Células progenitoras coronárias e biomarcadores solúveis no prognóstico cardiovascular após angioplastia coronária

Resumo

O desenvolvimento de grandes eventos cardiovasculares adversos, que afetam o prognóstico cardiovascular após a angioplastia coronariana, são influenciados pela extensão dos danos coronários e reparo vascular. O uso de novos biomarcadores celulares coronários e solúveis, reativos a danos vasculares e reparos, são úteis para prever o desenvolvimento de MACEs e prognósticos.

Resumo

Os principais eventos cardiovasculares adversos (MACEs) impactam negativamente o prognóstico cardiovascular de pacientes submetidos à angioplastia coronariana devido a lesão isquêmica coronariana. A extensão dos danos coronários e os mecanismos de reparação vascular são fatores que influenciam o desenvolvimento futuro dos MACEs. Características vasculares intrínsecas como as características da placa e a complexidade da artéria coronária têm demonstrado informações prognósticos para MACEs. No entanto, o uso de biomarcadores circulantes intracoronários foi postulado como um método conveniente para a identificação precoce e prognóstico dos MACEs, pois refletem mais de perto mecanismos dinâmicos envolvendo danos coronários e reparos. Determinação de biomarcadores circulantes coronários durante a angioplastia, como o número de subpopulações de células progenitoras mononucleares (MPCs), bem como a concentração de moléculas solúveis refletindo inflamação, adesão celular e reparo, permite avaliação de desenvolvimentos futuros e o prognóstico de MACEs 6 meses após a angioplastia coronária. Este método é destacado por sua natureza translacional e melhor desempenho do que biomarcadores circulantes de sangue periféricos em relação à previsão de MACEs e seu efeito sobre o prognóstico cardiovascular, que pode ser aplicado para estratificação de risco dos pacientes com doença arterial coronariana submetida à angioplastia.

Introdução

A angioplastia coronariana e o stent representam um procedimento de resgate para pacientes com doença arterial coronariana (CAD). No entanto, grandes eventos cardiovasculares adversos (MACEs), incluindo morte cardiovascular, infarto do miocárdio, restenose coronariana e episódios de angina ou insuficiência cardíaca descompensada, podem ocorrer meses após a intervenção coronária, provocando visitas não programadas ao hospital. MacEs são comuns em todo o mundo e sua morbi-mortalidade é alta¹.

A lesão isquêmica coronariana induz a resposta vascular precoce e mecanismos reparativos envolvendo mobilização de MPCs devido à sua capacidade de diferenciação e/ou potencial de angioção-reparative, bem como a produção de moléculas solúveis como moléculas de adesão intercelular (ICAMs), metaloproteinases matrizes (MMPs) e espécies de oxigênio reativa, refletindo adesão celular, remodelação de tecidos e estresse oxidativo. Embora características vasculares intrínsecas como características da placa e complexidade arterial coronariana tenham sido utilizadas para prever MACEs, alguns estudos têm sugerido que biomarcadores relacionados aos mecanismos de lesão e reparo que ocorrem no endotelo coronário poderiam ser muito úteis para a identificação precoce e prognóstico de eventos cardiovasculares em pacientes com CAD submetidos à angioplastia coronariana^2,3,4,5.

O interesse contínuo em entender os mecanismos subjacentes à lesão cad e reparo tem motivado os investigadores a estudar biomarcadores circulantes intracoronários, pois a amostragem coronária reflete mais de perto danos vasculares e reparo^s6. No entanto, a caracterização de biomarcadores coronários em estudos humanos tem sido escassa^7,8,9. Portanto, o objetivo do presente estudo foi descrever um método para determinar a quantidade de MPCs circulantes coronários e moléculas solúveis, refletindo tanto a lesão vascular quanto a reparação, e mostrar se esses biomarcadores estão associados aos MACEs e ao prognóstico clínico dos pacientes cad que foram submetidos à angioplastia coronária. Este método baseia-se no uso de MPCs e moléculas solúveis relacionadas a vasculares e circulantes obtidas por locais de amostragem mais próximos aos danos causados pelo vaso. Também pode ser útil para estudos clínicos para isquemia de membros inferiores, derrame, vasculite, trombose venosa e outras lesões envolvendo lesão vascular e reparo.

Protocolo

Esse protocolo atende às diretrizes institucionais do Comitê de Ética em Pesquisa Humana.

1. Angiografia Coronariana, Ultrassom e Amostragem de Sangue

1. Solicite informações clínicas e demográficas de linha de base antes da intervenção coronária. Coleta os dados do indivíduo: idade, sexo, estado atual de tabagismo, índice de massa corporal (IMC), pressão alta, dislipidemia, diabetes mellitus, medicamentos e a indicação para a angiografia coronariana atual.
2. Realizar angiografia coronariana através do cateterismo cardíaco usando uma abordagem radial. Esse procedimento deve ser realizado um guia de fluoroscopia na sala de hemodinâmica por cardiologistas especialistas.
   NOTA: Identifique embarcações valiosas. Para o presente estudo, os vasos valiosos foram definidos como artérias com seções maiores que 1,5 mm e estenose de lúmen de mais de 50%.
3. Avance o cateter de ultrassom intravascular para a região de interesse e grave imagens. Use o software apropriado para localizar e medir a menor área luminal.
4. Use um cateter coronário para coletar 10 mL de sangue do local mais próximo da placa.
5. Após a alta do paciente, agendar avaliações médicas periódicas para acompanhar os pontos finais do estudo. Se o contato telefônico não for possível ou uma visita médica for adiada por mais de 2 meses, solicite uma pessoa autorizada (previamente projetada) para verificar os pontos finais do estudo.
   NOTA: Considere qualquer um dos seguintes MACE: 1) morte cardiovascular, 2) novo infarto do miocárdio, 3) angina instável que levou a uma consulta médica não programada dentro de 24 h, 4) restenose stent como demonstrado pela angiografia coronariana, 5) episódios de descompensados insuficiência cardíaca exigindo atenção clínica.

2. Determinação dos MPCs circulantes (Figura 2)

1. Processe o sangue dentro de 1h da coleta. Transfira 6 mL do sangue coletado para um tubo cônico de 15 mL e dilua 1:1 (v/v) com soro fisiológico 1x fosfato (PBS), pH = 7,4.
2. Adicione 2 mL de média gradiente de densidade a três tubos de ensaio. Transfira cuidadosamente três alíquotas de volume igual de sangue diluído em cada tubo de ensaio contendo o meio gradiente de densidade.
   NOTA: O volume total de gradiente de densidade médio e sangue diluído não deve exceder três quartos da capacidade máxima do tubo de ensaio.
3. Centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 30 min. Transfira a banda na interface entre as camadas para um novo tubo. Adicione 2 mL de PBS e centrífuga sem 1.800 x g,4 °C para 6 min. A pelota conterá os MPCs.
4. Lave a pelota várias vezes. Aspirar a solução anterior e suspender suavemente a pelota celular em PBS fresco. Para as gestões subsequentes, centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 2 min. Repita o processo 6x.
5. Resuspender a pelota de celular em 1 mL de PBS. Misture 20 μL da suspensão celular com 0,4% azul trypan, diluído 1:1 (v/v). Aplique uma gota em um hemocímetro e conte as células não manchadas um microscópio leve.
6. Prossiga para a determinação dos MPCs. Rotular tubos de citometria de fluxo de 5 mL e aliquot out 1 x 10⁶ células por tubo. Prepare os anticorpos de controle correspondentes com fósforo de isotipo. Centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 6 min e descartar o supernatante.
7. Adicione o anticorpo primário diluído em 100 μL de uma solução de incubação de anticorpos composta por 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) e 0,05% de albumina de soro bovino (BSA). Resuspender por 10 s e incubar por 20 min a 4 °C, protegido pela luz. O protocolo pode ser pausado nesta etapa, fixando os linfócitos em 4% paraformaldeídos na PBS e armazenando amostras até 24 h a 4°C.
   NOTA: As concentrações finais dos anticorpos primários utilizados no protocolo atual foram CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 2 min e descartar o supernatante. Resuspender em 500 μL de 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM EDTA.
9. Realizar análise de citometria de fluxo. Use anticorpos de controle com fósforo de isotipo para configurar a coloração de fundo. Em seguida, selecione linfócitos espalhados na trama fsc/SSC, tentando excluir granulocitos residuais, detritos celulares e outras partículas, que geralmente estão localizadas na parte inferior, deixada distribuída na trama. Tal distribuição é considerada 100%.
10. Use um portão contendo um alto número de células com imunofenótipo comum CD45⁺ e CD34⁺. Para imunofenótipos duplos positivos, use um portão de identificação anterior de CD45^+,CD34⁺, com a adição de KDR (VEGFR-2)^+,CD133⁺, ou CD184⁺. Identifique as subpopulações do MPC por seus marcadores específicos de superfície celular. Reporte como a porcentagem de eventos fechados.
11. Identifique as principais subpopulações de MPCs. No presente estudo os principais imunofenótipos foram CD45⁺CD34⁺CD133^+,CD45⁺CD34⁺CD184^+,CD45⁺CD34⁺CD133⁺C Dd184^+,CD45⁺CD34⁺KDR⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺, e CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184.
    NOTA: Os marcadores de superfície celular utilizados foram CD45 (linfócitos), CD34 (células endoteliais e/ou vasculares), KDR (VEGFR-2, marcador de membrana de células endoteliais), CD133 (células progenitoras endoteliais) e CD184 (células-tronco hematopoiéticas e células-tronco endoteliálas).

3. Determinação de Biomarcadores Solúveis de Plasma

1. Use um ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA) para determinar a concentração de SICAM-1 e MMP-9 (Figura 3,linha superior).
   1. Centrífuga as amostras de sangue a 3.000 x g,temperatura ambiente para 5 min e coletar o plasma.
   2. Rotular os padrões, tubos de amostra e tubos de controle. Equilibre os poços pré-revestidos na placa de ensaio lavando 2x com o tampão de lavagem fornecido no kit ELISA.
   3. Transfira os padrões, amostras e controles para os poços. Vedae e incuba a 37 °C por 90 min.
      NOTA: Não deixe os poços secarem completamente.
   4. Descarte o conteúdo e adicione o anticorpo de detecção de biotina. Vedae e incuba a 37 °C por 60 min.
   5. Descarte o conteúdo e lave 3x. Selar a placa e incubar sequencialmente com solução de trabalho de streptadina seguida de substrato tetrametilbenzidina a 37 °C por 30 min, protegido por luz. Lave 3x entre incubações. Quando a cor se desenvolver, adicione a solução de parada e leia a absorção de densidade óptica em um leitor ELISA microplacado.
2. Use um ensaio imunomagnético multiplexante para determinar a concentração do fator necrose tumoral alfa (TNFα) e interleucina 1 beta (IL-1β) (Figura 3,linha inferior).
   1. Rotular os padrões, tubos de amostra e tubos de controle.
   2. Vórtice os frascos de contas magnéticas por 30 s. Transfira a suspensão da contas para tubos de tamanho adequado e, em seguida, para os poços na placa de ensaio multiplexeto. O vórtice periódico evita a precipitação das contas.
   3. Insira com segurança a lavadora de placas magnéticas portáteis. Espere 2 min para que as contas se acumulem na parte inferior de cada poço e invertam rapidamente tanto a lavadora de placas magnéticas portáteis quanto o conjunto de placas, sobre uma pia ou recipiente de resíduos. Lembre-se de usar a lavadora de placas magnéticas portátil para manter as contas dentro dos poços.
   4. Adicione 150 μL de tampão de lavagem em cada poço e espere 30 s para permitir que as contas se acumulem na parte inferior. Descarte o conteúdo como na etapa 3.2.3. Em seguida, adicione 25 μL de buffer de ensaio universal (fornecido no kit) seguido por 25 μL de padrões, amostras e controles preparados.
   5. Selar a placa e incubar por pelo menos 60 min à temperatura ambiente, protegido pela luz, com constante agitação a 500 rpm. Alternativamente, incuba durante a noite a 4 °C, iluminado, com constante agitação a 500 rpm, se possível.
   6. Lave 2x adicionando 150 μL de tampão de lavagem e espere 30 s. Descarte o conteúdo inserindo a lavadora de placa magnética portátil. Espere 2 min e inverta sobre uma pia ou recipiente de lixo.
   7. Incubasequencialmente com 25 μL de mistura de anticorpos de detecção seguido por 25 μL de solução streptavidin-PE a temperatura ambiente por 30 min, lacrada e protegida pela luz, com tremor constante a 500 rpm. Lave 2x entre incubações, conforme descrito na etapa 3.2.6.
   8. Obtenha as leituras. Adicione 120 μL de tampão de leitura. Selar a placa e incubar 5 min à temperatura ambiente, protegido pela luz, com tremor constante a 500 rpm. Faça a leitura em um leitor de ensaios multiplexing. Ajuste os parâmetros de leitura de acordo com cada anestesia.

Resultados

O sangue coronário, venoso e periférico foram coletados de 52 pacientes submetidos à angiografia coronariana (Figura 1)e apresentaram alta prevalência de hipertensão e dislipidemia. No acompanhamento clínico, 11 (21,1%) MacEs ocorreu 6 meses após angiografia coronariana: morte (n = 1), angina que exige atendimento hospitalar (n = 6), infarto do miocárdio (n = 2) e/ou evidência de insuficiência cardíaca (n = 4).

Discussão

A coleta de sangue da artéria coronária afetada pode ser difícil. Às vezes, a artéria coronária mal é acessível. Neste caso, a amostragem do seio venoso pode ser uma alternativa. Realizamos testes de validação comparando biomarcadores circulantes em artéria coronária versus seio venoso, sem diferenças significativas. No entanto, o desempenho dos biomarcadores circulantes foi validado apenas para amostragem coronária. Portanto, o desempenho dos biomarcadores obtidos a partir do seio venoso continua a ser exp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm