In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de células epiteliais de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana para determinar sua heterogeneidade e propriedades funcionais para possível aplicação em modelos clínicos e fisiopatológicos.

Resumo

Vários protocolos foram relatados na literatura para o isolamento e a cultura das células epiteliais amnióticas humanas (HAEC). No entanto, estes assumem que o epitélio amniótico é uma camada homogênea. O amnion humano pode ser dividido em três regiões anatômicas: refletida, placentária e umbilical. Cada região tem diferentes papéis fisiológicos, como em condições patológicas. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecar o tecido amnion humano em três seções e mantê-lo in vitro. Na cultura, as pilhas derivadas do amnion refletido indicaram uma morfologia cuboidal, quando as pilhas das regiões placental e umbilicais eram escamosas. No entanto, todas as células obtidas têm um fenótipo epiteliais, demonstrado pela imunodetecção de E-cadherin. Assim, como as regiões placentárias e refletidas in situ diferem em componentes celulares e funções moleculares, pode ser necessário que estudos in vitro considerem essas diferenças, pois podem ter implicações fisiológicas para o uso de HAEC em pesquisa biomédica e a aplicação promissora dessas células na medicina regenerativa.

Introdução

As células amnióticas do epitélio (HAEC) têm origem nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário, por volta de oito dias após a fertilização. Eles surgem de uma população de células epiteliais escamosas do epiblasto que derivam da camada mais interna da membrana amniótica¹. Assim, haec são considerados remanescentes de células pluripotentes do epiblasto que têm o potencial de diferenciar as três camadas germinas do embrião². Na última década, diversos grupos de pesquisa desenvolveram métodos para isolar essas células da membrana amniótica no termo da gestação para caracterizar suas propriedades presuntivas relacionadas à pluripotência em um modelo de cultura in vitro^3,4.

Assim, verificou-se que haec características características características de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC), tais como os antígenos de superfície SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; o núcleo dos fatores de transcrição da pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG; e o marcador de proliferação KI67, sugerindo que eles são auto-renovação^5,6,7. Além disso, essas células têm sido desafiadas usando protocolos de diferenciação para obter células positivas para marcadores específicos de linhagem das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderm)^4,5,8,bem como em modelos animais de doenças humanas. Finalmente, HAEC expressar E-cadherin, que demonstram que eles mantêm uma natureza epitelial muito parecido com o HPSC^5,9.

Além de sua origem embrionária, haec têm outras propriedades intrínsecas que os tornam adequados para diferentes aplicações clínicas, tais como a secreção de moléculas anti-inflamatórias e antibacterianas^10,11, fatores de crescimento e citocina liberação¹², nenhuma formação de teratomas quando eles são transplantados em ratos imunodeficientes em contraste com HPSC², e tolerância imunológica, porque eles expressam HLA-G, que diminui o risco de rejeição após a rejeição transplante¹³.

No entanto, relatos anteriores assumiram que o amniônio humano é uma membrana homogênea, sem considerar que pode ser anatomicamente e fisiologicamente dividida em três regiões: placental (a amniônia que cobre a decidua basalis), umbilical (a parte que envolve o cordão umbilical) e refletida (o resto da membrana não ligada à placenta)¹⁴. Tem sido demonstrado que as regiões placentárias e refletidas da amniônia apresentam diferenças na morfologia, atividade mitocondrial, detecção de espécies reativas de oxigênio^15,expressão miRNA^16,e ativação das vias de sinalização¹⁷. Estes resultados sugerem que o amnion humano está integrado por uma população heterogênea com funcionalidade diferente que deve ser considerada para estudos mais adicionais realizados em modelos in situ ou in vitro. Enquanto outros laboratórios projetaram protocolos para o isolamento da HAEC de toda a membrana, nosso laboratório estabeleceu um protocolo para isolar, cultura e caracterizar células de diferentes regiões anatômicas.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto Nacional de Perinatología, na Cidade do México (Registro número 212250-21041). Todos os procedimentos realizados nesses estudos estavam de acordo com os padrões éticos do Instituto Nacional de Perinatología, da Declaração de Helsínquia, e das diretrizes estabelecidas no Padrão Oficial mexicano do Ministério da Saúde.

1. Preparação

1. Prepare uma solução de 1x PBS com EDTA. Para fazer isso, adicione 500 μL de 0,5 M DETA estoque em 500 mL de 1x PBS para uma concentração final de 0,5 mM EDTA.
2. Prepare o meio de cultura para haec. Tome 450 mL de alta glicose-DMEM, complementá-lo com 5 mL de piruvato de sódio (100 mM), 50 mL de calor-inativo fetal soro bovino qualificado para células-tronco, 5 mL de aminoácidos não essenciais (100x), 5 mL de antibiótico-antimicotic (100x), 5 mL de L-glutamina (200m) e 500 μL de mercaptoetanol (1.000x).
3. Esterilizar os recipientes para transportar e processar o tecido: um recipiente de aço inoxidável com uma tampa para transportar toda a placenta da sala de cirurgia para o laboratório, uma bandeja (20 cm x 30 cm x 8 cm) para lavar e remover o sangue de toda a placenta antes a dissecação da membrana amniótica, e uma tábua de corte de plástico para separar a membrana amniótica nas três regiões.
4. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos (bisturis, tesouras, fórceps e grampos), copos de 500 mL, gazes de algodão e solução salina.

2. Obtenção de tecido placentária

NOTA: As membranas amnióticas foram obtidas de mulheres em gestação a termo (37 a 40 semanas), indicação de parto cesáreo, sem qualquer evidência de trabalho de parto ativo, e sem características microbiológicas de infecção. Os procedimentos completos de isolamento e cultura foram realizados dentro de um armário de biossegurança condições estéreis.

1. Na sala de cirurgia, aperte o cordão umbilical para evitar o fluxo sanguíneo para o resto do tecido. Recolher toda a placenta com o cordão umbilical preso no recipiente estéril.
2. Adicione 500 mL de solução sorino ao recipiente para hidratar a placenta.
3. Feche o recipiente e transporte o tecido para o laboratório à temperatura ambiente.
4. Coloque o recipiente com a placenta dentro do armário de biossegurança.
   NOTA: No caso de a dissecação não é realizada dentro de 15 minutos de coleta da placenta, armazenar o recipiente com a placenta no gelo até o processamento. Evite mais de 1 h de tempo decorrido entre a obtenção da placenta e o início da dissecação.

3. Separação mecânica por região da membrana amniótica

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança em condições estéreis e à temperatura ambiente.

1. Retire toda a placenta do recipiente e coloque-o na bandeja com o cordão umbilical voltado para cima.
2. Usando uma gaze de algodão estéril, limpe os coágulos sanguíneos da superfície do chorion-amnion que cobre a placenta.
3. Identifique as três regiões da membrana: o amnion umbilical que envolve o cordão umbilical, a amnion placentária que cobre os basalis da decidua, e a região refletida, que é o descanso do amnion que não é unido à placenta(figura 1).
4. Dissecar a região do amnion umbilical(Figura 2A).
   1. Usando fórceps dissecando, segure a porção de membrana de amnônio que cobre a junção da placenta e do cordão umbilical.
   2. Com um bisturi, dissecar a região que rodeia o cordão enquanto se estende para separá-lo do chorion.
   3. Deposite o tecido separado em um copo rotulado com 100 mL de solução saline.
5. Dissecar a região do amnion placentário(Figura 2B).
   1. Com uma gaze de algodão estéril, retire os coágulos sanguíneos da superfície do chorion-amnion que cobre a placenta.
   2. Segure a membrana na fronteira entre a placenta e a região refletida com fórceps dissecando.
   3. Corte ao longo da circunferência da placenta com o bisturi.
   4. Separe o amnion placental do chorion, sendo cuidadoso não cortar nenhuma embarcação da placenta.
   5. Coloque o tecido separado em outro copo rotulado com 300 mL de solução saline.
6. Separe o resto da membrana amniótica que não está ligada à placenta (ou seja, a porção refletida) do chorion(Figura 2C).
   1. Colete a região refletida em outro copo rotulado com 300 mL de solução sorino.
      NOTA: Adicione a solução shinhosa continuamente durante a dissecação para evitar que o tecido seque.

4. Lavar as membranas

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança condições estéreis à temperatura ambiente.

1. Descarte a solução sismina de cada região da membrana separadamente.
2. Adicione 100 mL de solução shinhona fresca para a região umbilical.
3. Adicione 300 mL de solução sorino fresca para as regiões placentárias e refletidas, respectivamente.
4. Mexa as membranas com a ajuda de dissecar fórceps para remover resíduos sanguíneos.
5. Descarte a solução shinhosa.
6. Repita as lavares e agitação, pelo menos, 3x até que as membranas são translúcidas.
7. Coloque e estender as membranas na placa para limpar com gaze estéril os coágulos sanguíneos que não foram removidos com as lavares.
   NOTA: É muito importante remover o maior número possível de eritrócitos, pois sua presença afeta a função de tripsina e a viabilidade das culturas celulares subsequentes.

5. Digestão enzimática das membranas de diferentes regiões

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança condições estéreis.

1. Corte as regiões refletidas e placentárias em dois ou três fragmentos.
2. Não corte a região umbilical.
3. Coloque os fragmentos de cada região em tubos de centrífuga. Adicione 20 mL de 0,5% de trippsina/EDTA às regiões refletidas e placentárias e 5 mL de 0,5% de trippsina/EDTA à região umbilical, respectivamente.
   NOTA: É importante cortar as regiões refletidas e placentárias em pedaços menores, porque eles precisam ser completamente imersos na solução de tripsina.
4. Agite os tubos de centrífuga levemente por 30 s. Descarte a trippsina.
5. Adicione 30 mL de nova trippsina/EDTA de 0,5% às regiões refletidas e placentárias e 15 mL de trippsina/EDTA de 0,5% para a região umbilical, respectivamente.
6. Coloque os tubos em um rotador dentro da incubadora.
7. Incubar com rotação (20 rpm) para 40 min em 37 °C.
   NOTA: Se um girador do tubo não está disponível, agite os tubos levemente manualmente cada 10 min.
8. Transfira as soluções de tripsina/célula de cada região para novos tubos de centrífuga.
9. Adicione 2x o volume de mídia HAEC pré-aquecido a 37 °C por tubo para inativar a enzima.
10. Guarde a primeira digestão no gelo.
11. Repita os passos 5,6-5,8 para um segundo período de digestão.
12. Para cada região, segure uma extremidade da porção de amniônio usando fórceps dissecando, e com outro par espremer ao longo do tecido para remover fileiras de células epiteliais que não descascar completamente durante os períodos de incubação anteriores.
13. Colete a segunda digestão em outro conjunto de tubos de centrífuga e inative com 2x o volume de mídia HAEC.
14. Descarte as membranas digeridas em um recipiente de risco biológico.

6. Isolamento da HAEC

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança condições estéreis.

1. Centrífuga todos os tubos a 200 x g por 10 min a 4 °C.
2. Descarte o supernatant e adicione 10 mL de mídia haec pré-aquecida (a 37 °C) por tubo e pipet suavemente para desagregar cada pelota.
3. Combine as suspensões celulares das duas digestões em um tubo individual para cada região da membrana.
4. Filtre as suspensões celulares usando filtros de células de 100 μm para remover os detritos da matriz extracelular e obter células únicas.
5. Prepare três alíquotas com 90 μL de trippan azul em um tubo de microcentrífuga.
6. Adicione 10 μL de cada suspensão celular por região de membrana nos tubos de microcentrífuga e misture.
7. Conte as células com um hemocytometer um microscópio de campo de luz.

7. Cultura da HAEC

1. Semente o HAEC das três regiões separadamente a uma densidade de 3 × 10⁴ células/cm² com mídia haec pré-aquecida, complementada com 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano (EGF).
   1. Semeie as células em placas de 100 mm para mantê-las in vitro ou em 24 placas de poço para análise imunoquímica.
2. Incubar os pratos a 37 °C condições normoxic (5% CO₂₎em uma incubadora umidificada.
3. Adicione o EGF diariamente e altere o meio a cada três dias.
   NOTA: As células se tornarão confluentes após 4 a 6 dias.
4. Use as células para imunohistoquímica convencional, análise de classificação celular, criopreservação, RNA e extração de proteínas, ou para continuar a passagem.

8. Passagem de HAEC

1. Retire o meio HAEC e lave 2x com a solução PBS/EDTA 0,01M.
2. Incubar com uma solução PBS/EDTA 0.01M por 15 min a 37 °C.
3. Retire o PBS/EDTA e adicione 1,5 mL de 0,5% de tripsina/EDTA.
4. Incubar por 5-8 min a 37 °C.
5. Inativar a enzima com dois volumes de mídia HAEC.
6. Colete a solução mista e centrífuga para 5 min a 200 x g.
7. Conte as células e continue seguindo passagens ou use as células para uma análise mais aprofundada.

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Resultados

Haec foram isolados de cada uma das três regiões anatômicas da membrana amniótica e individualmente cultivadas in vitro. Após 48 h de cultura, células com fenótipo epiteliais aderiram à superfície da placa, embora a mídia também continha detritos celulares e células flutuantes, que foram removidas uma vez que o meio foi alterado (Figura 3).

Durante o processamento da cultura primária (passagem zero, P0), algumas complicações podem surgir que podem i...

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Discussão

Implementamos um novo protocolo para isolar a HAEC das membranas a termo. Difere dos relatórios precedentes que cada membrana estêve dividida em suas três regiões anatômicas antes da isolação para analisar pilhas de cada um.

Uma das etapas mais críticas no protocolo é a lavagem da membrana para remover todos os coágulos sanguíneos, porque eles podem interferir com a atividade da tripseao separar as células epiteliais. A falha realizar corretamente esta etapa pode conduzir a obter u...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21985023	55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific/Gibco	12430054	Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9260G	0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10439024
Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11140050	100X
Paraformaldehyde	any brand
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%)	any brand
Sodium Pyruvate	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11360070	100 mM
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific/Gibco	25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352360
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator	MaCSmix
Antibodies and Kits			Antibody ID
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	RRID:AB_3975
Anti-KI67	Santa Cruz	23900	RRID:AB_627859)
Anti-NANOG	Peprotech	500-P236	RRID:AB_1268274
Anti-OCT4	Abcam	ab19857	RRID:AB_44517
Anti-SOX2	Millipore	AB5603	RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4	Cell Signaling	4755	RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60	Cell Signaling	4746	RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit	Abcam	66110