NF-κB-dependente Luciferase Ativação e Quantificação da Expressão Gênica em Salmonella Células Cultura dos Tecidos Infectados

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para medir rapidamente e facilmente o fator nuclear kappa-light-chain-enhancer de células B ativadas (NF-κB) ativação em linhas celulares expressando NF-κB::luciferase repórter constrói, através de medições de luminescência no lysate celular. Além disso, a expressão gênica é determinada via RT-qPCR isolada de células infectadas com Salmonella Typhimurium.

Resumo

O fator dimeric da transcrição NF-κB regula muitos caminhos celulares da resposta, incluindo caminhos inflamatórios induzindo a expressão de várias citocinas e chemokines. NF-κB é constitutivamente expresso e é seqüestrado no citosol pelo fator nuclear de proteína inibitiva do potenciador de genes de polipeptídeos leves kappa no inibidor de células B, alfa (IκBα). A ativação do NF-κB requer a degradação do IκBα, que então expõe um sinal de localização nuclear no NF-κB e promove seu tráfico para o núcleo. Uma vez no núcleo, nf-κb liga-se à região promotor de NF-κB alvo genes como interleucina 6 (IL-6) e IL-23, para promover a sua expressão.

A ativação do NF-κB ocorre independentemente da transcrição ou tradução. Portanto, o estado de ativação do NF-κB deve ser medido por quantificar nf-κB especificamente no núcleo, ou por quantificar a expressão de NF-κB alvo genes. Neste protocolo, as células evigoradas com um NF-κB::luciferase repórter construir são auplado para nf-κb ativação usando in vitro tecido cultura técnicas. Essas células estão infectadas com Salmonella Typhimurium para ativar nf-κb, que trafica para o núcleo e se liga a κB sites na região promotor a luciferase, induzindo a sua expressão. As células são lysed e analisados com o sistema de ensaio luciferase. A quantidade de luciferase produzida pelas células correlaciona-se com a intensidade do sinal de luminescência, que é detectado por um leitor de placas. O sinal de luminescência gerado por este procedimento fornece um método rápido e altamente sensível pelo qual avaliar a ativação nf-κB uma série de condições. Este protocolo também utiliza a transcrição reversa quantitativa PCR (RT-qPCR) para detectar níveis relativos de mRNA que são indicativos de expressão gênica.

Introdução

A família de proteínas fator-κB nuclear (NF-κB) são importantes ativadores de transcrição que regulam a expressão gênica em várias vias biológicas. A ativação do NF-κB induz a transcrição de genes-alvo, muitos dos quais são importantes para respostas imunes e inflamatórias, proliferação celular, respostas ao estresse e progressão do câncer^1,2. NF-κB desempenha um papel integral na mediação dos primeiros resultados inflamatórios para a desminagem de patógenos. Dado os muitos processos biológicos mediados pela ativação nf-κB, interrupções em sua sinalização podem ter sérias conseqüências para a saúde e doença. A perda de mutações de função na sinalização NF-κB está associada em vários fenótipos de deficiência imunológica, enquanto o ganho de mutações de função está associado a vários tipos de cânceres, incluindo linfomas de células B e câncer de mama³. Além disso, muitos patógenos têm demonstrado modular diretamente o estado de ativação do NF-κB através da expressão dos fatores de virulência^4,5,6,7.

A ativação do NF-κB é conhecida por ser uma conseqüência de muitos estímulos variáveis, incluindo produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS), flagenina e peptidoglicans conhecidos como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Esses PAMPs são detectados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), como os receptores semelhantes a pedágios (TLRs) e receptores semelhantes ao Nod (NLRs), levando à ativação do NF-κB e à expressão subsequente de uma matriz de genes inflamatórios dependentes de NF-κB⁸. Além da ativação da RPR por PAMPs, outros produtos bacterianos, como proteínas efívoras, podem induzir a ativação do NF-κB. Curiosamente, as bactérias também expressam proteínas efetivas que atenuam ativamente a via NF-κB e aumentam sua patogenicidade, ressaltando a importância da NF-κB como mediador essencial da imunidade⁹.

Existem cinco subunidades diferentes que formam os dimers NF-κB; p50, p52, RelA (p65), RelB e cRel. Os dois principais heterodimers NF-κB são o p50:RelA e o p52:RelB dimers. Os dimers nf-κb ativados ligam-se a locais de DNA, conhecidos como locais de κB, nas regiões promotoras e potenciadoras de vários genes-alvo. Em condições homeostáticas normais, nf-κb interage com uma família de proteínas inibidoras conhecidas como proteínas IκB para permanecer inativo. Após a estimulação, iκB é fosforilado por IκB Kinase (IKK), que permite que ele seja alvo de ubiquitinação e, posteriormente, degradação. Degradação do IκB ativa NF-κB, revelando um sinal de localização nuclear. NF-κB, em seguida, translocaliza para o núcleo, onde liga locais κB na região promotor de genes-alvo e promover a transcrição¹⁰. Assim, a ativação do NF-κB regula a expressão de mRNA de genes-alvo NF-κB, e essa mudança pode ser medida através de ensaios de quantificação de RNA, como RT-qPCR¹¹.

Vários métodos existem e são comumente usados para a medição da ativação nf-κb, incluindo ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA), translocação nuclear e ensaios de repórters genéticos. A EMSA é usada para detectar complexos proteicos com ácidos nucleicos. As células estimuladas são fracionadas para isolar proteínas nucleares, incluindo o NF-κB translocado, que é então incubado com nucleotídeos radiografados contendo o domínio de ligação NF-κB. As amostras são executadas em um gel e imagemdas por autoradiografia de ³²ácidos nucleicos p-etiquetados. Se nf-κb está presente na fração de proteína, ele vai ligar os nucleotídeos, que migrará mais lento através do gel e presente como bandas discretas. Frações nucleares de células sem NF-κB ativado (por exemplo, células de controle não estimuladas) não produzirão bandas à medida que os nucleotídeos migrarem mais rápido para o final do gel. Uma grande desvantagem deste método é que ele é em grande parte quantitativo no sentido binário (ou seja, dentro ou fora) e não captura adequadamente diferenças significativas na capacidade de ligação NF-κB. Além disso, este método não considera estruturas de cromatina que são funcionalmente importantes para os genes-alvo NF-κB^12,13.

Semelhante ao método anterior, há um ensaio "não-turno", no qual placas multi-poço são revestidas com nucleotídeos contendo a seqüência de ligação NF-κB. Após o tratamento de células com frações nucleares de proteína, NF-κB vai ligar-se aos nucleotídeos ligados ao poço. Os anticorpos anti-NF-κB são então adicionados, que interagirão com o NF-κB vinculado e produzirão um sinal colorimétrico proporcional à quantidade de NF-κB, indicando o grau de ativação nf-κB. Este método é vantajoso sobre o EMSA na medida em que não requer ácidos nucleicos radiorotulados e é quantitativo, em comparação. No entanto, uma ressalva deste método é que ele novamente não diferencia entre os estados de cromatina de NF-κB alvo genes¹⁴.

Outro método pelo qual a ativação nf-κb pode ser detectada é por imunoprecipitação de cromatina (ChIP), pelo qual o DNA e as proteínas interagindo estão interligados com formaldeído e imunoprecipitado com anticorpos específicos anti-NF-κB. Os fragmentos específicos do nucleotídeo são então purificados e identificados através da amplificação do PCR ou do sequenciamento de alta transferência direta. Os resultados gerados a partir deste método fornecem resultados semiquantitativos da atividade de ligação NF-κB com genes-alvo. No entanto, os resultados são altamente dependentes das condições de fixação e dos processos de purificação em cada etapa^15.

Em ensaios de translocação nuclear, as células são estimuladas a induzir a ativação nf-κb e, em seguida, corrigido. Os anticorpos anti-p65 são adicionados às células fixas. Alternativamente, o subunidade p65 em si pode ser marcado com um peptídeo fluorescente, como verde fluorescente verde (GFP). Em ambos os casos, a imunofluorescência permitirá que a imagem latente da localização do p65 determine a distribuição celular. Medindo a proporção de proteína localizada citossólica e nuclear, os investigadores podem determinar o estado relativo de ativação do NF-κB. Uma desvantagem deste método é que a imunofluorescência é comparativamente demorada, requer anticorpos caros e precisa de experiência técnica relativamente maior^16.

Genes de repórter são ferramentas comumente usadas para estudar os padrões regulatórios e de expressão de um gene de interesse. Tipicamente, os genes do repórter são construídos da seqüência do promotor de um gene do interesse fundido a uma codificação do gene para uma proteína facilmente detectável. Proteínas com atividades enzimáticas, fluorescência ou propriedades de luminescência são comumente escolhidas por sua capacidade de serem assumidas e quantificadas. Assim, a leitura (por exemplo, luminescência, fluorescência) serve como um sinal para a detecção da expressão gênica. Estas construções do repórter podem então ser introduzidas em tipos diferentes da pilha, tais como pilhas epiteliais ou macrófagos.

Descrito no protocolo é o uso de uma linha de células HeLa clonada (HeLa 57A) que é evigorada mente transfeccionada com um repórter lúciferase contendo três cópias do consenso κB da imunoglobulina tradi-chain promotor região¹⁷. A expressão de luciferase depende da ativação do NF-κB, que ocorre após a estimulação celular. As células estimuladas são facilmente lysed usando tampão de lyse celular fornecido no kit de ensaio luciferase. Uma parte do lysate celular é então misturada com tampão de ensaio luciferase que contém luciferino. Luciferin é o substrato de lúciferase e é necessário para a geração de luz na presença de lúciferase. Depois de combinar o amortecedor de ensaio com o liceu, a solução emitirá luz em um processo conhecido como luminescência. A quantidade de luz produzida, dada em lumens, é proporcional à quantidade de lúciferase presente no lysate e serve como medida de ativação nf-κB. As leituras do lúmen são interpretadas em comparação com um padrão não estimulado para dar conta da atividade de linha de base NF-κB e o sinal em si é estável por vários minutos para permitir uma medição confiável. Além disso, a linha celular HeLa 57A está evigorada com um repórter independente de NF-κB β-galactosidase. O repórter β-galactosidase é expresso constitutivamente, e a atividade β-galactosidase pode ser medida para controlar a viabilidade celular ou variação nos números celulares^17. Os valores de luciferase podem então ser ajustados aos valores β-galactosidase e relatados como aumento da dobra sobre as células de controle não estimuladas.

Como o NF-κB é um fator de transcrição responsável pelo aumento da expressão de genes-alvo dependentes de NF-κB, um experimento de acompanhamento para controlar o aumento da expressão gênica dependente de NF-κB é a reação quantitativa em cadeia de transcrição reversa ( RT-qPCR). RT-qPCR é um método altamente sensível pelo qual as mudanças na expressão gênica podem ser quantificadas ao longo de várias ordens de magnitude. Células estimuladas e de controle são colhidas para RNA através da extração fenol-clorofórmio. Após a separação de fase, o RNA é extraído como o principal componente da camada aquosa. RNA é então precipitado e lavado para produzir uma pelota pura. Esta pelota é então reconstituída e ainda mais limpa de DNA contaminante através do tratamento do DNAse. O RNA puro é então transcrito reverso para criar DNA complementar (CDNA). Este CDNA pode então ser analisado através de técnicas quantitativas de PCR, onde a abundância de uma sequência específica de mRNA é quantificada para determinar a expressão gênica. Esta técnica não elucida o controle translacional, a modificação pós-translacional, a abundância de proteínas ou a atividade proteica. No entanto, muitos genes, particularmente aqueles envolvidos em processos pró-inflamatórios, são regulados via NF-κB e sua abundância de mRNA é indicativa de sua expressão.

O método proposto aqui utiliza uma maneira rápida e simples pela qual a ativação NF-κB pode ser detectada através de ensaios de luminescência de lisoza celular. RT-qPCR de NF-κB expressão gênica alvo pode ser usado para quantificar a expressão de genes particulares, bem como validar a atividade funcional da ativação NF-κB. As principais vantagens de tal sistema são sua simplicidade e velocidade, o que permite a triagem de alta produtividade de uma série de condições que modulam a ativação nf-κB. Este protocolo é adequado para outras linhas celulares expressando um NF-κB::luciferase repórter, e tem sido demonstrado em evigorados RAW264.7 células¹⁸. A quantidade de tempo necessária para lidar com amostras, a partir de lyse celular para gerar um sinal de luminescência, é mínima e leva o espaço de cerca de uma hora. A medição do NF-κB requer apenas equipamentos básicos de laboratório, como placas opacas, um leitor de placas capaz de medir a luminescência e um software simples de análise de dados, como um programa de planilha.

Protocolo

1. Passaging e semeadura da pilha

1. Mantenha as células HeLa 57A em um frasco de 75 cm² contendo 10 mL da mídia eagle modificada de Dulbecco (DMEM) complementada com 5% de calor inativado soro bovino fetal (FBS) em 37 °C em uma incubadora de 5% CO_2.
2. Aspirate mídia cultura celular e lavar com 1 mL de 0,05% solução trypsin-EDTA. Aspirate trypsin e substituir por um adicional de 1 mL. Coloque o frasco em uma incubadora de 37 °C por 4-5 min para permitir que as células se separam do frasco.
3. Adicione 9 mL de mídia de cultura celular e lave suavemente o fundo do frasco algumas vezes para desalojar as células e formar uma suspensão homogênea.
4. Diluir as células HeLa 57A 1:6 ou 1:8 em novas mídias e sementes em novos frascos. Células de passagem quando são 90% confluent ou a cada três dias e manter as células em um mínimo de 25% de confluência.
5. Um dia antes da estimulação celular, trippsinizar células HeLa 57A e suspender em 10 mL de mídia de crescimento. Conte as células em suspensão usando um hemocytometer e use mídia de crescimento para diluir as células a uma concentração final de 2,5 x 10⁵ células/mL em um tubo cônico de 50 mL.
6. Transfira 250 μL de suspensão celular (~6.25 x 10⁴ células) para cada poço de uma placa de 48 poços. Periodicamente tampa e virar o tubo cônico para garantir uma suspensão celular homogênea. Toque na placa suavemente ao lado para garantir que as células distribuam uniformemente nos poços.
7. Transfira a placa para 37 °C em uma incubadora de 5% de CO₂ e permita que as células se anexem e cresçam durante a noite.

2. Preparação de bactérias

1. Dois dias antes da infecção, raia estoques congelados de Salmonella em placas de ágar LB para produzir colônias individuais. Transfira placas para uma incubadora fixada em 37 °C e permita o crescimento noturno.
2. Um dia antes da infecção, adicione 3 mL de caldo de lysogeny (LB) para tubos de cultura bacteriana estéril, adicionando os antibióticos adequados para a mídia.
3. Usando um loop de inoculação estéril, escolha uma única colônia de culturas bacterianas listradas e toque o laço para a mídia LB. Tampe os tubos após a inoculação e descarte o laço.
4. Coloque os tubos em uma incubadora tremendo situada em 37 °C, 180 rpm, e deixe crescer durante a noite.
5. No dia da infecção, recuperar culturas bacterianas durante a noite da incubadora.
6. Prepare tubos para a subcultura, adicionando 3 mL de LB fresco, contendo antibióticos quando apropriado.
7. Transfira 30 μL da cultura bacteriana durante a noite (1 em 100 diluição) para a mídia recém-preparada. Coloque os tubos em uma incubadora tremendo fixado em 37 °C para 3 h.
8. Após a incubação de 3 h, transfira 1 mL de caldo LB estéril para um cuvette de plástico para servir como o espaço em branco. Transfira 900 μL de LB para as outras cuvettes para serem usadas para a análise da amostra.
9. Transfira 100 μL de subcultura bacteriana em um cuvette contendo 900 μL de LB e pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar. Repita isso para cada suspensão bacteriana.
10. Ligue o espectrômetro para medir a densidade óptica (OD) das culturas bacterianas em um comprimento de onda de 600 nm (OD_600).
11. Coloque o espaço em branco no espectrômetro. Tome nota da orientação, pois deve haver uma marca para o topo indicando tal.
12. Feche a tampa e pressione o botão Em branco no espectrômetro para obter a absorção de fundo.
13. Substitua o cuvette em branco por uma amostra de cuvette na mesma orientação e pressione Leia.
14. Registre os₆₀₀ valores da OD dessas amostras. Multiplique o valor por 10 para dar conta do fator de diluição.
15. Diluir a subcultura bacteriana com LB fresco para alcançar um valor de absorção de aproximadamente 1,0, que corresponde aproximadamente com 1 x 10⁹ cfu/mL. Diluir esta suspensão 1:10 em um cuvette e medir a absorção - que deve dar um valor de ~ 0,1.
16. Em um novo tubo, adicione um volume apropriado da subcultura diluída para LB fresco para alcançar uma suspensão de 1 x 10⁸ cfu/mL para ser usado como um inóculo.
17. Prepare diluições em série do inóculo transferindo 50 μL de suspensão bacteriana para um tubo contendo 450 μL de PBS estéreis (diluição de 10 vezes) até que uma diluição final de aproximadamente 10² cfu/mL seja feita.
18. Transfira 100 μL das duas diluições mais baixas (10² e 10³ correspondentes a 10 e 100 unidades formadoras de colônias, respectivamente) para uma placa de ágar LB e espalhe a suspensão com um propagador de células para obter colônias individuais. Transfira estas placas para uma incubadora de 37 °C e incubada durante a noite.
19. No dia seguinte, conte as colônias e calcule a concentração bacteriana do inóculo inicial para determinar a concentração real de inóculos.

3. Infecção das células

NOTA: Neste ponto, as células devem estar em cerca de 90% de confluência. Para as células HeLa 57A em uma placa de 48 poços, isso é aproximadamente 1 x 10⁵ células por poço. As células serão infectadas com multiplicidade de infecção (MOI) de 10, ou 10⁶ cfu/well.

1. Rotular a tampa da placa de acordo com as condições de infecção que serão utilizados para cada poço, com cada condição a ser feito em triplicado.
2. Adicione 10 μL do inóculo aos poços apropriados. Adicione 10 μL de LB estéril a poços de controle não infectados.
3. Para sincronizar o tempo da infecção, coloque a placa em uma centrífuga de mesa e gire a 500 x g por 5 min, garantindo que a placa seja compensada.
4. Transfira células infectadas para uma incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C por 1 h.
5. Coloque um alibato de mídia de cultura celular em um banho de água de 37 °C para uso na próxima etapa.
6. Uma hora após o tempo de infecção, remover a mídia de cultura celular do banho de água e limpar o exterior com 70% de etanol. Transferir placa de cultura de tecido saquear o armário de biossegurança.
7. Usando técnica estéril, aspirate mídia de poços e substituir por 250 μL de fresco, mídia cultura de células quentes.
8. Placas de retorno para a incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C para 4 h adicionais.
9. Retire as placas da incubadora de CO₂ e aspirar a mídia dos poços. Para a análise luciferase continuar a passo 4.1. Para o isolamento do RNA, vá para o passo 5.1.

4. Análise Luciferase

1. Adicione 100 μL de 1x célula lysis buffer para os poços. O amortecedor pode precisar de primeiramente ser diluído a uma concentração de funcionamento, dependendo do reagent.
2. Transfira a placa para um congelador de -80 °C e incubapor por pelo menos 30 min para garantir a lyse celular eficiente.
3. Coloque a placa contendo lysate de células congeladas em um banco para descongelar e preparar reagentes de substrato luciferase de acordo com as recomendações do fabricante.
4. Permita que os reagentes do substrato luciferase equilibrem-se à temperatura ambiente.
5. Ligue o leitor de placas e abra o programa de leitor correspondente. Defina a máquina para medir a luminescência.
6. Transfira 10 μL de cada amostra para um poço de uma placa opaca de 96 poços.
7. Adicione 50 μL do Luciferase Assay Reagent usando uma pipeta multicanal para cada poço da placa opaca.
8. Toque suavemente a placa do lado para misturar poços e garantir que a superfície inferior é coberta com líquido. Coloque a placa em um leitor de placa e iniciar a leitura.
9. Copie os valores de luminescência em um programa de planilha e trace os resultados.

5. Isolamento rna

1. Adicione 500 μL de guanidium tiacianato a cada poço e pipeta para cima e para baixo várias vezes para garantir a lyse completa.
2. Transfira o conteúdo para um tubo de microcentrífuga rotulado. Mantenha amostras no gelo, tanto quanto possível para manter a qualidade do RNA.
3. Defina uma centrífuga de mesa para 4 °C e mantenha a centrífuga a esta temperatura para o restante do protocolo.
4. Para cada tubo de amostra, adicione 100 μL de clorofórmio, tampa firmemente, e agite por 15 s. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
5. Centrífuga a 12.000 x g por 15 min a 4 °C. Durante este tempo, prepare-se para a próxima etapa da purificação de RNA, rotulando novos tubos.
6. Transfira a fase aquosa superior para o novo tubo contendo 250 μL de isopropanol, tomando cuidado para não perturbar as camadas média ou inferior.
7. Armazenar produto não utilizado em um congelador -80 °C, que também pode ser usado para análise de proteínas. A camada aquosa residual também pode servir como um backup se o RNA for necessário mais tarde.
8. Vortex a mistura de camada aquosa e isopropanol e permitir que as amostras para sentar-se à temperatura ambiente por 10 min.
9. Centrífugas as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
10. Retire os tubos da centrífuga. O precipitate do RNA dá forma a uma pelota branca no lado e na parte inferior do tubo. Abra os tubos e retire cuidadosamente o supernatant derramando para fora em um recipiente waste.
11. Lave a pelota de RNA adicionando 500 μL de 75% de etanol e vórtice.
12. Centrífuga a 8.000 x g por 5 min a 4 °C.
13. Retire o supernatant derramando e novamente lave a pelota com 75% de etanol.
14. Centrífuga a 8.000 x g por 5 min a 4 °C.
15. Usando uma pipeta de pequeno volume (por exemplo, 10-200 μL volume), aspirar o máximo de supernatant possível, tomando cuidado para não empurrar qualquer líquido de volta para o tubo ou desalojar a pelota com a ponta da pipeta. Se a pelota se desalojar, a centrífuga brevemente e novamente tentar remover supernatant.
    1. Secar as pelotas de RNA. Se as pelotas são visíveis para qualquer amostra, periodicamente (a cada 5 minutos) verificar sobre eles para ver se eles mudam de branco para claro, indicando que eles estão secos. Uma vez que as pelotas começam a ficar claras, adicione 20 μL de água ultrapura e livre de RNase para dissolver o RNA.
    2. Se as pelotas não eram inicialmente visíveis para quaisquer amostras, basta adicionar água ultrapura 5 min após a remoção de supernatant.
16. Para aumentar a solubilidade, passe a solução algumas vezes através de uma ponta de pipeta e incubar por 10 minutos a 55-60 °C.

6. Tratamento de DNA de RNA

1. Para manter a integridade do RNA, guarde amostras de RNA no gelo, a menos que indicado de outra forma. Neste momento, o tampão de DNase 10x pode ser removido do congelador e autorizado a descongelar no gelo.
2. Prepare o espectrômetro para análise de amostras limpando todas as superfícies de análise de amostras com um pano livre de fiapos.
3. Faça uma medida de fundo antes da análise. Para isso, carregue o sensor com 1,5 μL da mesma água ultrapura usada para dissolver as pelotas de RNA. Pressione o botão Leia em branco para gerar uma leitura de fundo.
4. Use o pano livre de fiapos para limpar a superfície de carregamento da amostra do instrumento. Repita esta etapa após cada leitura da amostra.
5. Load 1.5 μL de RNA resuspendido para o titular da amostra e selecione Amostra leia. Repita até que todas as amostras tenham sido lidas.
6. Prepare a mistura mestra de DNase combinando 2,4 μL de buffer de DNase 10x e 1 μL de DNAse, por amostra, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare a mistura principal para dois volumes extras.
7. Misture a mistura mestre, sacudindo o tubo várias vezes. Brevemente centrífuga do tubo para coletar conteúdo na parte inferior do tubo. Adicione 3,4 μL de mastermix a 20 μL de amostra de RNA. Misture o conteúdo por flicking e centrífuga brevemente, como antes.
8. Transfira as amostras para um bloco de calor fixado em 37 °C por 20 min. Retire o reagente de inativação de DNase do congelador e descongele à temperatura ambiente.
9. 20 min depois de colocar amostras no bloco de calor, transferir as amostras para um rack de tubo colocado no banco de trabalho.
10. Vortex delicadamente o índice do reagent da inativação do DNase. Transfira 2,6 μL de reagente de inativação de DNase para os tubos contendo RNA e, em seguida, agite os tubos para criar uma mistura homogênea.
11. Centrífuga s amostras a 12.000 x g por 1 min.
12. Cuidadosamente pipeta o supernatant para um novo tubo, rotulado.

7. Transcrição reversa de mRNA para cDNA

1. Prepare uma mistura mestra dependendo da quantidade de amostras mais duas extras para contabilizar a perda através de pipetting (Tabela 1). Use 1 μg de RNA e adicione H₂O a um volume de 50 μL total.

Reagente	Volume (μL)	Concentração final
MgCl2 (25mM)	3.5	1,75 mM
Tampão de transcrição reversa (10x)	5	1x 1x 1x
dNTP mix (10 μM, cada)	2.5	500 nm
hexamer aleatório (100 μM)	1.25	2,5 μM
Transcrição reversa multiscribe (50 U/μL)	1	1 U/μL 1 U/μL
Inibidor de RNase (20 U/μL)	1.25	1.25 U/μL 1.25 U/μL
RNA (1 μg)		20 ng/uL 20 ng/uL
H2O	completar até 50

Tabela 1: Componentes e receita para mistura mestre de transcrição reversa.

2. Tampe as amostras firmemente e rotule os tubos PCR no lado, pois os rótulos na tampa podem ser removidos da tampa aquecida do termociclor mais tarde. Misture por vórtice.
3. Brevemente centrífuga os tubos PCR para coletar amostras para o fundo do tubo.
4. Coloque os tubos PCR em um termocicloe e executar as amostras as seguintes configurações:
   25 °C por 10 min, 48 °C por 30 min, 95 °C por 5 min, e depois segurar a 10 °C.
5. Transfira tubos contendo cDNA recém-sintetizado para um freezer de -20 °C ou uso imediatamente na análise qPCR.

8. Placa de preparação e carregamento para análise rt-qPCR

1. Antes de começar, planeje a configuração da placa qPCR de 384 poços para análise de amostras.
2. Descongelar primers e cDNA no gelo.
3. Prepare uma mistura mestre (ver Tabela 2), além de aproximadamente 10% extra para responder pela perda através de pipetting.

Reagente	Volume (μL)
10 μM F primer 10 μM F primer	1
10 μM R primer 10 μM R primer	1
Ultrapure H2O	4
2x SYBR verde	10

Tabela 2: Componentes e receita para a mistura mestra qPCR.

4. Vortex a mistura mestre e dispensar 8 μL nos poços da placa de 384 poços usando uma pipeta repetidor. As amostras serão analisadas em duplicata para cada combinação de amostra de primer e cDNA.
5. Usando uma pipeta P10 (ou menor), transfira 2 μL de cDNA para duplicar poços para cada cartilha definido para ser analisado. Substitua dicas após cada poço para evitar contaminação cruzada.
6. Selar a placa aplicando cuidadosamente o filme adesivo à superfície, garantindo que todos os poços são cobertos. Pressione o filme usando uma raquete de vedação ou rolo para selar firmemente.
7. Coloque a placa em uma centrífuga, com uma placa vazia como um contrapeso. Centrífuga a placa a 500 x g por 5 min.

9. Executando o Termociclo para análise qPCR

1. Poder no computador e no instrumento pcr em tempo real.
2. Abra o software RT-qPCR e selecione novo experimento.
3. a guia de configuração, selecione Propriedades experimentais,onde os parâmetros para a execução podem ser definidos.
4. Defina o nomeexperiment, que definirá o nome do arquivo e as configurações usadas para armazenar resultados.
5. Para a Seleçãode Instrumentos, selecione o instrumento atualmente conectado que estará executando a análise. Selecione o método de execução de CT Comparativo (ΔΔCt).
6. Selecione SYBR Green Reagents como o corante de DNA fluorescente para ser usado e Standard como a velocidade da rampa.
7. Certifique-se de que a caixa ao lado de Incluir Curva de Derretimento é verificada.
8. a guia Define, atribua alvos (ou seja, genes a serem amplificados) e amostras (ou seja, condições experimentais).
9. Selecione a guia Assign. Rotular os poços com os alvos e amostras apropriados, pois correspondem ao esquema de carregamento da placa de 384 poços.
10. Selecione o método de execução. Use os parâmetros para análise listados em(Tabela 3).

	Mantenha o palco		Estágio PCR		Estágio da curva do derretimento
	Passo 1	Passo 2	Passo 1	Passo 2	Passo 1	Passo 2	Passo 3
Temp	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
Tempo	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
Coleta de dados				Sim			Sim
Número de ciclos	1x 1x 1x		40x 40x		1x 1x 1x

Tabela 3: Parâmetros de ciclo para termóspere.

11. Coloque a placa de 384 poços no termociclo e inicie a análise.

10. Análise dos resultados qPCR com o Método Delta-Delta Ct (2^-ΔΔct)

1. Analise os resultados gerados a partir da reação qPCR para erros que podem interferir na análise a jusante. Muitos erros serão sinalizados automaticamente pelo sistema.
2. Para primers corretamente construídos, as curvas do derretimento devem somente ter um pico. Exclua todos os poços que contenham uma curva de derretimento com mais de um pico de uma análise mais adicional.
3. Exportar os valores ct para um programa de planilha para analisar os dados usando o método ΔΔCt. Um formato sugerido é fornecido(Tabela 4). A última coluna é a mudança de expressão da amostra, em relação às amostras de controle.

	Gene da limpeza(GAPDH)			Gene de interesse (IL6)
	Ct1 Ct1	Ct2 Ct2	Ave Ct	Ct1 Ct1	Ct2 Ct2	Ave Ct	Δct Δct	Ave ΔCt ctrls Ave Δct ctrls	ΔΔCt ΔΔct	2^-(ΔΔCt)	Geomean Geomean
Controle 1	15.33	15.37	15.35	26.81	26.91	26.86	11.51	10.51	1.00	0.50	1.00
Controle 2	16.83	16.77	16.80	26.89	26.92	26.91	10.11	10.51	-0.41	1.33
Controle 3	17.56	17.53	17.54	27.38	27.56	27.47	9.93	10.51	-0.59	1.50
Sl1344 1 Sl1344 1	15.50	15.41	15.45	22.15	22.13	22.14	6.69	10.51	-3.83	14.21	13.23
SL1344 2 SL1344 2	16.02	15.98	16.00	23.01	22.96	22.98	6.98	10.51	-3.53	11.57
SL1344 3 SL1344 3	17.27	17.30	17.28	23.99	23.98	23.98	6.70	10.51	-3.82	14.09
sipA sopB sopE2 1 sipA sopB sopE2 1	15.38	15.41	15.39	23.31	23.09	23.20	7.80	10.51	-2.71	6.56	7.29
sipA sopB sopE2 2 sipA sopB sopE2 2	16.01	16.05	16.03	23.89	23.92	23.91	7.88	10.51	-2.64	6.23
sipA sopB sopE2 3 sipA sopB sopE2 3	16.78	16.78	16.78	24.02	24.06	24.04	7.27	10.51	-3.25	9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1 sipA sopB sopE2 1	15.52	15.60	15.56	27.04	27.03	27.03	11.47	10.51	0.96	0.51	0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2 sipA sopE2 sopE 2	15.56	15.59	15.57	26.37	26.42	26.39	10.82	10.51	0.31	0.81
sipA sopB sopE 2 sopE 3 sipA sopB sopE 2 sopE 3	15.91	15.92	15.91	26.24	26.12	26.18	10.27	10.51	-0.25	1.19

Tabela 4: Formato para análise de dados qPCR.

Resultados

O ensaio descrito aqui centra-se na ativação do fator de transcrição NF-κB usando um repórter luciferase nf-κB-dependente que é evigorado em uma linha de células HeLa. Ativado NF-κB transloca para o núcleo onde liga κB sites de ligação de genes-alvo, incluindo as citocinas pró-inflamatórias IL6 e IL23. Uma visão geral da ativação nf-κb é retratada na Figura 1. A bactéria gram-negativa Salmonella enterica serova...

Discussão

A principal contribuição do protocolo descrito é que ele fornece um método rápido e fácil para detectar a ativação NF-κB em células, o que permite uma análise de alta taxa de taxa de taxa de múltiplas condições de estímulo ou medicamentos que afetam a ativação nf-κb. Aqui, descrevemos um protocolo para a ativação nf-κb em células HeLa infectadas por Salmonella. Estas pilhas podem ser usadas para a infecção com outros micróbios patogénicos também para estudar o impacto da infecção bac...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive film	VWR International	60941-070
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
Ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
Promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate