Modelo in vivo de infecção de implante espinhal em camundongos

Resumo

O protocolo descreve um novo modelo in vivo de infecção de implante espinhal em camundongos, onde um implante de fio k de aço inoxidável é infectado com Staphylococcus aureus Xen36 bioluminescente. A carga bacteriana é monitorada longitudinalmente com imagens bioluminescentes e confirmada com contagens de unidades formadoras de colônias após a eutanásia.

Resumo

As infecções por implantes na coluna vertebral pressagiam resultados ruins, pois o diagnóstico é desafiador e a erradicação cirúrgica está em desacordo com a estabilidade mecânica da coluna vertebral. O objetivo deste método é descrever um novo modelo de camundongo de infecção por implante espinhal (SII) que foi criado para fornecer uma ferramenta in vivo barata, rápida e precisa para testar potenciais estratégias terapêuticas e de tratamento para infecções de implantes espinhais.

Neste método, apresentamos um modelo de cirurgia espinhal por abordagem posterior, no qual um fio k de aço inoxidável é transfixado no processo espinhoso L4 de camundongos selvagens C57BL/6J com 12 semanas de idade e inoculado com 1 x 10³ UFC de uma cepa bioluminescente da bactéria Staphylococcus aureus Xen36. Os camundongos são então fotografados longitudinalmente para bioluminescência in vivo nos dias de pós-operatório 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 e 35. Sinais de imagem de bioluminescência (BLI) de um campo de visão padronizado são quantificados para medir a carga bacteriana in vivo.

Para quantificar as bactérias aderidas aos implantes e ao tecido peri-implantar, camundongos são eutanasiados e o implante e o tecido mole circundante são colhidos. As bactérias são destacadas do implante por sonicação, cultivadas durante a noite e, em seguida, as unidades formadoras de colônias (UFCs) são contadas. Os resultados obtidos a partir deste método incluem contagens bacterianas longitudinais medidas pela bioluminescência de S. aureus in vivo (fluxo máximo médio) e contagens de UFC após eutanásia.

Enquanto modelos animais anteriores de infecção instrumentada da coluna vertebral envolveram análise invasiva ex vivo de tecido, o modelo de SII em camundongos apresentado neste artigo aproveita imagens ópticas in vivo não invasivas e em tempo real de bactérias bioluminescentes para substituir o estudo de tecido estático. As aplicações do modelo são amplas e podem incluir a utilização de cepas bacterianas bioluminescentes alternativas, a incorporação de outros tipos de camundongos geneticamente modificados para estudar contemporaneamente a resposta imune do hospedeiro e avaliar as atuais ou investigar novas modalidades diagnósticas e terapêuticas, como antibióticos ou revestimentos de implantes.

Introdução

O objetivo deste método é descrever um novo modelo de infecção de implante espinhal (LIP) em camundongos. Esse modelo foi projetado para fornecer uma ferramenta barata e precisa para avaliar de forma flexível o efeito de variáveis do hospedeiro, patógeno e/ou implante in vivo. Testar potenciais estratégias terapêuticas e de tratamento para infecções de implantes espinhais neste modelo visa orientar o desenvolvimento de pesquisas antes da aplicação em modelos animais maiores e ensaios clínicos.

A infecção relacionada ao implante após cirurgia de coluna é uma complicação devastadora e, infelizmente, ocorre em aproximadamente 3% a 8% dos pacientes submetidos à cirurgia eletiva da coluna^vertebral 1,2,3,4,5 e em até 65% dos pacientes submetidos à cirurgia multinível ou de revisão⁶. O tratamento de infecções de implantes espinhais geralmente requer várias hospitalizações, múltiplas cirurgias e antibioticoterapia prolongada. As SIIs pressagiam resultados ruins para os pacientes, incluindo comprometimento neurológico, incapacidade e aumento do risco de mortalidade. O manejo da LIF é extremamente caro, custando mais de US$ 900.000 por paciente⁷.

Staphylococcus aureus é o patógeno virulento mais comum da LIF8,9,10,11. As bactérias podem semear o hardware diretamente durante a cirurgia, através da ferida durante o período pós-operatório, ou mais tarde via disseminação hematogênica. Na presença de implantes metálicos, o S. aureus forma biofilme que protege as bactérias da antibioticoterapia e das células imunes. Embora a remoção de hardware infectado possa ajudar efetivamente a erradicar uma infecção, isso frequentemente não é viável na coluna vertebral sem causar desestabilização e risco de comprometimento neurológico¹².

Na ausência de explantio de hardware infectado, novas abordagens são necessárias para prevenir, detectar e tratar SII. Historicamente, há modelos animais limitados de SII para avaliar eficientemente a segurança e eficácia de novas terapias. Modelos animais anteriores de LIF requerem grande número de animais e coleta de pontos de dados que requerem eutanásia, incluindo contagem de colônias, histologia e cultura^13,14,15. Na falta de monitoramento longitudinal in vivo, esses modelos fornecem apenas um ponto de dados por animal e, portanto, são caros e ineficientes.

Trabalhos anteriores estudando um modelo de infecção por artroplastia de joelho em camundongos estabeleceram o valor e a acurácia da imagem óptica in vivo não invasiva para monitorar longitudinalmente a carga de infecção¹⁶. A detecção de bioluminescência permite que a carga bacteriana seja quantificada ao longo de um curso longitudinal de tempo em um único animal de forma humana, precisa e eficiente. Além disso, estudos prévios demonstraram alta correlação entre bioluminescência in vivo e UFCs aderentes a implantes¹⁷. A capacidade de rastrear a infecção ao longo do tempo, levou a uma compreensão mais sutil da infecção relacionada ao implante. Além disso, monitorar a infecção longitudinal dessa forma permitiu avaliar com precisão a efetividade da antibioticoterapia e de novos antimicrobianos^16,17,18.

Aproveitando essas ferramentas, desenvolvemos e validamos um modelo de infecção pós-operatória de implante espinhal. No método apresentado, utilizamos um inóculo de S. aureus Xen36 bioluminescente para estabelecer um modelo in vivo de SII em camundongos para monitorar longitudinalmente a carga bacteriana16,17,18. Este novo modelo fornece uma ferramenta valiosa para testar eficientemente potenciais estratégias de detecção, prevenção e tratamento para SII antes de sua aplicação em modelos animais maiores e ensaios clínicos.

Protocolo

Todos os animais foram manuseados em estrita conformidade com as boas práticas animais, conforme definido nas regulamentações federais, conforme estabelecido na Lei de Bem-Estar Animal (AWA), no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório de 1996, na Política PHS para o Cuidado e Uso Humano de Animais de Laboratório, bem como nas políticas e procedimentos da instituição, conforme estabelecido no Manual de Treinamento de Cuidados e Uso de Animais, e todo o trabalho com animais foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal (ARC) da Universidade da Califórnia em Los Angeles.

1. Escolha da cepa bioluminescente de S. aureus

1. Utilizar a cepa bioluminescente de S. aureus Xen36 como inóculo de interesse.
   NOTA: Esta cepa foi derivada da cepa parental S. aureus ATCC-49525, que é um isolado clínico de um paciente séptico. S. aureus O Xen36 utiliza exclusivamente um operon ABCDE lux, que é otimizado e integrado ao plasmídeo nativo do hospedeiro. ¹⁹ Como resultado, a cepa Xen36 é capaz de produzir uma luz bioluminescente azul-esverdeada com um comprimento de onda de pico de emissão de 490 nm. Este sinal de emissão só é produzido por organismos bacterianos vivos metabolicamente ativos.

2. Preparação de S. aureus para inoculação

1. Adicionar 200 μg/mL de canamicina ao Caldo Luria mais ágar 1,5% para isolar S. aureus Xen36 de potenciais contaminantes, utilizando o gene de resistência à canamicina ligado ao operon lux ¹⁹.
2. Streak S. aureus Xen36 bactérias em placas de ágar de soja tríptica (caldo de soja tríptico [TSB] mais 1,5% de ágar) e incubar a 37 °C por 12-16 h.
3. Isolar colônias únicas de S. aureus Xen36 e cultivar individualmente em TSB por 12-16 h a 37 °C em incubadora de agitação (200 rpm).
4. Diluir a cultura resultante na proporção de 1:50.
5. Cultura por mais 2 h a 37 °C para isolamento de bactérias da fase midlogarítmica.
6. Pellet, ressuspender e lavar bactérias em solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes.
7. Medir a absorbância a 600 nm. O OD600 ideal está entre 0,700 e 0,750, o que corresponde a 4x10⁵ UFC/mL. Realizar diluições seriadas para obter o inóculo bacteriano desejado (1 x 10³ UFC/2 μL).
   NOTA: A concentração ideal de Xen36 para o estabelecimento de uma infecção crônica foi encontrada para ser 1 x 10³ UFC. Doses mais baixas de bactérias foram eliminadas pelo sistema imunológico do hospedeiro e doses mais altas causaram a quebra da ferida. A quebra da ferida não diferencia entre uma infecção profunda do implante e uma infecção superficial da ferida e, portanto, é evitada neste modelo (Figura 1)²⁰.

3. Ratos

1. Use camundongos selvagens C57BL/6J machos de 12 semanas de idade.
2. Ratos domésticos em gaiolas com um máximo de 4 de cada vez.
3. Mantenha a água sempre disponível. Mantenha um ciclo claro/escuro de 12 horas e não realize experimentação durante a fase escura do ciclo.
4. Use ração livre de alfafa para alimentação devido à interferência potencial com a sinalização fluorescente.
5. Peça à equipe de pesquisa ou veterinária que avalie os camundongos diariamente para garantir o bem-estar dos animais durante todo o experimento.

4. Procedimentos cirúrgicos em camundongos

1. Induzir anestesia colocando camundongos em uma câmara de isoflurano (2%) por aproximadamente 5 minutos. Confirme a profundidade apropriada da anestesia monitorando as respirações para que permaneçam rítmicas e mais lentas do que quando acordadas e não mudem em resposta a estímulos nocivos (por exemplo, manipulação cirúrgica, pinça dos dedos).
2. Transfira camundongos anestesiados para uma estação de preparação e remova pelos do sacro para a coluna torácica superior com cortadores de roedores.
3. Limpar e esterilizar a pele com lavagens triplas de solução alternada de betadina e álcool isopropílico.
4. Transferir camundongos anestesiados e esterilizados em decúbito ventral para leito cirúrgico estéril mantendo anestesia com administração inalatória de isoflurano (2%) via cone nasal.
5. Flexionar ao máximo os quadris e identificar a posição do joelho ao nível da coluna vertebral para aproximar o corpo vertebral lombar 4.
6. Fazer uma incisão longitudinal de 2 cm através da pele com bisturi cirúrgico de 15 lâminas.
7. Palpar os processos espinhosos para confirmar a linha média e continuar a incisão até o osso.
8. Dissecar subperiostealmente no lado direito do processo espinhoso de L4, estendendo-se lateralmente ao processo transverso.
9. Passar uma sutura absorvível trançada tamanho 5-0 cefálica e caudada ao corpo de L4 através da fáscia e deixar aberta, em preparação para futuro fechamento.
10. Usando uma agulha espinhal de 25 G, resma o processo espinhoso de L4 usando uma agulha espinhal de 25 G e insira um implante de aço inoxidável de grau "L" de 0,1 mm de diâmetro e 1 cm de comprimento ao longo da lâmina com o braço longo posicionando cefálica.
11. Inocular o implante com 1 x 10³ UFC/2 μL bioluminescente S. aureus Xen36, tendo o cuidado de garantir que toda a solução entre em contato com o implante.
12. Aguarde aproximadamente 10 segundos antes de amarrar a sutura absorvível previamente passada após a inoculação para garantir a contenção do inóculo no implante.
13. Feche a pele de forma corrida com sutura absorvível.
14. Administrar medicamentos para a dor através de injeção subcutânea de buprenorfina (0,1 mg/kg) imediatamente após a paragem e, em seguida, a cada 12 horas durante 3 dias subsequentes.
15. Recupere ratos em uma almofada de aquecimento e monitore para retornar à atividade normal.
16. Obter radiografias pós-operatórias para confirmar o posicionamento adequado do implante.

5. Imagem longitudinal de bioluminescência in vivo para medir a carga bacteriana

1. Anestesiar camundongos com isoflurano inalatório (2%). Confirme a profundidade apropriada da anestesia monitorando as respirações para que permaneçam rítmicas e mais lentas do que quando acordadas e não mudem em resposta a estímulos nocivos (por exemplo, manipulação cirúrgica, pinça dos dedos).
2. Remova os pelos do sacro para a coluna torácica superior com cortadores de roedores.
3. Carregue camundongos no campo de visão da plataforma de imagem bioluminescente para realizar imagens de bioluminescência in vivo (BLI)¹⁹.
4. Capture o sinal bioluminescente durante um tempo de aquisição de 5 min. Utilize configurações de binning grandes com um campo de visão de 15 cm (B).
5. Repita as etapas 5.1-5.4 nos dias 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 e 35 do pós-operatório (ou outros dias com base no planejamento experimental específico) para monitorar a carga bacteriana.
6. Apresente dados BLI por meio de escala de cores e sobreposição em uma fotografia em tons de cinza. Isolar uma região ovoide padrão de interesse (ROI) usando o software BLI para quantificar o BLI em fluxo total (fótons por segundo) ou fluxo máximo médio (fótons/segundo/centímetro²/esteradiano).

6. Quantificar bactérias aderentes aos implantes e tecidos circundantes

1. Eutanásia de camundongos no POD 35 ou em uma data pós-operatória alternativa de escolha com exposição ao dióxido de carbono de acordo com as diretrizes da AVMA. Confirmar eutanásia com luxação cervical secundária.
2. Esterilizar a pele dorsal de acordo com o Passo 4.3 e posicionar o camundongo em decúbito ventral em um campo cirúrgico estéril.
3. Incisar bruscamente a incisão anterior com bisturi cirúrgico de 15 lâminas.
4. Use tesoura estéril para dissecar bruscamente o processo espinhoso de L4 e identificar o implante cirúrgico.
5. Use um driver de agulha para torcer e remover suavemente o implante de sua posição no processo espinhoso L4.
6. Com pinça e tesoura estéreis, retirar aproximadamente 0,1 g de osso espinhoso e tecido mole imediatamente ao redor do implante cirúrgico e colocar 1 mL de PBS em rinotubo cônico pequeno com 4 esferas homogeneizadoras afiadas.
7. Registrar o peso dos tecidos moles pesando o tubo cônico antes e depois da colheita.
8. Colocar o implante em 0,5 mL de Tween-80 a 0,3% em TSB e sonicar por 15 min.
9. Vórtice a suspensão resultante do implante por 2 min e cultura durante a noite por 12-16 h.
10. Homogeneizar os tecidos moles e os processos espinhosos previamente colocados em 1 ml de PBS ao redor do implante com homogeneizador.
11. Vórtice a suspensão de tecidos moles resultante por 5 min e cultura durante a noite por 12-16 h.
12. Após a cultura noturna, conte as UFC do implante e dos tecidos circundantes, respectivamente. Valor expresso como UFC total/g colhido para tecido mole e UFC/mL para implante sonicado.

Resultados

O procedimento aqui apresentado foi utilizado para avaliar a eficácia de esquemas de antibióticos em um modelo in vivo de SII em camundongos. Especificamente, a eficácia da antibioticoterapia combinada vancomicina e rifampicina foi comparada à vancomicina em monoterapia e controles infectados não tratados.

Antes da cirurgia, os camundongos foram randomizados para terapia combinada, monoterapia ou controle infectado. Uma análise de poder estatístico foi realizada para calcular o tamanho ...

Discussão

Infecções relacionadas ao implante na coluna vertebral pressagiam maus resultados para os pacientes 1,2,3,4,5. Ao contrário de muitas outras áreas do corpo, o hardware infectado na coluna frequentemente não pode ser removido devido ao risco de instabilidade e comprometimento neurológico. Esse desafio único no cenário de bactérias do biofilme resistent...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
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PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP