Produção de plataforma de entrega de vacinas de vacinação de infravermelho próximo e infravermelho

Resumo

Este artigo descreve os protocolos usados para produzir uma nova plataforma de entrega de vacinas, "polibolhas", para permitir a liberação de estouro atrasada. Poliésteres incluindo poli (ácido láctico-coglicólico) e policaprolactona foram usados para formar os polibolhas e pequenas moléculas e antígenos foram usados como carga.

Resumo

Estratégias de entrega de vacinas que podem limitar a exposição da carga a solventes orgânicos, ao mesmo tempo em que permitem novos perfis de liberação, são cruciais para melhorar a cobertura vacinal em todo o mundo. Aqui, uma nova plataforma de liberação de vacinas injetável, ultravioleta e retardada, que permite a entrega de vacinas chamada polibolhas, é introduzida. A carga foi injetada em polibolhas à base de poliéster que foram formadas em uma solução aquosa baseada em carboxymethycellulose de 10%. Este artigo inclui protocolos para manter a forma esférica dos polibolhas e otimizar a colocação e retenção de carga para maximizar a quantidade de carga dentro dos polibolhas. Para garantir a segurança, o teor de solventes clorados dentro dos polibolhas foi analisado por meio da análise de ativação de nêutrons. Os estudos de liberação foram realizados com pequenas moléculas como carga dentro do polibole para confirmar a liberação retardada da explosão. Para mostrar ainda mais o potencial de entrega sob demanda da carga, nanorods de ouro foram misturados dentro da concha de polímero para permitir a ativação a laser quase infravermelha.

Introdução

A cobertura vacinal limitada resulta na morte de 3 milhões de pessoas especificamente causadas por doenças preveníveis por vacinas¹. Condições inadequadas de armazenamento e transporte levam ao desperdício de vacinas funcionais e, portanto, contribuem para a redução da imunização global. Além disso, a vacinação incompleta por não aderir aos calendários vacinais necessários também causa cobertura vacinal limitada, especificamente nos países em desenvolvimento². São necessárias múltiplas visitas ao pessoal médico dentro do período recomendado para o recebimento de vacinas de reforço, limitando assim o percentual da população com vacinação completa. Por isso, é necessário desenvolver novas estratégias para a entrega controlada de vacinas para contornar esses desafios.

Os esforços atuais para o desenvolvimento de tecnologias de entrega de vacinas incluem sistemas poliméricos baseados em emulsão^3,,4. No entanto, a carga é frequentemente exposta a uma maior quantidade de solvente orgânico que pode potencialmente causar agregação e desnaturação, especificamente no contexto da carga à base de^{proteínas 5,6}. Desenvolvemos uma nova plataforma de entrega de vacinas, "polibolhas", que pode potencialmente abrigar vários compartimentos de carga, minimizando o volume de carga que está exposta ao solvente⁷. Por exemplo, em nossa plataforma de concha-núcleo de polibole, um bolsão de carga de diâmetro de 0,38 mm (SEM) é injetado no centro de um polibole de 1 mm. Neste caso, a superfície da carga exposta ao solvente orgânico seria de aproximadamente 0,453 mm². Depois de considerar a densidade de embalagem de esferas (micropartículas) dentro de uma esfera (depósito de carga), o volume real de micropartículas (10 μm de diâmetro) que poderia caber no depósito é de 0,17 mm³. O volume de uma micropartícula é de 5,24x10^-8 mm³ e, portanto, o número de partículas micropartículas que podem se encaixar no depósito é ~3.2x10⁶ partículas. Se cada micropartícula tiver 20 bolsões de carga (como resultado de dupla emulsão) de 0,25 μm de diâmetro, então a área superficial de carga exposta ao solvente orgânico é de 1274 mm². O depósito de carga dentro do polibole teria, portanto, ~2800 vezes menos área de superfície exposta a solvente orgânico em comparação com a carga orgânica exposta a solventes em micropartículas. Nossa plataforma baseada em poliéster pode, assim, reduzir potencialmente a quantidade de carga exposta a solvente orgânico que pode causar agregação e instabilidade de carga.

Os polibolhas são formados com base no princípio da separação de fases onde o poliéster em fase orgânica é injetado em uma solução aquosa resultando em uma bolha esférica. A carga na fase aquosa pode então ser injetada no centro do polibole. Outro compartimento de carga pode potencialmente ser alcançado dentro do polibole misturando uma carga diferente com a concha do polímero. O polibole nesta fase será maleável e, em seguida, será curado para resultar em uma estrutura de polibole sólida com carga no meio. Polibolhas esféricas foram escolhidas em vez de outras formas geométricas para aumentar a capacidade de carga dentro do polibole, minimizando o tamanho geral do polibole. Polibolhas com carga no centro foram escolhidas para demonstrar a liberação de rajadas atrasadas. Os polibolhas também foram incorporados com o agente quase infravermelho (NIR) sensível (ou seja, teranostico-habilitador), ou seja, nanorods de ouro (AuNR), para causar aumento na temperatura das polibolhas. Esse efeito poderia potencialmente facilitar a degradação mais rápida e poderia ser usado para controlar cinéticas em aplicações futuras. Neste artigo, descrevemos nossa abordagem de formar e caracterizar polibolhas, para alcançar a liberação de estouro retardada dos polibolhas, e incorporar AuNR dentro dos polibubbles para causar ativação de NIR.

Protocolo

1. Síntese de triacrilato de policalicona (PCLTA)

1. Seque 3,2 mL de 400 Do polycaprolacyone (PCL) triol durante a noite a 50 °C em um frasco traseiro redondo aberto de 200 mL e K₂CO₃ em um frasco de vidro a 90 °C.
2. Misture o triol com 6,4 mL de diclorometano (DCM) e 4,246 g de carbonato de potássio (K₂CO₃) sob argônio.
3. Misture 2,72 mL de cloreto de acriloyl em 27,2 mL de DCM e adicione dropwise à mistura de reação no frasco acima de 5 min.
4. Cubra a mistura de reação com papel alumínio e deixe-a intacta à temperatura ambiente por 24 h sob argônio.
5. Após 24 horas, filtre a mistura de reação usando um papel filtro em um funil Buchner sob vácuo para descartar o excesso de reagentes.
6. Filtragem precipitada a partir da etapa 1.5 que contém o polímero endcapped em éter dietil em um 1:3 (vol/vol) e rotovape a 30 °C para remover o éter dietil.

2. Formação do polibole

NOTA: Injetar polímero na água desionizada (DI) faria com que os polibolhas migrassem para o fundo do frasco, resultando em fundo achatado. Use 10% (wt/vol) celulose carboximetil (CMC) encha o frasco de vidro para evitar o achatamento do polibole.

1. Prepare a solução CMC de 10% (wt/vol) em água DI.
2. Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 0,8 mL de 10% CMC usando uma tubulação de transferência de 1 mL.
3. Misture 1000 mg/mL de 14 kDa PCL em DCM e sintetize PCLTA em um 1:3 (vol/vol) para um volume total de 200 μL ou prepare 200 μL de 1000 mg/mL de 5 kDa poly (ácido lactico-coglicólico) dialílate (PLGADA) em clorofórmio.
4. Misture a mistura 2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona (fotoinitiador) com a mistura de polímero (PLGADA ou PCL/PCLTA) em 0,005:1 (vol/vol).
5. Carregue 200 μL de mistura de polímero em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa que está conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com um diâmetro interno de 0,016 polegadas.
6. Use um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no frasco de 10% CMC no frasco de vidro para formar o polibole.
7. Cure os polibolhas sob ultravioleta (UV) a 254 nm de comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm².
8. O flash congele as polibolhas em nitrogênio líquido e liofilize durante a noite a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.
9. Separe os polibolhas do CMC seco usando fórceps e lave as polibolhas com água DI para remover qualquer CMC residual. Observe que outros polímeros podem ser usados provavelmente com modificações para alterar a cinética de liberação.

3. Modulação do diâmetro do polibole

1. Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 10% cmc usando uma tubulação de transferência de 1 mL.
2. Misture PCL/PCLTA em um 1:3 (vol/vol) com 1000mg/mL 14kDa PCL e sintetize PCLTA. Misture o fotoinitiador com a mistura de polímero em 0,005:1 (vol/vol).
3. Carregue a mistura de polímero em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa que está conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com um diâmetro interno de 0,016 polegadas.
4. Use um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no frasco de 10% CMC no frasco de vidro para formar o polibole.
5. Para obter polibolhas com vários diâmetros, variando a taxa de distribuição de 0,0005 a 1 μL/s.
6. Tire imagens do frasco com os polibolhas com diâmetro variado.
7. Use ImageJ para quantificar o diâmetro dos polibolhas e usar o tamanho do frasco como escala.

4. Centralizando a carga dentro do polibole

1. Modulação da viscosidade PCL/PCLTA utilizando K₂CO₃:
   NOTA: A viscosidade do PLGADA não precisa ser modificada usando K₂CO₃ porque a viscosidade de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL é suficiente para centralizar a carga.
   1. Adicione K₂CO₃ (que foi isolado após a reação do PCLTA) à PCLTA em concentrações variadas, incluindo 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL e 60 mg/mL.
   2. Meça as viscosidades dinâmicas das soluções alterando a taxa de corte de 0 para 1000 1/s usando reometria.
   3. Injete manualmente a carga no meio (consulte a etapa 4.2 para preparar a mistura de carga) dos poliboles que foram formados utilizando as soluções PCL/PCLTA com diferentes concentrações de K₂CO₃ (etapa 4.1.1). Determine a concentração ideal de K₂CO₃ observando qual solução da etapa 4.1.1 pode resultar na retenção da carga no meio.
2. Centralizar a carga (já demonstrada viabilidade com pequenas moléculas) com CMC
   1. Misture a carga com 5% (wt/vol) CMC em um rotador durante a noite para aumentar a viscosidade da carga.
   2. Injete manualmente 2 μL de mistura de carga no polibole e proceda com a cura uv a 254 nm comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm².
   3. O flash congele as polibolhas em nitrogênio líquido para 30 s e liofilize durante a noite a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.
   4. Separe os polibolhas do CMC seco usando fórceps e lave com água DI para remover qualquer CMC residual.
   5. Corte o polibole ao meio e imagem as metades usando microscopia confocal para garantir que a carga esteja centrada (consulte a etapa 6 para excitação e comprimentos de onda de emissão utilizados).

5. Formulação de Carga

NOTA: A formulação de polibolhas pode abrigar vários tipos de carga, incluindo pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucleicos.

1. Com base em estudos anteriores, no caso da carga proteica, utilizam excipientes incluindo polietileno glicol (PEG)⁶, polivinylpyrrolidone (PVP) e glycopolímeros⁶ para melhorar a estabilidade da proteína durante a formulação de poliboco.
2. Formar polibolhas com base no protocolo na etapa 2.
3. Prepare a solução de antígeno adicionando 17,11 g de trehalose a 625 μL de antígeno HIV gp120/41.
4. Injete manualmente 1 μL de solução de antígeno no meio da polibole.
5. Abra os polibolhas nos dias 0, 7, 14 e 21, e regise a fluorescência do antígeno com comprimentos de onda de excitação e emissão de 497 nm e 520 nm, respectivamente.
6. Determine a funcionalidade do antígeno usando o ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e use 5% de leite sem gordura como tampão de bloqueio.

6. Liberação de carga

NOTA: Molécula pequena ou antígeno pode ser usado como o tipo de carga

1. Molécula pequena
   1. Incubar polibolhas com acriflavina centrada em 400 μL de soro fisiológico tampão fosfato (PBS) a 37 °C, 50 °C para poliboles PLGADA e a 37 °C, 50 °C, 70 °C para polibobbles PCL/PCLTA.
      NOTA: A razão pela qual recomendamos testar acima das temperaturas do corpo é a) simular a temperatura (50 °C) na qual o polibole atinge ao laser os nanorods de ouro (AuNRs) dentro de PCL e PLGA; e b) acelerar o processo de degradação da PCL (50 °C, 70 °C).
   2. Em cada ponto de tempo, colete os supernantes e substitua por 400 μL de PBS fresco.
   3. Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos supernantes coletados.
      NOTA: Use ex/em de 416 nm/514 nm para acriflavina.
2. Antígeno
   1. Incubar polibolhas com soro de albumina bovina centrado (BSA)-488 em 400 μL de PBS a 37 °C, 50 °C para poliboles PLGADA e a 37 °C, 50 °C para poliboles PCL/PCLTA.
   2. Em cada ponto de tempo, colete os supernantes e substitua por PBS fresco de 400 μL.
   3. Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos supernantes coletados. Use ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488.
      NOTA: O estudo de liberação a 70 °C para polibolhas PCL/PCLTA não deve ser realizado para evitar expor o antígeno a temperatura extrema.

