Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

Resumo

A resistência terapêutica muitas vezes se desenvolve em pacientes com câncer de próstata avançado e, em alguns casos, o câncer progride para um subtipo letal chamado câncer de próstata neuroendócrino. Avaliar as pequenas alterações moleculares mediadas por RNA não codificadoras que facilitam essa transição permitiria uma melhor estratificação e identificação de mecanismos causais que levam ao desenvolvimento de câncer de próstata neuroendócrino.

Resumo

A blasmaioria do receptor andrógeno (AR) sinalização por privação de andrógeno é o objetivo da primeira linha de terapia para o câncer de próstata que inicialmente resulta em regressão do câncer. No entanto, em um número significativo de casos, a doença progride para o câncer de próstata avançado e resistente à castração (CRPC), que tem opções terapêuticas limitadas e muitas vezes é agressivo. A metástase distante é observada na maior parte nesta fase da doença agressiva. O CRPC é tratado por uma segunda geração de inibidores da via ar que melhoram a sobrevida inicialmente, seguida pelo surgimento da resistência terapêutica. O câncer de próstata neuroendócrino (NEPC) é uma variante rara do câncer de próstata (PCa) que muitas vezes se desenvolve como resultado da resistência à terapia através de um processo de transdiferenciação conhecido como diferenciação neuroendócrina (NED), em que as células pca passam por um interruptor de linhagem de adenocarcinomas e mostrar maior expressão de marcadores de linhagem neuroendócrina (NE). Além das alterações genômicas que impulsionam a progressão e a transdiferenciação para o NEPC, fatores epigenéticos e pistas microambientais são considerados atores essenciais na progressão da doença. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para identificar os drivers epigenéticos (ou seja, pequenos RNAs não codificadores) que estão associados a PCa avançados. Usando microRNAs purificadas de tecidos metastáticos embutidos em parafina (FFPE) fortificados formais e vesículas extracelulares (EVs) derivadas de soro correspondentes, o protocolo descreve como preparar bibliotecas com controle de qualidade adequado para sequenciamento microRNAs dessas fontes de amostra. Isolar o RNA de FFPE e EVs é muitas vezes desafiador porque a maior parte é degradada ou é limitada em quantidade. Este protocolo irá elaborar sobre diferentes métodos para otimizar as entradas de RNA e bibliotecas de CDNA para produzir leituras mais específicas e dados de alta qualidade após o sequenciamento.

Introdução

O câncer de próstata é impulsionado por andrógenos agindo via sinalização AR. Portanto, visando a via AR é o tratamento de esteio para a doença¹. No entanto, a resistência muitas vezes se segue como resultado de terapias direcionadas e a doença progride para um CRPC metastático avançado^2. Crpc é tratado pela segunda geração de terapia ar que inclui enzalutamida e abiraterona^2,3 que melhora a sobrevivência inicialmente. No entanto, variantes letais como nepc muitas vezes surgem em 25-30% dos casos tratados CRPC que têm opções de tratamento limitada, levando ao aumento da mortalidade³. Nepc surge através de um processo de transdiferenciação reversível conhecido como NED, onde as células PCa passam por um interruptor de linhagem de adenocarcinomas e mostram diminuição da expressão de AR e maior expressão de marcadores de linhagem NE incluindo enolase 2 (ENO2), cromograna na a (CHGA) e sinaptophysin (SYP)⁴. Dado que essas variantes de resistência surgem como resultado de intervenções terapêuticas, é essencial decifrar caminhos que levam à geração desta forma mortal e difícil de tratar de PCa.

