Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Resumo

A maioria das pesquisas que empregam lipossomas como sistemas de modelo de membrana ou portadores de entrega de drogas depende de técnicas de leitura em massa e, portanto, assume intrinsecamente todos os lipossomas do conjunto para ser idêntico. No entanto, novas plataformas experimentais capazes de observar lipossomos no nível de partículaúnica tornaram possível realizar estudos altamente sofisticados e quantitativos sobre interações de membrana proteica ou propriedades de portadores de drogas em lipossomos individuais, evitando assim erros da média do ensemble. Aqui apresentamos um protocolo para preparar, detectar e analisar lipossomos individuais usando um ensaio microscopia à base de fluorescência, facilitando tais medições de partículas únicas. A configuração permite a imagem de lipossomos individuais de forma paralela maciça e é empregada para revelar o tamanho intra-amostral e inhomogeneidades composicionais. Além disso, o protocolo descreve as vantagens de estudar lipossomas no nível único de lipossoma, as limitações do ensaio e as características importantes a serem consideradas ao modificá-lo para estudar outras questões de pesquisa.

Introdução

Os lipossomas são vesículas à base de fosfolípido esféricas que são fortemente utilizadas tanto na pesquisa básica quanto aplicada. Funcionam como sistemas excelentes do modelo da membrana, porque suas propriedades physiochemical podem facilmente ser manipuladas variando os componentes lipídicos que compõem o liposome^1,2. Além disso, os lipossomas constituem o sistema de nanocarrier de entrega de medicamentos mais utilizado, oferecendo farmacocinética melhorada e farmacodinâmica, bem como alta biocompatibilidade³.

Por muitos anos, os lipossomas têm sido estud....

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Protocolo

1. Preparação para Lipossoma

NOTA: Brevemente, a preparação de lipossomas geralmente inclui três etapas cruciais: 1) preparação de filmes lipídicos secos da composição lipídica desejada; 2) reidratação dos lipídios para formação de lipossomas; e 3) controlar o tamanho e a lamellaridade da população de lipossomas.

1. Pesar os lipídios e dissolvê-los em tert-butanol:água (9:1) em frascos de vidro.
   1. Dissolva POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocolina; MW = 760 g/mol) a 50 mM.
   2. Dissolva o colesterol (MW = 387 g/mol) a 25 mM.
   3. Dissolva DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-Atto488; MW = ....

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Resultados

Seguir o protocolo descrito torna possível a imagem de lipossomos únicos de uma forma paralela maciça (Figura 1). A bem-sucedida imobilização superficial dos lipossomas deve ser imediatamente aparente após a adição da solução lipossoma à câmara (passo 3.6 no protocolo), já que as manchas de intensidade limitada de difração devem aparecer na imagem (Figura 1B e Figura 1.......

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Discussão

É importante notar que, embora descrevamos em detalhes como o ensaio único dos lipossomas pode ser usado para estudar a inhomogeneidade composicional entre os lipossomas individuais, a plataforma é muito versátil. Como mostrado anteriormente e discutido na introdução, o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar aspectos da fusão membrana-membrana, interações proteína-membrana ou caracterização lipossômica do portador de drogas. Para quaisquer questões científicas que estão sendo abordadas, o pod.......

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65 °C
Heating plate with Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65 °C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