7. Toxicidade

1. Quantificando o teor de cloro em polibolhas usando a análise de ativação de nêutrons (NAA)
   1. Use polibolhas que foram liofilizadas para 2, 4, 6, 20 e 24 h para este estudo a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.
   2. Meça 5-9 mg de polibolhas e coloque-as em frascos de irradiação LDPE.
   3. Prepare 1000 g/mL de solução de calibração de cloro do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) solução de calibração rastreável.
   4. Use 1-megawatts reator Triga para realizar irradiações de nêutrons em cada amostra a uma taxa de fluência de nêutrons de 9,1 × 10¹² /cm²·s para 600 s.
   5. Transfira os polibolhas para frascos unirradiados.
   6. Use o detector HPGe para obter espectros de raios gama para 500 s após intervalos de decomposição de 360 s.
   7. Use o software NAA pelas Indústrias Canberra para analisar os dados.
2. Quantificando o teor de cloro liberado de polibolhas usando NAA
   1. Incubar polibolhas que foram liofilizadas durante a noite (a 0,010 mBar vácuo e a -85 °C) em 400 μL de PBS a 37 °C.
   2. Colete os supernantes nas semanas 1, 2 e 3 após a incubação.
   3. Analise os supernantes para teor de cloro usando NAA usando o mesmo método descrito acima na etapa 7.1.

8. Síntese AuNR por Kittler, S., et al.⁸

1. Prepare a solução de sementes AuNR misturando 250 μL de ácido cloroaurico de 10 mM (HAuCl₄), 7,5 mL de brometo de cetrimonium de 100 mM (CTAB) e 600 μL de boroidido de sódio frio de 10 mM (NaBH₄).
2. Prepare a solução de crescimento misturando 40 mL de 100 mM CTAB, 1,7 mL de 10 mM HAuCl₄, 250 μL de nitrato de prata (AgNO_3),e 270 μL de ácido ascórbico de 17,6 mg/mL a um tubo.
3. Misture vigorosamente 420 μL de solução de sementes com a solução de crescimento a 1200 rpm por 1 min. Em seguida, deixe a mistura imperturbável para reagir por 16 h.
4. Remova o excesso de reagentes da mistura centrifugando a 8000 × g por 10 min e descarte o supernasce.

9. Hidroofobização de AuNRs por Soliman, M.G., et al.⁹

1. Ajuste o pH de 1,5 mL de AuNRs estabilizados ctab sintetizados para 10 usando hidróxido de sódio de 1 mM (NaOH).
2. Mexa a solução com 0,1 mL de 0,3 mM de tido PEG metilado (mPEG) a 400 rpm durante a noite.
3. Misture AuNRs LCslilated com 0,4 M de dodecylamina (DDA) em clorofórmio a 500 rpm por 4 dias.
4. Encanar a camada orgânica superior contendo AuNRs hidrofóbicas e armazenar a 4 °C até o uso futuro.

10. Ativação nir de polibolhas

1. Misture a solução de polímero (PLGADA ou PCL/PCLTA) com AuNRs hidrofóbicas em um 1:9 (vol/vol).
2. Adicione fotoinitiador à mistura polímero-AuNR em um 0,005:1 (vol/vol).
3. Formar polibolhas injetando a mistura polímero-AuNR em um frasco de vidro de 0,92 mL com 10% CMC (wt/vol) (consulte o passo 2).
4. Cure os polibolhas a 254 nm de comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm².
5. O flash congele em nitrogênio líquido para 30 s e liofilize durante a noite a 0,010 mBar vácuo e a -85 °C.
6. Separe os polibolhas secas usando fórceps e lave com água DI para remover qualquer CMC residual.
7. Incubar as polibolhas em 400 μL de PBS a 37 °C.
8. Ative as polibolhas usando laser NIR de 801 nm a 8A por 5 minutos todas as segundas, quartas e sextas-feiras.
9. Pegue imagens infravermelhas prospectivas (FLIR) do polibole antes e depois da ativação do laser para obter valores de temperatura.
10. Calcule as diferenças de temperatura entre antes e depois da ativação do laser com base nos valores de temperatura das imagens FLIR.

Resultados

Os polibolhas foram amplamente caracterizados por MEIO DE SEM e NAA. A carga foi centrada com sucesso para resultar em uma liberação de explosão atrasada. Os polibolhas também foram ativados com sucesso a laser devido à presença de AuNRs dentro dos polibolhas.

Caracterização de poliboles
Os polibolhas injetados em uma solução aquosa sem CMC resultaram em um polibole achatado devido ao seu contato co...

Discussão

Tecnologias e desafios atuais
Micro e nanopartículas baseadas em emulsão têm sido comumente usadas como portadores de medicamentos. Embora a cinética de liberação da carga desses dispositivos tenha sido extensivamente estudada, controlar a cinética de liberação de rajadas tem sido um grande desafio¹¹. A versatilidade e funcionalidade da carga também é limitada em sistemas baseados em emulsão devido à exposição da carga a solventes aquosos e orgânicos em excesso....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010