Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides

Resumo

Este protocolo explica como coletar neurônios únicos, microglia e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão e especificidade anatômica usando microdissecção de captura a laser. Além disso, explicamos nosso uso de RT-qPCR microfluido para medir um subconjunto do transcriptome dessas células.

Resumo

A heterogeneidade transcricional profunda em células únicas anatomicamente adjacentes sugere que a funcionalidade robusta do tecido pode ser alcançada pela diversidade de fenótipo celular. Experimentos de células únicas que investigam a dinâmica da rede de sistemas biológicos demonstram respostas celulares e teciduais a várias condições em resolução biologicamente significativa. Aqui, explicamos nossos métodos para coletar células únicas de locais anatomicamente específicos e medir com precisão um subconjunto de seus perfis de expressão genética. Combinamos a microdissecção de captura a laser (LCM) com a transcrição reversa microfluida quantitativa de reações em cadeia de polimerase (RT-qPCR). Também usamos esta plataforma microfluida RT-qPCR para medir a abundância microbiana de conteúdo intestinal.

Introdução

Medir os perfis de expressão genética de células únicas demonstrou extensa heterogeneidade ferotípica dentro de um tecido. Essa complexidade complicou nossa compreensão das redes biológicas que regem a função tecidual. Nosso grupo e outros têm explorado esse fenômeno em muitos tecidos e condições^1,2,3,4,5,6. Esses experimentos não apenas sugerem que a regulação das redes de expressão genética sustenta tal heterogeneidade, mas também que a resolução de células únicas revela uma complexidade na função tecidual que a resolução do nível tecidual não aprecia. De fato, apenas uma pequena minoria de células pode responder a uma condição ou desafio específico, mas o impacto dessas células na fisiologia global pode ser substancial. Além disso, uma abordagem de biologia do sistema que aplica métodos multivariados a conjuntos de dados de alta dimensão de vários tipos e tecidos celulares pode elucidar efeitos de tratamento em todo o sistema.

Combinamos LCM e RT-qPCR microfluido para obter tais conjuntos de dados. Nós tomamos esta abordagem aqui em contraste com a coleta de células únicas através da triagem celular ativada por fluorescência (FACS) e usando sequenciamento de RNA (RNA-seq) para medir sua transcrição. A vantagem do LCM sobre o FACS é que a especificidade anatômica exata das células únicas pode ser documentada com LCM, relativamente e absolutamente. Além disso, enquanto o RNA-seq pode medir mais características que RT-qPCR, microfluido RT-qPCR é menos caro e tem uma sensibilidade e especificidade mais elevadas⁷.

Neste experimento representativo, investigou-se os efeitos da dependência opióide e da retirada de opióides precipitados de naltrexona na expressão genética neuronal, microglia e astrócito de ratos no núcleo central da amígdala (ACE) e da abundância da microflora intestinal⁴. Foram analisados quatro grupos de tratamento: 1) Placebo, 2) Morfina, 3) Naltrexona e 4) Retirada (Figura 1). Descobrimos que a dependência de opióides não alterou substancialmente a expressão genética, mas essa retirada de opióides induziu a expressão de genes inflamatórios, tnf em particular. Os astrócitos foram o tipo de célula mais afetada. O microbioma intestinal foi profundamente impactado pela retirada de opióides, como indicado por uma diminuição na relação Firmicutes para Bacteroides, que é um marcador estabelecido de disbiose intestinal^8,9.

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Comitê de Cuidados e Uso animal (IACUC) da Universidade Thomas Jefferson e da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel. O protocolo foi aprovado pela Universidade Thomas Jefferson e pela Drexel University College of Medicine IACUC.

1. Modelo animal

1. Insira duas pelotas de sulfato de morfina de liberação lenta de 75 mg ou duas pelotas de placebo subcutâneas em ratos machos adultos sprague-Dawley.
   1. Use um vestido e luvas apropriadamente para uma pequena cirurgia estéril. Raspe o dorsum de rato com cortadores, se necessário.
   2. Aplique pomada veterinária nos olhos do animal. Anestesiar o rato com aproximadamente 20 s de inalação de isoflurano. A anestesia é confirmada pela perda de consciência.
   3. Faça uma incisão midline no dorsum de rato com uma tesoura sem corte esterilizada por contas e separe a derme da parede do corpo com uma sonda esterilizada por contas. Insira as pelotas a derme com fórceps esterilizados por talas. Suturar a incisão fechada com uma agulha estéril.
      NOTA: Todo o procedimento leva cerca de 5 min por rato. Luvas estéreis frescas são usadas para cada rato.
   4. Coloque o rato em uma gaiola de isolamento para recuperação pós-cirúrgica. Verifique se há batimentos cardíacos e ritmo respiratório regular. Observe o rato até que a consciência seja recuperada. Avalie para dor pós-cirúrgica.
   5. Avalie os ratos 8h após a cirurgia e a cada 12 h após a recuperação e infecção. Coloque os ratos em uma gaiola com o resto da coorte quando estiverem totalmente recuperados da cirurgia, cerca de 24h após a cirurgia.
2. Injeina naltrexona intraperitoneal (75 mg/kg) às coortes G e de Retirada após 6 dias de exposição à morfina.
   NOTA: Havia quatro coortes de ratos neste experimento representativo (ver Figura 1).

2. Colheita de amostras

1. Colher o cérebro 6 dias após a inserção da pelota ou 24 h após a injeção de naltrexona.
   1. Coloque o animal em uma câmara de isoflurano por aproximadamente 30 s ou até que ocorra perda de consciência, indicada pela falta de movimento e diminuição da taxa respiratória.
   2. Use uma guilhotina afiada para decapitar rapidamente o animal.
   3. Disseque o cérebro do crânio do animal.
   4. Use uma navalha afiada para fazer as seguintes incisões brutas ao cérebro removido: Primeiro, corte o cerebelo e descarte. Segundo, separe o tronco cerebral do antecérebro com uma incisão transversa. Em terceiro lugar, hemisecte o antecérebro e/ou tronco cerebral com uma incisão sagital média.
   5. Coloque o cérebro e o tronco cerebral em um molde plástico de incorporação de tecido com 3-4 cm de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na parte inferior do molde. Cubra o resto da amostra com OCT.
   6. Coloque imediatamente o molde de incorporação de tecido plástico com a amostra coberta com OCT em um banho contendo gelo seco e metanol. Não deixe o metanol derramar no molde de incorporação de tecido. Mantenha o molde de incorporação com a amostra cerebral no banho de metanol-gelo até que a coleta de tecidos esteja concluída (~10-15 min no máximo).
   7. Coloque a amostra cerebral em um congelador de -80 °C o mais rápido possível.
2. Colher as amostras intestinais simultaneamente.
   1. Após a rápida decapitação, faça uma incisão média no abdômen do animal com um bisturi.
   2. Encontre o ceco e seque sua conexão com o cólon ascendente.
   3. Espremer o conteúdo cecal em um tubo cônico de 15 mL.
   4. Coloque imediatamente o tubo cônico sobre gelo seco e coloque em um congelador de -80 °C o mais rápido possível.
      NOTA: O conteúdo do intestino delgado também pode ser coletado usando os mesmos métodos de um controle negativo.

3. Fatiamento

1. Corte o antecérebro de rato hemissiesado usando um criostato.
   1. Remova o molde de incorporação de plástico com o antecérebro do congelador -80 °C e coloque em um criostato de -20 °C.
   2. Remova a amostra hemisecenizada do cérebro hemisecção embutida oct do molde de incorporação. Use uma navalha para cortar os cantos do molde de incorporação de plástico verticalmente, se necessário. Monte o antecérebro para corte coronal caudal em um mandril criostato usando OCT.
      NOTA: Os marcos anatômicos para identificar o CeA incluem o trato óptico e o terminalis de estria(Figura 2B). O trato óptico se ramifica do quiasma óptico e rastreia dorsal-lateral como o cérebro é cortado rostral para caudal. Quando o trato óptico tem uma morfologia semelhante ao que é visto em um atlas cerebral de ratos bregma -2,12 mm¹⁰, as fatias de teste podem ser vistas um microscópio. O trato óptico e a morfologia do terminal istria podem ser verificados em um atlas cerebral de ratos¹⁰ para identificar o bregma e se o CeA circunda os terminais de estria.
   3. Corte seções coronais de 10 μm de espessura do cérebro hemiso torto rostral até caudal até que seções contendo o CeA sejam atingidas.
      NOTA: A largura e a altura das seções são de aproximadamente 200 mm.
   4. Coletar seções de 10 μm contendo o CeA, ou a região cerebral preferida, descongelando seções de 10 μm em lâminas de vidro simples. Coloque imediatamente o vidro desliza sobre uma panela de metal apoiada em gelo seco. Coloque as lâminas com seções cerebrais em um congelador de -80 °C o mais rápido possível.
      NOTA: Várias fatias podem ser colocadas no mesmo slide. Se usar uma mancha de tipo de célula diferente para fatias no mesmo slide, deixe cerca de 100 mm entre as fatias para que uma caneta hidrofóbica possa ser usada para separar soluções de anticorpos específicas do tipo celular no slide. Deixe cerca de 20 mm da borda do escorregador em cada lado da fatia.

4. Coloração de imunofluorescência

1. Manche as seções do cérebro para a célula cerebral escolhida (por exemplo, neurônio, microglia, astrócito, etc.) usando imunofluorescência.
   1. Remova um ou mais slides com seções de 10 μm do CeA do congelador -80 °C.
   2. Fixar as lâminas com 75% de etanol para 30 s. Remova o excesso de líquido.
   3. Bloqueie as fatias para 30 s com 2% de antígeno sérico bovino (BSA) em 1x soro de tampão fosfato (PBS). Lave 1x com PBS.
   4. Adicione uma solução primária de anticorpos ao slide por 2 min. Lave 1x com 2% de solução BSA.
      NOTA: A solução primária de anticorpos é composta por 2% de anticorpo primário, 1% de RNase Out e 96% da mesma solução BSA PBS para o passo de bloqueio acima (passo 4.1.3). O experimento representativo utilizou um anticorpo anti-NeuN, um anticorpo anti-Cd11β e um anticorpo anti-GFAP nas seguintes quantidades: 3 μL de principal, 1,88 μL de inibidor de RNA e 145,12 μL de solução BSA.
   5. Adicione a solução de anticorpos secundárias ao slide por 3 min. Lave 1x com PBS.
      NOTA: A solução de anticorpos secundários é composta por 1 μL de cabra anti-mouse 488 nm de marca fluorescente (1:500), 2,5 μL de inibidor de RNA, 1,3 μL de DAPI (1:10.000) e 196,5 μL de 2% de BSA.

5. Série de desidratação de etanol e xileno

1. Mergulhe os slides em 75% de etanol para 30 s. Logo em seguida, mergulhe os slides em 95% de etanol para 30 s. Imediatamente depois, mergulhe os slides em 100% de etanol para 30 s. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente contendo 100% de etanol para 30 s.
2. Após a série de desidratação do etanol, mergulhe os slides em xileno recém-derramado por 1 min. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente de xileno por 4 min.
3. Retire os slides do banho de xileno e deixe o ar secar no escuro por 5 min.
4. Coloque os slides em um dessecador por 5 min para secar ainda mais.