A genômica do NEPC foi recentemente decifrada em um estudo exaustivo feito por Beltran et al. em que foram analisadas 5 alterações de número de cópia, mutações, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e metilação de DNA de tecidos metastáticos derivados do^paciente. Apesar do avanço significativo na compreensão da genômica desta forma agressiva de PCa, pouco se sabe sobre os fatores epigenéticos, incluindo os pequenos RNAs não codificadores (microRNAs) que estão envolvidos na transição do CRPC-adenocarcinoma para o NEPC. MicroRNAs (miRNAs) são 22 bp longos, RNAs duplo-encalhados que agem primeiramente suprimindo a expressão do gene borne-transcriptionally por interações seqüência-específicas com as regiões 3'-untranslated (UTRs) de alvos cognate do mRNA^6. Vários oncomiRs e supressores tumorais já foram identificados, e seu papel na regulação do início da doença e metástase tem sido bem estudado em diferentes cânceres^6,7. Esses pequenos RNAs não codificadores muitas vezes servem como alvos muito importantes no controle da mortalidade por doenças^6,8,9. Pesquisas mais recentes têm se concentrado na compreensão dos efeitos paracrinos dos miRNAs na metástase do câncer através de seu transporte em EVs, como exossomos, que fluem na corrente sanguínea e permitem que as células tumorais enviem esses mensageiros secundários para locais metastáticos em um ambiente livre de nuclease^10,11,12. EVs transportar miRNAs das células tumorais para transferir os efeitos transformadores das células hospedeiras¹². A identificação de EVs como mensageiros secundários de células tumorais pode, portanto, ser útil na detecção não invasiva da gravidade da doença.

O miR-1246 é altamente upregulated em EVs de PCa agressivo, e indica a gravidade da doença¹³. Estes miRNAs EV-associados servem não somente como biomarkers noninvasive da doença, mas jogam igualmente papéis funcional importantes em conduzir o tumorigenesis. Assim, é essencial compreender o significado do repertório miRNA que está associado a formas resistentes de PCa para permitir uma melhor identificação de biomarcadores não invasivos, bem como o seu significado funcional.

O advento do sequenciamento da próxima geração ofereceu a plataforma mais abrangente para estudar os detalhes da paisagem tumoral envolvendo alterações no genoma, como mutações, deslocalizações cromossômicas, cromotrípise e metilação, que contribuem significativamente para a forma e a natureza do câncer^14,15,16. Da mesma forma, é também uma ferramenta essencial para entender as vastas mudanças epigenômicas que ocorrem em uma célula tumoral e que muitas vezes são jogadores importantes na gravidade da doença¹⁷. Com o objetivo de entender o repertório de miRNA associado à geração de NEPC, o sequenciamento de RNA pequeno foi realizado nos tecidos metastáticos de CRPC da FFPE e em seus EVs correspondentes derivados do soro. RNA derivado de qualquer uma dessas duas fontes de amostra é (1) baixo rendimento e (2) de má qualidade devido à degradação que muitas vezes acontece devido à fixação formalina e isolamento EV. Além disso, gerar bibliotecas de CDNA é um passo crítico, mas complicado, de uma corrida de sequenciamento. Assim, os métodos para isolar esses RNAs e usá-los para gerar bibliotecas para sequenciamento de RNA pequeno exigem otimização para gerar dados precisos e confiáveis.

Existem vários métodos para perfilar a expressão de miRNA em diferentes amostras, incluindo RT-PCR, microarrays e hibridização in situ (ISH). Um protocolo usando o RNA derivado do tecido ffpe para avaliar a expressão de miRNA por RT-PCR e ISH foi recentemente publicado¹⁸. Tecnologias mais recentes oferecem plataformas mais exaustivas e abrangentes para o perfil da expressão de miRNA em uma amostra. NanoString nCounter oferece uma plataforma de detecção de miRNA sensível^19,mas a detecção é muitas vezes limitada pelo número de miRNAs que estão disponíveis na matriz (~ 2.000). Em tal cenário, uma plataforma mais sensível e exaustiva, como o sequenciamento da próxima geração, oferece uma profundidade muito maior de identificação de miRNA e perfis simultâneos em diferentes amostras^20. O método tem sido usado para determinar as assinaturas miRNA na urina ou plasma de pacientes pcas^21,22,23. No artigo atual, um protocolo é apresentado para usar uma plataforma de sequenciamento de próxima geração para estudar perfis de miRNA associados a CRPC agressivos usando tecidos FFPE e RNAs EV derivados do soro.

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes éticas da Regra Comum dos EUA e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Pesquisa Humana.

1. Microdissese

Nota: Os tecidos metastáticos de CRPC do FFPE com características do adenocarcinoma (CRPC-Adeno) ou a diferenciação do NE (CRPC-NE) foram obtidos da rede do biorepositório do cancro da próstata (PCBN). Seções pca de dez mícrons em lâminas de vidro foram preparadas para microdissecção manual, como discutido anteriormente¹⁸. Para resumir brevemente:

1. Deparafina as seções de tecido, mergulhando os slides em xileno (2x, 10 min cada). Em seguida, reidrate as seções incubando os slides por 5 min cada em etanol classificado (100%, 95%, 90%, 80%, e 70%), seguido por uma lavagem de água destilada e coloração com hematoxilina (30 s embeber).
2. Após a coloração de hematoxilina, lave as seções de tecido com água. Em seguida, desidratar as seções de tecido, colocando-os em etanol classificado (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 min cada) seguido de xileno (5 min).
3. Analise os slides correspondentes de hematoxilina e eosina (H&E) para identificar as áreas tumorais (ou seja, adenocarcinomas ou NED) e marque essas áreas tumorais e áreas adjacentes normais com o auxílio de um patologista certificado pela diretoria. Usando esses slides de H&E como roteiros, marque os tecidos manchados de hematoxilina obtidos na etapa acima para distinguir entre o tumor e as áreas normais.
4. Dissecar o tecido marcado deslizar cuidadosamente o microscópio usando uma lâmina de bisturi.
5. Colete o tecido dissecado de áreas normais e cancerosas em tubos separados usando pontas eletrostáticas carregadas da pipeta do carregamento do gel. A ponta carregada atrai o tecido dissecado e permite a recuperação máxima do tecido após a dissecção. Uma vez que o tecido fura à ponta carregada, corte a ponta em um tubo vazio da coleção de 2 mL.

2. Isolando EVs derivados do Soro

Nota: Amostras congeladas de soro de pacientes coletadas de pacientes com PCC metastático com características de adenocarcinoma (CRPC-adeno) ou diferenciação de ECa (CRPC-NE) foram obtidas a partir de PCBN usando um protocolo IRB aprovado e armazenadas a -80 °C antes de seu uso. Amostras de soro foram coletadas do mesmo conjunto de pacientes usados para tecidos microdissecizados para permitir a comparação entre os tecidos correspondentes e os EVs derivados do soro. Um reagente de isolamento ev de soro comercialmente disponível foi usado para coletar os EVs.

1. Descongele amostras congeladas de soro de pacientes a 4 °C.
2. Use 110 μL de amostra de soro descongelada e gire a 2.000 x g por 30 min.
3. Colete o supernatant para o isolamento EV/exosso subsequente e descarte a pelota de detritos. Adicione 30 μL de reagente de isolamento exosso do soro ao supernatant e incubar a 4 °C por 30 min.
4. Gire a 10.000 x g por 10 min. Colete o soro esgotado pelo EV cuidadosamente sem perturbar a pelota em um tubo separado de 1,5 mL e guarde a -80 °C para análise futura, se necessário.
5. Resuspenda a pelota ev em 70 μL de soline tampão de fosfato (PBS) preparado em água livre de nuclease. Mantenha um alibamento para o sistema de análises de rastreamento de partículas para avaliar a qualidade e o número de partículas. Guarde o resto da amostra a -80 °C até uma análise mais aprofundada.

3. Isolamento de RNA de tecidos da próstata microdissecados e EVs

Nota: O RNA total foi isolado dos tecidos microdissected e dos EVs purificados usando um jogo comercialmente disponível(tabela dos materiais)por instruções do fabricante com algumas modificações. As seguintes seções descrevem brevemente estes procedimentos com especial ênfase nas etapas importantes:

1. Isolar o RNA dos tecidos microdissecados.
   1. Resuspender o tecido ffpe microdissected em 150 μL de proteinase K buffer. Misture vórtice e pipeta para fora o tecido residual da ponta. Gire a 11.000 x g por 1 min.
   2. Adicione 10 μL de proteinase K à pelota. Espere por 2 min até que a pelota fique branca. Pipette para cima e para baixo algumas vezes.
   3. Incubar a 56 °C por 16 min. Vortex a cada 3 min.
   4. Retire as amostras e deixe o bloco de calor chegar a 80 °C. Incubar as amostras no bloco por 16 min. Vortex a cada 3 min.
   5. Incubar no gelo por 3 min.
   6. Gire a 20.000 x g por 15 min. Transfira o supernatant para um novo tubo de 2 mL.
   7. Adicione 16 μL de buffer de reforço dnase seguido por 10 μL de DNase I. Mix invertendo o tubo suavemente e incubar à temperatura ambiente (RT) por 15 min.
   8. Adicione 320 μL de célula vermelha do sangue (RBC) lise tampão. Misture invertendo o tubo e, em seguida, adicione 1.120 μL de 100% de etanol. Transferência imediata em colunas de rotação armazenadas a 4 °C. Gire a 8.000 x g para 30 s.
   9. Lave as colunas 2x com tampão de lavagem e gire as colunas em 20.000 x g por 5 min para remover o amortecedor de lavagem residual.
   10. Permita que a coluna de rotação seque por 2 a 3 min, depois lute com 19 μL de água livre de RNase. Desate o RNA purificado em um espectrômetro e normalize a amostra para 40 ng/μL.
2. Isolamento de RNA de EVs derivados do soro.
   1. Isolar o RNA exossômico usando um kit. Adicione 75 μL de lume a d.c. A e 9,3 μL de lume de lyse B a 50 μL da suspensão EV purificada.
      Nota: Continue misturando a amostra invertendo o tubo por cerca de 10 min para permitir a lyse completa dos EVs.
   2. Adicione 130 μL de 100% de etanol e misture imediatamente invertendo a amostra. Transfira em uma coluna de rotação e, em seguida, gire em 3.300 x g por 1 min.
   3. Lave a coluna 2x com o tampão de lavagem. Gire a coluna em 1.300 x g para 3 min para remover completamente o tampão de lavagem.
   4. Permita que a coluna seque por 2 min. Adicione 18 μL de buffer de elução para a coluna e deixe descansar por 2 min. Spin em 400 x g por 1 min seguido por uma segunda rodada de 5.800 x g para 3 min.
   5. Repita a etapa 3.2.4 com o buffer eluted incluído no jogo para aumentar o rendimento do RNA da amostra.
   6. Quantifique a amostra em um espectrômetro e normalize-a para 40 ng/μL.

4. Preparação da biblioteca para o sequenciamento pequeno do RNA

Nota: Um pequeno kit de preparação da biblioteca de RNA(Tabela de Materiais)foi usado para gerar bibliotecas de CDNA a partir das amostras isoladas de RNA. As etapas para gerar bibliotecas, purificar e verificá-las de qualidade antes de serem executadas em um sequenciador são cruciais para qualquer protocolo de sequenciamento, pois eventualmente determinam a qualidade dos dados de saída de uma corrida. Portanto, prossiga cuidadosamente a cada passo. As diretrizes do fabricante sugerem o uso de um mínimo de 50 ng de RNA. Dada a má qualidade e as baixas quantidades de RNA total geralmente obtidas a partir dessas duas fontes de amostra, este protocolo é otimizado para concentrações de RNA tão baixas quanto 100 ng. O protocolo abaixo é para uma amostra de uma biblioteca.

1. Gerar cDNA adaptador-ligado.
   1. Use 5 μL de uma amostra de RNA normalizada (40 ng/μL). Adicione 1 μL de adaptador de 3'. Pré-aqueça o pedalador térmico a 70 °C antes de incubar as amostras. Incubada para 2 min. Imediatamente transferir as amostras no gelo antes de passar para o próximo passo.
   2. Em um tubo separado, misture 2 μL de buffer de ligadura, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de T4 RNA Ligase 2, um mutante de exclusão. Misture por pipetting cima e para baixo e adicione 4 μL desta mistura para o tubo com o adaptador RNA/3'.
   3. Transfira para o pedaleiro térmico que foi pré-aquecido a 28 °C e incubar por 1 h.
   4. Adicione 1 μL de solução de parada, mantendo as amostras no bloco térmico. Incubar a 28 °C por mais 15 min.
   5. Retire os tubos e mantenha o gelo imediatamente após esta etapa.
   6. Em um tubo separado, adicione 1 μL de adaptador de 5'.
   7. Transfira para um pedalador térmico que foi pré-aquecido a 70 °C e incubar por 2 min.
   8. Coloque imediatamente o tubo no gelo para evitar a re-anulação dos adaptadores.
   9. Adicione 1 μL de 10 mM ATP ao tubo de adaptador 5' desnaturado. Misture por pipetting e adicione 1 μL de Ligase RNA T4 à mistura. Misture por pipetting e adicione 3 μL desta mistura para o tubo contendo o 3' adaptador-ligado RNA. Transferência no cycler térmico que foi pré-aquecido a 28 °C e incubar por 1 h.
   10. Transferir imediatamente para o gelo e prosseguir com as amostras ou armazenar a -20 °C para uso futuro.
   11. Para realizar RT-PCR, use 6 μL de cada RNA adaptador e adicione 1 μL de primer RNA RT a ele. Transfira para o pedaleiro térmico que foi pré-aquecido a 70 °C. Incubada por 2 min.
   12. Em um tubo separado, misture 2 μL de buffer de cadeia 5x, 0,5 μL de 12,5 mM dNTPs, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa. Adicione 5,5 μL desta mistura ao RNA adaptador-ligado e transfira para o cycler térmico que foi pré-aquecido a 50°C. Incubada por 1 h.
   13. Transfira o cDNA adaptador imediatamente para o gelo.
   14. Em um tubo separado, misture 25 μL de mix de PCR, 2 μL de primer RNA PCR, 2 μL do índice primer RNA PCR e 8,5 μL de água livre de RNase. Adicione 37,5 μL desta mistura a 12,5 μL de cDNA adaptador.ligado. Transfira para o pedalador térmico que foi pré-aquecido para 98 °C. Programe o cycler térmico como sugerido no protocolo do fabricante com o número do ciclo modificado a 15 em vez de 11.
       Nota: As sequências de todas as cartilhas utilizadas estão listadas na Tabela de Materiais.
   15. Mantenha as amostras a 4 °C após a conclusão. Prossiga com eles ou guarde a -80 °C para uso futuro.
2. Purificar e executar o controle de qualidade para o cDNA ligado.
   Nota: O cDNA amplificado foi purificado por gel seguindo o protocolo do fabricante, exceto por algumas modificações para melhorar a qualidade e o rendimento das amostras de cDNA purificadas, conforme explicado abaixo.
   1. Use 6% tbe poliacrilamida géis para purificar o cDNA amplificado. Diluir a escada de alta resolução (HRL) e escada de RNA personalizada (CRL) com volumes iguais de dinamite de carregamento de DNA.
   2. Adicione 10 μL de dinamite de carregamento de DNA para cada amostra de CDNA. Executar 30 μL de cada amostra em duas pistas separadas adjacentes entre si com CRL e HRL no espaço intermediário entre as duas amostras diferentes.
   3. Executar o gel em 1x Tampão TBE em 145 V por aproximadamente 30-40 min.
      Nota: Mantenha o controle da frente azul inferior do tinuoso de carregamento. Pare a eletroforese quando se aproxima do fundo do gel.
   4. Transfira o gel em 1x tampão TBE com Ethidium Bromide (EtBr) em 0,5 μg EtBr/1 mL 1x TBE.
      CUIDADO: EtBr é um agente cancerígeno conhecido e cada passo a partir daqui até que a excisão do gel deve ser realizada com extrema cautela.
   5. Visualize o gel em um transilluminator e corte o gel precisamente entre o marcador de 145 bp e 160 bp.
      Nota: Os dimers adaptador correr muito perto do marcador de 145 bp. Portanto, corte o gel ligeiramente acima do marcador de 145 bp para evitar a contaminação com dimer adaptador.
   6. Transfira o gel para tubos de quebra de DNA mantidos em tubos de coleta de 2 mL. Gire a 20.000 x g por 2 min. Adicione 300 μL de água livre de RNase e permita que ele gire suavemente em um roqueiro durante a noite na RT.
   7. Para realizar a precipitação de DNA, no dia seguinte transferir o conteúdo do tubo para tubos de filtro de 5 μm. Gire a 600 x g por 10 s.
      Nota: Não deixe os tubos girar em mais de 10 s como o gel passa através do filtro.
   8. Adicione 2 μL de glicogênio, 30 μL de 3 M NaOAc, 2 μL de tinta de pelota de 0,1x e 975 μL de 100% de etanol ao DNA eluted. Gire a 17.000 x g a 4°C por 20 min.
   9. Descarte o supernatant e adicione 75% de etanol para lavar a pelota. Gire a 17.000 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o supernatant e incubar os tubos a 37 °C para evaporar completamente o etanol.
   10. Resuspenda a pelota com 12 μL de 10 mM Tris-HCl pH 8.5.
   11. Realize uma verificação de qualidade da biblioteca diluindo o cDNA purificado por 10x (1:10) e usando 1 μL de cDNA diluído para ser executado em um bio-analisador.
   12. Certifique-se de que o tamanho do produto cDNA corresponde à gama de RNA pequeno (136-160 bp) no eletrocardiograma. Calcule a molaridade total para cada amostra. Normalize cada amostra para 2 nM usando Tris-HCl pH 8.5.
3. Desnaturar e sequenciar o CDNA purificado.
   1. Agrupar as bibliotecas, misturando volumes iguais de cada amostra de 2 nM em um único tubo PCR de 200 μL. Adicione 10 μL de 2 N NaOH preparado na na ré para 10 μL de biblioteca agrupada.
   2. Misture imediatamente por vórtice, e girar em 280 x g para 1 min. Incubate em RT para 5 min.
   3. Adicione 10 μL de 200 mM Tris-HCl pH 7 a 20 μL da biblioteca desnaturada. Misture por vórtice e girar a 280 x g por 1 min.
   4. Adicione 970 μL de buffer de hibridização pré-refrigerado para a biblioteca e misture bem vórtice. A biblioteca está em uma concentração de 20 pM. Mantenha o gelo até que finalmente seja diluído.
      Nota: A diluição final é feita logo antes de correr em seqüenciador.
   5. Adicione 117 μL da biblioteca desnaturada a 1.183 μL do amortecedor prechilled da hibridação. Misture invertendo o tubo e a centrífuga do pulso. A concentração final da biblioteca é agora de 1,8 pM.
   6. Adicione 1,3 μL de PhiX aos 1,3 mL da biblioteca final. Para iniciar uma execução em um sequenciador, siga as etapas na tela na interface do software, analise os parâmetros de execução, incluindo o tipo de leitura (leitura única), leia o comprimento (número de ciclos para cada leitura), identificação da biblioteca e selecione Iniciar.

5. Análise de dados

1. No final da execução sequenciador, obtenha os dados de sequenciamento resultantes como arquivos fastQ. Use o software apropriado para analisar os dados de sequenciamento resultantes.
2. Abra o aplicativo de kit de ferramentas fastQ e pressione o botão Launch.
3. Selecione os arquivos da lista de amostras no software e selecione onde os dados serão salvos.
4. Adicione um nome de corda que se aplica a cada seqüência aparada. Mantenha a dedilhar a 0,9. Insumo a seqüência adaptador para aparar como "TGGAATTCTCGTGCCAAGG" a partir do final de 3' de cada amostra sequenciada. Expanda a guia de filtragem de leitura e selecione um comprimento mínimo de leitura de "5". Selecione a caixa de reconhecimento e pressione o botão Continue para começar a aparar. Os arquivos aparados serão salvos na pasta do projeto no final da análise.
5. Abra o pequeno aplicativo RNA v.1.0 no software e pressione o botão Launch.
6. Selecione o projeto onde os arquivos serão salvos e enviados após a análise.
7. Selecione a função de miRs e miRs diferenciais no aplicativo. Segregar os grupos como "Controle" e "Teste" para análise diferencial e adicione os arquivos aparados a serem analisados em seus respectivos grupos.
8. Selecione o botão de lançamento para iniciar a análise. Após as análises, baixe os arquivos resultantes.

Resultados

A biblioteca foi preparada após o isolamento do RNA e uma verificação de qualidade foi realizada. Purificação de gel para a biblioteca cDNA amplificada preparada a partir de RNA isolada de tecidos microdissecizados e EVs derivados do soro é mostrada na Figura 1 e Figura 2. O tamanho do produto para miRNAs adaptador-ligados correspondeu a aproximadamente 136−160 bp para cada amostra. A Figura 1A-B é marcada ...

Discussão

Neste artigo, descrevemos um protocolo para isolar o RNA dos tecidos da FFPE e EVs derivados do soro usando kits otimizados para aumentar o rendimento e a qualidade dos RNAs isolados. Além disso, os RNAs purificados foram usados para gerar bibliotecas de CDNA para sequenciamento de RNA pequeno. Ambas as etapas listadas são essenciais para determinar a qualidade e a profundidade das leituras de sequenciamento que são o resultado final da corrida²⁴. Portanto, otimizar essas etapas cruciais é fun...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M NaOAc pH 5.5	USB Corp.	75897 100 mL
5 µm filter tubes	IST Engineering Inc.	5388-50
6% TBE polyacrylamide gels	Novex	EC6265BOX
BaseSpace	Illumina		Analysis software
Bio-analyzer	Agilent
DNA loading dye	Novex	LC6678
Eppendorf Thermostat plus	Eppendorf 1.5 mL
EtBr	Pierce	17898
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco	111000200
Exosomal RNA isolation kit	Norgen	58000
Gel breaking tubes	IST Engineering Inc.	3388-100
Glycogen molecular biology grade	Thermo Scientifc	R0561
Hematoxylin Select	Stat lab	SL401
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676	accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit	Qiagen	217504
Nanodrop	Thermo Scientifc	Nano Drop 1000
Nanosight NTA	Malvern	LM14
NextSeq 500 Sequencer	Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)	Illumina	FC-404-2001
Pellet paint	Millipore	70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase	Invitogen	18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant	Lucigen	LR2D11310K
TBE Running buffer (5x)	Novex	LC6675
Thermal cycler	MJ Research	PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)	Invitrogen	4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012
Xylene	Fisher Scientific	X3P- 1GAL
RNA 3' Primer			GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer			TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo			GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer			GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer			AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer			CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
-	-	-	6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1			CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2			ACATCG
RNA PCR Index Primer 3			GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4			TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5			CACTGT
RNA PCR Index Primer 6			ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7			GATCTG
RNA PCR Index Primer 8			TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9			CTGATC
RNA PCR Index Primer 10			AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11			GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12			TACAAG