Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

Resumo

Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.

Resumo

A otimização de bioprocessos para aumentar o rendimento dos produtos desejados é de importância na indústria biofarmacêutica. Isso pode ser alcançado através da seleção de cepas e do desenvolvimento de parâmetros de bioprocesso. Frascos de agitação foram usados para este fim. Eles, no entanto, não têm a capacidade de controlar os parâmetros do processo, como pH e oxigênio dissolvido (DO). Essa limitação pode ser superada com a ajuda de um micro-bioreator automatizado. Estes bioreatores imitam o cultivo em uma escala maior. Uma das principais vantagens deste sistema é a integração do Design of Experiment (DOE) no software. Essa integração permite estabelecer um projeto onde vários parâmetros de processo podem ser variados simultaneamente. Os parâmetros críticos do processo e as condições ideais de bioprocesso podem ser analisados dentro do software. O foco do trabalho aqui apresentado é introduzir o usuário às etapas envolvidas na concepção do processo no software e incorporação do DOE dentro da corrida de cultivo.

Introdução

O mercado biofarmacêutico global valia mais de US$ 250 bilhões em 2018 e vem continuamente expandindo¹. As empresas farmacêuticas estão se afastando da produção de pequenos fármacos moleculares para terapêuticas biotecnológicas, como proteínas recombinantes. Só estes são responsáveis por uma receita de mais de US $ 150 bilhões¹. As células dos mamíferos são agora amplamente utilizadas para a produção dessas proteínas farmacêuticas recombinantes. No período atual, dos 68 produtos aprovados produzidos por células de mamíferos, 57 são produzidos por células chinesas de ovário hamster (CHO)². As células CHO são especificamente utilizadas para a produção de proteínas recombinantes que requerem modificações pós-translacionais. Estas células são preferidas à medida que crescem em uma suspensão e, assim, permitem resultados reprodutíveis em um meio quimicamente definido quimicamente^{livre 3,4}. A outra vantagem do uso de células CHO é que a estrutura glicana do produto se assemelha à do anticorpo monoclonal humano (mAb) e resulta em maior rendimento de proteína recombinante e produtividade específica devido à amplificação genética⁵.

O rendimento da cultura celular recombinante CHO (rCHO) aumentou cem vezes nas últimas duas décadas. Essa melhora é atribuída à otimização dos parâmetros do processo, à estratégia de alimentação e ao desenvolvimento do meio quimicamente definido quimicamente⁶. Com o aumento das exigências dos produtos farmacêuticos, a pressão aumenta sobre o custo e a eficiência de tempo para o desenvolvimento do processo produtivo⁷. Reduzir a pressão e, ao mesmo tempo, garantir a qualidade do produto redirecionou o foco da indústria farmacêutica em Qualidade por Design (QbD). O QbD é usado para entender a produção do produto, bem como o processo. Uma ferramenta vital usada no ObD é o Design of Experiment (DOE). Ele ajuda a aumentar a compreensão do processo, revelando a relação entre várias variáveis de entrada e dados de saída resultantes. A aplicação da abordagem do DOE para otimizar o bioprocesso é benéfica durante os estágios iniciais do projeto na assimilação das condições do processo e aumento da quantidade e qualidade do título. Essa abordagem é benéfica quando comparada com a estratégia antiquada: um fator de cada vez (OFAT). As abordagens estatísticas do DOE usando Classic, Shainin ou Taguchi são muito superiores ao OFAT⁸.

O processo e a otimização da mídia podem ser realizados em frascos de shake. Os frascos são relativamente baratos. No entanto, não é possível controlar parâmetros como temperatura, pH e oxigênio dissolvido (DO). Para superar essas desvantagens, podem ser utilizados bioreatores multiuso de bancada que variam de volume de trabalho de 0,5 L a 5 L. Os reatores fornecem um extenso monitoramento on-line e controle de processos. No entanto, o uso do bioreator multiuso é de tempo e trabalho intensivo. Para superar essas desvantagens, um novo bioreator de uso único que combina o processo abrangente de monitoramento do bioreator de bancada e fácil manuseio do frasco de shake é usado. O sistema de triagem de alto rendimento e a tecnologia de uso único contribuíram para aumentar a eficiência do desempenho e desenvolvimento do processo⁹.

Neste artigo, estão listadas as diretrizes para carregar a receita no software automatizado de micro-bioreator (AMBR). A influência de diferentes velocidades de agitador e pH na concentração celular viável (VCC) e título é estudada durante este experimento. O resultado experimental e a análise são realizados com o projeto do software de experimento MODDE 12. A análise do produto é realizada em um sistema de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com uma coluna de proteína A. Baseia-se no princípio de que a região Fc do mAb se liga à proteína A com alta afinidade^10,11. Com este método, é possível identificar e quantificar o mAb. A quantificação é realizada sobre as áreas de pico de elução medidos em 280 nm.

Protocolo

1. Procedimento de pré-cultura

NOTA: Células COD44 recombinantes com uma concentração celular viável de 1 x 10⁷ células/mL são usadas para este protocolo.

1. Descongele o frasco contendo 1,2 mL de células à temperatura ambiente e transfira imediatamente a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL contendo 10 mL de meio de semente sinuosa.
2. Centrifugar o tubo cônico de centrífuga por 5 minutos a 190 x g e temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
3. Pré-calor 150 mL do meio de sementes em um frasco de shake de 500 mL a 36,8 °C.
4. Refira suavemente a pelota celular em 10 mL de meio de semente pré-aquecido e transfira as células para o frasco de shake.
5. Use 1 mL da amostra do frasco para medir o VCC inicial e a viabilidade usando um contador celular.
   NOTA: A viabilidade deve ser superior a 70% após o descongelamento para o cultivo bem sucedido.
6. Incubar o frasco de shake em um agitador orbital (diâmetro do agitador de 19 mm) a 36,8 °C e 7,5% de CO₂ com uma taxa de agitação de 120 rpm.
   NOTA: Essas condições variam dependendo da tensão celular e do meio.
7. Três dias depois de passar pelas células, remova o frasco de shake do agitador e coloque-o sob o armário de fluxo laminar. Tome 1 mL de amostra para medir a concentração celular final. Calcule o volume a ser transferido para o meio de sementes pré-aquecidas frescos de tal forma que a concentração celular inicial na nova passagem seja de 2 x 10⁵ células/mL.
8. Passe as células 5 vezes no total antes de transferir para o bioreator para o cultivo principal.

2. Cultivo principal

1. Meça a concentração celular final da pré-cultura. Calcule o volume a ser transferido para o bioreator de forma que a concentração celular inicial no reator seja de 3 x 10⁵ células/mL.
2. Encha o reator com meio de produção um dia antes da inoculação para equilibrar o reator e defina os parâmetros do processo, como temperatura, pH e DO.
   NOTA: As condições de cultivo são de 36,8 °C e 60% de concentração de oxigênio dissolvido (DO). Testamos velocidades de agitação de 1050 rpm e 1300 rpm, juntamente com pHs de 6,9, 7,1 e 7,3. A duração total do cultivo é de 12 dias até que as células sejam colhidas. O processo de lote dura 72 horas após o qual o meio de alimentação é adicionado a cada 24 horas. O protocolo a ser utilizado para o cultivo está listado detalhadamente no próximo segmento.

3. Escrever a Receita no Software Automatizado de Micro-bioreator

NOTA: Existem duas maneiras de escrever uma receita no software de cultura celular AMBR: ele é criado usando um assistente ou adicionando cada passo manualmente. Para o propósito deste protocolo, as etapas que usam o assistente são mostradas.

1. Criando um novo experimento
   1. Abra o software de cultura de células AMBR e na guia Introdução clique em Criar novo experimento.
2. Carregando a receita
   1. Na guia Novo Experimento, digite o nome do experimento junto com a data em que será realizado.
      1. Ative o ponto de verificação para que a estação de cultura e os vasos sejam utilizados durante o cultivo. As Tags DoE do Auto Add também serão ativadas para uma transição fácil durante a programação do experimento DOE. Clique em Next para mudar para a próxima guia.
   2. Defina informações sobre a adição de mídia no vaso juntamente com antiespuma, inóculo, ração e glicose.
      1. Ative o ponto de verificação Adicionar placa de mídia. Defina o tipo de placa, nome e localização da placa que contém o meio.
         ATENÇÃO: Dependendo do tipo de placa e se a placa contiver uma tampa, ative a verificação em Is Lidded para garantir o bom funcionamento do manipulador líquido
      2. Clique em Adicionar mídia aos vasos. Digite o volume da mídia a ser adicionada aos vasos. Defina o mapeamento da transferência da mídia da placa para os vasos. Clique em Next para mudar para a próxima guia.
   3. Defina as condições de cultivo no reator.
      1. Depois que as informações da mídia forem alimentadas no software, atribua as condições de cultivo. Clique em Condition Media e preencha a temperatura, target DO, limite superior de pH e RPM de agitação (Up stirring ou Down stirando).
   4. Coloque adição de inóculos nos vasos.
      1. Ativar adicionar placa de célula. Defina o tipo de placa, nome e localização da placa que contém o meio.
      2. Clique em Adicionar células aos vasos. Digite o tempo de inoculação e o volume da mídia a ser adicionada aos vasos.
      3. Defina o caminho percorrido pelo manipulador líquido para a transferência da célula da placa para os vasos. Clique em Next para mudar para a próxima guia.
         NOTA: Certifique-se de que as pontas da pipeta de reutilização estão desativadas para evitar contaminação cruzada e concentração incorreta de células viáveis inativas.
   5. Defina adição de ração, glicose e antiespuma.
      NOTA: O procedimento para adição de ração, glicose e antiespuma é semelhante ao outro. Para o bem deste protocolo, o procedimento está listado para "Feed". Isto pode ser replicado para glicose e antiespuma.
      1. Ative a placa de alimentação de adicionar e defina o tipo, nome e local da placa. Clique em Adicionar alimentação aos vasos e digite o volume da alimentação a ser adicionada aos vasos. Defina o mapeamento da transferência da alimentação da placa para os vasos.
      2. Dependendo do cultivo, adicione o número de adição de ração. Para este cultivo, o reator é alimentado após 72 horas para cada 24 horas.
      3. Adicione manualmente o atraso de tempo entre a alimentação inserindo os dados em Atraso das células adicionadas. O primeiro dia de alimentação é depois de 72 horas de inoculação e o próximo é depois de 96 horas e assim por diante.
         NOTA: A adição de antiespuma é programada para ser adicionada todos os dias para evitar espuma durante o cultivo.
   6. Defina a amostragem durante o cultivo.
      1. Ative a placa de amostra adicionar e defina o tipo, nome e local da placa.
      2. Verifique a Amostra de Vasos e insira o volume da amostra a ser removida dos vasos. Defina o mapeamento da transferência da amostra dos vasos para a placa. Certifique-se de que o volume não diminua abaixo de 10 mL durante todo o período de cultivo.
      3. Adicione o número de amostras a serem colhidas durante o cultivo. Semelhante à alimentação, adicione o tempo da amostra a ser removida do vaso para cada ponto de amostra de entrada.
   7. Salve o processo. Agora está pronto para execução.
      NOTA: Para garantir o bom funcionamento do protocolo, mude para a guia Passos do processo no software de cultura de células AMBR e selecione A exibição passo de processo para visualizar o fluxo da receita.
3. Projeto de experimento no micro-bioreator automatizado
   1. Para executar o software DOE do bioreator, certifique-se de que a receita no software principal esteja salva e pronta para uso.
   2. Abra o software AMBR 15 DOE e clique em Investigação e selecione Novo.
      1. Digite o nome da nova investigação do DOE na caixa de diálogo Criar investigação.
      2. Para atribuir um experimento à investigação do DOE, abra a receita criada para estudar os diferentes parâmetros. Clique em Procurar e selecione o respectivo experimento.
   3. Defina o fator DOE.
      1. As etiquetas da nave já estão alistadas na coluna. Para definir o fator DOE desejado, selecione o parâmetro e clique na coluna rotulada fator DOE. Selecione Novo e adicione as unidades, abreviação, limite inferior e superior dos fatores (por exemplo, temperatura, DO, pH).
   4. Defina o fator de resposta.
      1. Uma vez definidos os fatores do DOE, defina a resposta com base na qual a análise experimental seria estruturada.
      2. Na guia Respostas, defina os valores a serem considerados para a análise dos dados.
      3. Clique em Editar respostas do doe e definir o nome da resposta, abreviação, unidades, limites mínimos e máximos (por exemplo, título, concentração celular viável).
      4. Uma vez definidas as respostas, selecione a variável AMBR para cada resposta e defina a variável. Uma resposta pode ser automaticamente associada a uma variável micro-bioreator, escolha a variável necessária na lista de queda.
      5. Altere a equação para cada uma das respostas dependendo do requisito. A escolha é entre os dados mínimo, máximo, primeiro, último e médio.
   5. Crie um projeto.
      1. Use o Assistente de Design inicial para selecionar o tipo de design experimental, para adicionar ou remover o número de réplicas e pontos centrais.
      2. Selecione o objetivo, que determina a escolha dos designs e modelos:
         Triagem: Utiliza modelos lineares e de interação para encontrar os fatores importantes
         Otimização (RSM), utiliza modelos quadráticos e cúbicos para modelagem e otimização detalhadas
         Objetivo dividido: Modelos para formulação e fatores de processo podem ser escolhidos separadamente
      3. Uma vez decidido o objetivo, selecione o modelo e o design, juntamente com o número de pontos centrais e réplicas.
      4. Clique em Terminar e mude para a próxima guia.
   6. Defina o experimento.
      NOTA: Os fatores DOE estão listados na coluna direita do software. Ao selecionar os fatores desejados, os vasos que executam esse experimento com o parâmetro desejado seriam destacados. Os vasos dentro da estação de cultura podem ser movidos clicando com o botão direito do mouse sobre o vaso e movendo-o para o local desejado.
      1. Crie pacotes de trabalho que podem ser importados no software de cultura de células AMBR. Dependendo do número de experimentos, os diferentes pacotes de trabalho são criados e armazenados para posterior implementação
4. Execução do experimento nos pacotes de trabalho criados no laptop de controle AMBR
   1. Na guia Experimento, clique em Criar experimento dodo e navegue pelo pacote de trabalho criado usando o software DOE.
   2. Inicialize o processo clicando em Iniciar.
5. Análise de resultados experimentais
   1. Uma vez executado o experimento, exporte os dados usando resultados do DOE de exportação. A janela Resultados do DOE de Exportação abre e as linhas que indicam o navio de cultura e a estação estão listadas na tabela.
   2. Selecione as linhas desejadas e clique em Linhas selecionadas exportadas ou exportar dados experimentais para armazenar todos os resultados e salvar o arquivo para análise suplementar.
   3. Importe os dados para o módulo AMBR DOE, alternando para a guia Resultados e selecionando Resultados de Importação.
   4. Procure o arquivo de dados desejado e clique nos resultados de análise.
   5. Analise os resultados ainda mais no MODDE.

4. Execução do Cultivo no Micro-bioreator Automatizado

NOTA: As etapas a seguir são executadas pelo usuário com a ajuda do protocolo escrito no software acima mencionado. As etapas são realizadas pelo usuário, a menos que seja mencionado o contrário.

1. Carregando os navios
   1. Abra os vasos de cultura esterilizados gama sob um armário de fluxo laminar e oriente na estação de cultura como retratado na Figura 2.
   2. Limpe a placa de grampo com 70% de etanol e água destilada dupla. Em seguida, autoclave a placa e coloque em cima do vaso.
   3. Monte a placa de fixação com uma placa de agitador, garantindo que cada pino esteja fixado firmemente.
   4. Aperte a placa do agitador e a placa de fixação no conjunto de agitação.
2. Executando o software de micro-bioreator
   1. Use o programa escrito na Seção 3 para executar o cultivo.
   2. Visualize as etapas do processo agendadas ou concluídas na guia Processo. Altere as etapas de cultivo durante o processo executado conforme necessário, primeiro pausando o manipulador líquido e, em seguida, editando a receita do processo.
   3. Adicione antiespuma aos vasos antes que o agitador seja iniciado para garantir que não haja espuma excessiva durante o cultivo. A antiespuma será adicionada regularmente, e a espuma detectada visualmente.
3. Adição de mídia no navio
   1. Encha a placa de 24 poços fornecida com os micro-bioreatores manualmente com mídia estéril e coloque no convés designado do sistema. Certifique-se de que a placa está colocada no convés designado pelo programa escrito (seção 3). O enchimento do vaso ocorrerá conforme projetado na seção 3.2.2.
      NOTA: A temperatura e o agitador começam imediatamente após a adição da mídia e da antiespuma. O leitor de sensores é ativado 1 hora após o preenchimento do vaso (passo start monitor). O gaseamento para cada nave começa assim que o leitor for ativado. A mídia é deixada para equilibrar por um mínimo de 6 horas antes da recalibração e inoculação do pH. Os parâmetros do processo podem ser alterados no software, conforme mencionado na seção 3.2.3.
4. Inoculação
   1. Meça a concentração celular viável após a^5ª passagem. Calcule o número de células a serem transferidas para os vasos para garantir que a concentração celular inicial em todos os vasos seja de 3 x 10⁵ células/mL.
   2. Transfira as células para uma placa de poço de 24 profundidades de tal forma que o volume da suspensão seja pelo menos 1,6 vezes o volume necessário. Para um volume necessário de 2 mL do inóculo, transfira 3,2 mL de suspensão celular para cada poço na placa.
   3. Coloque a placa de 24 poços no convés designado. Os vasos serão inoculados como na seção 3.2.4.
5. Amostragem e análise diárias
   1. Remova uma amostra de 460 μL dos vasos todos os dias usando o manipulador líquido. Diluir 200 μL da amostra com 800 μL de tampão 1x PBS filtrado (diluição 5x) e, em seguida, colocar no contador celular.
   2. Centrifugar a amostra restante para 5 minutos a 190 x g e temperatura ambiente e armazenar o sobrenadante para análise posterior (glicose, lactato, glutamina e glutamato).
   3. Congele 100 μL do sobrenadante a -20 °C até o final do cultivo para quantificação de proteínas.
6. Fim do cultivo
   1. Quando o controle do parâmetro do processo (ou seja, temperatura, agitação, pH e DO) tiver terminado, interrompa o monitoramento do processo.
   2. Desaparafusar a placa do agitador e a placa do grampo.
   3. Remova os vasos de cultura e limpe as estações de cultura. Coloque as placas de secagem nas estações de cultura e enrosque-as.
   4. Enquanto isso, limpe bem as placas de grampo com 70% de etanol e água destilada dupla.
   5. Clique em Parar no software do bioreator assim que o ciclo de secagem estiver concluído.
7. Colheita de cultura celular
   1. Colher células no dia 12 do cultivo, removendo manualmente o conteúdo dos vasos em tubos de centrífuga de 50 mL. Centrifugar o caldo celular a 190 x g por 30 min.
   2. Descarte a pelota de célula e armazene o sobrenadante a -20 °C.

5. Medição da concentração de mAb

1. Use uma coluna de proteína A de 1,7 mL para a quantificação da proteína durante a corrida de cultivo.
2. Prepare o tampão de equilíbrio e elução antes de descongelar as amostras.
   1. Utilize uma solução de 0,5 M Na₂HPO₄ contendo 0,5 M NaCl com um pH de 7.9 como tampão de equilíbrio e uma solução de glicina de 100 mM contendo 0,5 M NaCl com um pH de 2 como tampão de elução.
3. Filtrar ambos os buffers através de uma membrana de 0,2 μm e degas antes de serem colocados para análise.
4. Expurifique o sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com tampão de equilíbrio recém-preparado.
5. Carregue a coluna de proteína A no sistema HPLC.
6. Realize cromatografia com vazão de 1 mL/min. Coloque a temperatura do forno da coluna a 30 °C e a temperatura do autosampler a 10 °C
7. Descongele as amostras congeladas à temperatura ambiente e filtre 225 μL de cada amostra através de uma membrana PVDF de 0,22 μm. Diluir as amostras com maior concentração da proteína desejada estão em uma razão de 1:20 com tampão de equilíbrio e filtrar através da membrana antes de colocar no autosampler.
8. Coloque as amostras no amostrador automático. Carregue o método e a seqüência no software e inicie a seqüência.
   NOTA: O método é composto por três fases (ver Figura 1): injeção da amostra na coluna durante os dois primeiros minutos; seguido por tampão de elução para 8 min e regeneração de coluna com tampão de equilíbrio por 10 min.

Figura 1: Cromatograma proteino A, representando as diferentes fases durante uma única corrida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Uma visão geral do cultivo realizado neste estudo é apresentada na Figura 2.

Figura 2: Representação esquemática das condições experimentais para testar perfis de pH e velocidade de agitador nas estações de cultura. A figura também representa o layout correto para colocar os vasos.

Discussão

A otimização do processo para aumentar o rendimento é de fundamental importância na indústria biofarmacêutica. Frascos de agitação poderiam potencialmente ser usados para a triagem da cepa; no entanto, o monitoramento dos parâmetros do processo, como pH e DO, não está disponível nos frascos. Os micro-bioreatores têm uma vantagem, pois permitem o monitoramento contínuo e o controle do processo. Esses laços de controle no micro-bioreator também fornecem uma condição semelhante àquelas em maior escala e, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL disposable pipette tips, sterilized	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0040
200 mM L-glutamine	Corning, Merck	25-005-CV
24 Well deep well plates	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0038
5 mL disposable pipette tips, sterilized	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0039
ambr 15 automated microbioreactor system	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-2804
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-1B86
Antifoam C Emulsion	Sigma-Aldrich, Merck	A8011
Bottle Top Sterile filter	Corning, Merck	CLS431474	0.1 μm pore size
CEDEX Detergent (3% Mucosol)	Roche Innovatis AG	05-650-658-001
Cell counter	Roche Innovatis AG	05-650-216-001	CEDEX HiRes
CHO DG44 cell line	Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80026
CHOKO Production Medium	Sigma-Aldrich, Merck	CR80027
CHOKO Stock Culture Meium	Sigma-Aldrich, Merck	CR80028
Chromaster high pressure liquid chromatography system	VWR International
Conical Centrifuge tube	Corning, Merck	SIAL0790
Ethanol	Merck	1070179026
Glycine	Carl Roth	56-40-6
HPLC Vials	VWR International	SUPLSU860181
PBS	Sigma-Aldrich,Merck	P4417
Protein A Column	Thermo Fisher Scientific	1502226	POROS™ A 1.7 mL
Sodium chloride	Sigma-Aldrich,Merck	7647-14-5
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Sigma-Aldrich,Merck	7558-79-4
Trypan Blue	VWR International	VWRVK940
YSI	YSI Inc	2900D	YSI 2900 Select