6. Microdissecção de captura a laser

1. Se manchado, coloque o slide no microscópio e encontre a região de interesse (CeA) usando marcos anatômicos (ou seja, o quiasma óptico e a estria terminal).
2. Use fluorescência para identificar o tipo de célula manchada e seu núcleo na região de interesse. Escolha uma célula ou várias células se fizer amostras agrupadas de células únicas. Marque as células de interesse usando o software LCM.
3. Coloque a tampa lcm em cima da fatia sobre a região de interesse.
4. Use fotos de teste de um laser infravermelho (IR) para ajustar a força, tamanho e duração do laser IR para que o adesivo de tampa LCM derreta apenas sobre a área da célula única selecionada. Isso garante que nenhuma outra célula será coletada além das células selecionadas.
   NOTA: Neste experimento representativo, 10 grupos celulares do mesmo tipo de célula foram utilizados como uma única amostra para limitar a variabilidade celular-célula na expressão genética entre amostras com o mesmo tratamento. No entanto, este método pode ser usado para verdadeiros experimentos de células únicas^1,3.
5. Selecione as células individuais a serem coletadas para análise usando as ferramentas de software LCM (Figura 2C). As células selecionadas devem estar na área anatômica do CeA (ou região cerebral de escolha) com base no atlas cerebral de ratos e na bregma¹⁰. As células devem estar a pelo menos 3 μm dos núcleos manchados adjacentes.
6. Atire o laser ir para coletar as células únicas identificadas.
7. Coloque a tampa na estação de controle de qualidade (QC) e visualize-a para garantir que apenas as células desejadas foram selecionadas. Se outras células foram selecionadas erroneamente, um laser ultravioleta pode ser usado para destruir as células indesejadas enquanto a tampa permanece na estação QC.
8. Tire uma foto da seção de tecidos de onde a célula foi coletada para documentar sua especificidade anatômica. Registre a distância da fatia da bregma, se for o caso, usando um atlas cerebral de rato como referência¹⁰.
9. Remova a tampa LCM da estação QC, conecte o dispositivo de extração da amostra e a pipeta de 5,5 μL de tampão de lysis na amostra.
   NOTA: A solução de buffer de lysis consiste em 0,5 μL de aprimoramento de lysis e 5 μL de tampão de resuspensão.
10. Coloque o dispositivo ExtracSure em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL e coloque em uma placa de aquecimento a 75 °C por 15 min.
11. Gire a amostra e o tampão de lyse para 30 s em baixa velocidade (0,01-0,02 x g) e coloque a amostra coletada em um congelador de -80 °C.

7. RT-qPCR microfluido de célulaúnica

1. Pré-amplificação de mRNA de célula única para 96,96 Dynamic Array Chip
   1. Combine os primers de genes mRNA qPCR para todos os genes que estão sendo ensaios em uma piscina de primer para pré-amplificação (concentração de 500 nM cada primer). Por exemplo, 1 μL de primers de 100 μM em 80 μL mais 120 μL de tampão de suspensão de DNA.
      NOTA: As seqüências de primer usadas para o experimento representativo podem ser encontradas em O'Sullivan et al.⁴.
   2. Em uma nova placa PCR 96 x 96, adicione 1 μL de 5x VILO a cada poço.
   3. Remova as amostras de células únicas lcM das amostras armazenadas a -80 °C, deixe descongelar brevemente, centrífuga brevemente a uma velocidade baixa (0,01-0,02 x g),e adicione 5,5 μL da amostra de célula única lysed à placa PCR. Cada amostra é adicionada ao seu próprio poço.
   4. Coloque a placa PCR com as amostras e VILO no termociclador e aqueça a 65 °C por 1,5 min. Gire a placa por 1 min a 1.300 x g a 4 °C e coloque a placa no gelo.
   5. Adicione 0,15 μL de mistura mestre de síntese de 10x cDNA, 0,12 μL T4 Gene 32 proteína e 0,73 μL de tampão de suspensão de DNA a cada poço.
   6. Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo: 25 °C para 5 min, 50 °C para 30 min, 55 °C para 25 min, 60 °C para 5 min, 70 °C para 10 min, 4 °C para terminar.
   7. Adicione 7,5 μL de mistura mestre de polimerase Taq a cada poço.
   8. Adicione 1,5 μL da piscina de primer (veja acima) a cada poço.
   9. Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo de pré-amplificação: 95 °C por 10 min, seguido por 22 ciclos de 96 °C por 5 segundos, 60 °C por 4 min.
   10. Adicione 0,6 μL de exonuclease I amortecedor de reação 10x, 1,2 μL de exonuclease I e 4,2 μL de tampão de suspensão de DNA a cada poço.
   11. Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo: 37 °C por 30 min, 80 °C por 15 min.
   12. Adicione 54 μL de tampão TE a cada poço. Gire a placa PCR a 1.300 x g a 5 min. Armazene a 4 °C se continuar imediatamente até o próximo passo. Armazene a -20 °C se esperar mais de 12h para o próximo passo.
2. Prepare a placa de amostra para o chip de matriz dinâmica 96.96.
   1. Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 0,45 μL de 20x dye de ligação de DNA e 4,55 μL de mastermix ROX baixo para cada poço.
   2. Adicione 3 μL de amostra pré-amplificada a cada poço, gire a placa PCR a 1.300 x g,em seguida, coloque a placa no gelo.
3. Prepare a placa de ensaio para o chip de matriz dinâmica 96.96.
   1. Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 3,75 μL de 2x ge ensaio de carregamento reagente e 1,25 μL de tampão de suspensão de DNA para cada poço.
   2. Adicione 2,5 μL de 10 μM qPCR primer a cada poço correspondente. Gire a placa PCR a 1.300 x g por 5 min.
4. Carregue e execute o Chip De Matriz Dinâmica 96.96.
   1. Prime o chip com fluido de linha de controle.
   2. Coloque o chip em um IFC Controller HX e execute o script Prime (136X).
   3. Adicione 6 μL da amostra da placa de amostra PCR nos poços de amostra correspondentes no Chip de Matriz Dinâmica 96,96.
   4. Adicione 6 μL da amostra da placa de ensaio PCR nos poços de ensaio correspondentes no Chip de Matriz Dinâmica 96.96.
   5. Use agulhas para estourar quaisquer bolhas de ar nos poços do Chip Dynamic Array 96.96.
   6. Coloque o Chip de Matriz Dinâmica 96.96 no IFC Controller HX e execute o script Load Mix (136x).
   7. Remova o chip do IFC Controller HX, retire o adesivo protetor e coloque o Chip 96.96 Dynamic Array em uma plataforma RT-qPCR microfluida. Execute o protocolo GE Fast 96 x 96 PCR (30 ciclos).
      NOTA: A qualidade e a validade do RNA dos resultados são avaliadas por múltiplos métodos, incluindo validação de ensaios via eletroforese em gel, curvas de temperatura de fusão, réplicas de amostras e ensaios e parcelas padrão da série de diluição. Além disso, os achados transcritos podem ser validados por métodos independentes sobre hemiseção cerebral, incluindo blot ocidental e ensaios de imunofluorescência.

8. Medir a abundância bacteriana com RT-qPCR microfluido

1. Extrair o DNA bacteriano seguindo as instruções do kit de extração de DNA das fezes.
2. Estimar a concentração de DNA bacteriano usando qPCR.
3. Adicione o DNA bacteriano extraído a uma nova placa PCR. Adicione 1 μL de DNA bacteriano extraído e 9 μL de tampão de suspensão de DNA.
4. Prepare a placa de ensaio para o chip de matriz dinâmica 48.48 (ver passos 7.2.1-7.2.2)
5. Prepare a placa de amostra para o chip de matriz dinâmica 48.48 (ver passos 7.3.1-7.3.2)
   1. Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 0,45 μL de 20x de dine de ligação de DNA e 4,55 μL de mastermix ROX baixo a 48 poços.
   2. Adicione 3 μL da amostra da placa PCR contendo o DNA bacteriano aos 48 poços e gire a placa PCR a 1.300 x g por 5 min. Armazene a 4 °C.
6. Carregar e executar o Chip 48.48 Dynamic Array (ver passos 7.4.1-7.4.7).

Resultados

A seleção das células únicas foi validada visual mente e molecularmente. Visualmente, a morfologia celular foi vista antes da coleta celular. As células coletadas foram então visualizadas na estação QC e a mancha de núcleos celulares (DAPI) se sobrepôs à fluorescência do marcador de seleção de células únicas. A Figura 2A mostra imagens representativas de um slide com o antecérebro de rato hemissilado contendo o CeA. Imagens s...

Discussão

A biologia unicelular demonstrou a heterogeneidade dos fenótipos celulares e a robustez da função tecidual. Esses achados forneceram insights sobre a organização de sistemas biológicos em escalas macro e micro. Aqui, descrevemos a combinação de dois métodos, LCM e qPCR microfluido, para obter medidas de transcriptome unicelular que fornecem especificidade anatômica e precisão transcricional a um custo relativamente baixo (Figura 1). Nosso grupo adota uma abordagem de biologia de s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
GFAP Monoclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	A-21294	Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA