTA: Esta etapa filtrará todos os dados e indicará somente níveis da expressão do gene para o tipo do tecido de interesse.

5. cBioPortal 5. cBioPortal

NOTA: cBioPortal (www.cioportal.org) foi desenvolvido no Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), e acessa, analisa e visualiza dados genômicos de câncer em grande escala^21,22. Especificamente, este portal permite aos pesquisadores procurar alterações genéticas e redes de sinalização.

1. Usando a consulta na página de destino, clique nos órgãos/tecidos de interesse a seção rotulada de Estudos Selecionados. Selecione o estudo particular do interesse, a seguir aperte a pergunta pela tecla do gene.
2. Na seção rotulada Select Genomic Profiles, selecione entre as três opções: Mutações, alterações putativas de números de cópia do GISTIC,ou expressão de mRNA. Selecione ainda mais os dados correspondentes do menu de entrega para o conjunto de pacientes/casos selecionados.
3. Digite o símbolo do gene alvo (s) na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão de consulta de envio.
4. Clique na aba Network no topo da página para recuperar a rede de genes desejada.
   NOTA: A rede de sinalização é codificada por cores. Os genes introduzidos são indicados por nós de sementes com uma borda grossa. Cada gene é representado por um círculo vermelho, e a intensidade da cor do círculo vermelho reflete sua freqüência da mutação. Os genes são conectados por linhas de cores diferentes. Linhas marrons significam "In Same Component", indicando o envolvimento no mesmo componente biológico. Linhas azuis significam "Reage com", indicando reações gênicas. Linhas verdes significam "Mudança de Estado", sugerindo que um gene pode causar uma mudança de estado de outro gene.
5. Clique na aba Arquivo na parte superior da imagem para escolher Save as Image (PNG) para download de imagem de rede.

6. Dissecação de Drosophila com genótipos desejados e manchas DAPI

NOTA: Recolher a Drosophila feminino com os genótipos desejados, em seguida, dissecar os ovários de mosca para se submeter aos procedimentos de coloração DAPI para imagem.

1. Prepare estoques de mosca tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w*; UAS-mam.A; e w[1118] para criar moscas com NICD-superexpressão (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+e NICD e mam-superexpressão(tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; Capacidade UAS-NICD-GFP/+.
2. Aplique a técnica de segmentação de expressão gênica temporal e regional (TARGET) para controlar a expressão gênica espaçotemporal^23. Levante as moscas a 18 °C até a idade adulta, em seguida, mude para 29 °C para 48 h com levedura antes da dissecação.
   NOTA: tj-Gal4 só pode conduzir a expressão uas temperaturas mais elevadas, quando a inibição por Gal80ts é aliviado. A adição de levedura antes da dissecação amplia os ovários para a colheita.
3. Coloque 3 mL de sisina 1x fosfato -buffered (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄) em um prato de coleta de embriões. Use um bloco de CO₂ para anestesiar as moscas.
4. Escolha uma mosca fêmea, em seguida, pegue cuidadosamente o tórax inferior da mosca usando um par de fórceps dissecando e submergi-lo na solução PBS 1x em um prato de coleta de embriões. Use um segundo par de fórceps para beliscar o abdômen inferior e puxe suavemente para liberar os órgãos internos.
5. Identifique e desaconda o par de ovários do corpo da mosca. Quebre a bainha muscular localizada na extremidade posterior dos ovários e separe os ovarioles.
   NOTA: Separar os ovarioles e quebrar a bainha muscular é necessário, a fim de alcançar resultados de coloração de maior qualidade.
6. Coloque os ovários em um tubo de centrífuga de 1,5 mL que contém 500 μL de 1x PBS. O tubo deve permanecer no gelo até que todos os ovários sejam coletados.
7. Retire o PBS 1x e coloque 0,5 mL de solução de correção (4% de formaldeído) no tubo. Coloque o tubo no nutator por 10 min.
8. Retire a solução de correção do tubo e descartá-lo em um recipiente de resíduos adequado. Use 1 mL de 1x PBT (1x PBS complementado com 0,4% Triton™ X-100) para lavar os ovários 3x por 15 min.
9. Descarte a lavagem final de PBT e adicione 1 mL de PBTG (albumina de soro bovina de 0,2%, 5% soro de cabra normal em 1x PBT) para evitar a ligação inespecífica.
   NOTA: Esta etapa poderia ser ignorada para a coloração DAPI, mas é essencial para a coloração de anticorpos. A coloração detalhada da imunohistoquímica pode ser encontrada em Jia eoutros^24.
10. Coloque 150 μL de DAPI (10 μg/mL) no tubo por 10 a 15 minutos de noz., Descarte o DAPI e lave os ovários 1x por 10 min usando 1 mL de 1x PBT. Retire o PBT e lave 2x por 10 min usando 1x PBS.
11. Remova o excesso de PBS até que aproximadamente 300 μL de PBS permaneça no tubo com os ovários. Pipet os ovários para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta 200 μL, a fim de libertar as câmaras de ovos.
12. Gire delicadamente abaixo do tubo e remova com cuidado tanta solução de PBS 1x como possível sem remover os ovário. Coloque 120 μL de solução de montagem (1 g de gallate n-propyl, 5 ml de 10X PBS, 40 ml de glicerol e 5 ml de dH₂O) no tubo.
    NOTA: A solução de montagem é pegajosa, por isso é difícil transferir exatamente 120 μL de solução de montagem em um tubo. Para aliviar este problema, uma ponta pipette de 1.000 μL pode ser usada para adicionar três gotas de solução de montagem no tubo.
13. Retire aproximadamente 0,33 mm de uma ponta de pipeta de 200 μL e use a ponta da pipeta recém-cortada para colocar a solução de montagem em um slide de vidro do microscópio.
14. Coloque suavemente o vidro coverslip na solução de montagem e selar as bordas do deslizamento de tampa com esmalte transparente.
    NOTA: Selar as bordas do vidro de tampa é necessário impedir que as câmaras do ovo fluam dentro da solução da montagem ao tomar imagens confocal.
15. Adquirir imagens com microscópio confocal usando as seguintes configurações: lente objetiva = ampliação de 10x; abertura numérica = 0,8; Comprimento de onda de emissão da DAPI = 410-513 nm.

Resultados

Utilizando o procedimento mencionado na etapa 1 utilizando o portal PRECOG, foram obtidos os escores Z de NOTCH2, NOTCH3e MAML1 em câncer de ovário (1,3, 2,32, 1,62, respectivamente). Os valores negativos de Z\u2012score indicam a sobrevivência global pobre dos pacientes com níveis elevados da expressão dos três genes. Usando a formatação condicional do software de planilha, os valores z\u2012score são mostrados em um gráfico de barra colorido na Figura

Discussão

Como existem inúmeras abordagens e métodos para a utilização de bioinformática, existem inúmeros bancos de dados disponíveis on-line para o público em geral. Uma abundância de informações pode ser extraída de cada um desses bancos de dados, mas algumas são mais adequadas para fins específicos, como avaliar a sobrevida do paciente com base em certas entradas. Análises sistemáticas de dados recuperados de diferentes bancos de dados individuais podem produzir resultados científicos importantes de forma conv...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4	ThermoFisher	FLBP6651	Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum	Gibco	16210064	Serum
Embryo dish	Electron Microscopy Sciences	70543-45	Dissection Dish
Nutating mixers	Fisherbrand	88861041	Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B	Dr. Wu-Min Deng at Florida State University	N/A	Fly stock
w*; UAS-mam.A	Bloomington Drosophila Stock Center	#27743	Fly stock
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	#5905	Fly stock
The PRECOG portal	Stanford University	precog.stanford.edu	Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB	Cancer Science Institute of Singapore	csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html	Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal	Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)	medical–genome.kribb.re.kr/GENT	Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)	Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research	portals.broadinstitute.org/ccle	Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)	cioportal.org	Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope	Carl Zeiss	ID #M 210491	Examination and image collection of fluorescently labeled specimens