Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Resumo

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Resumo

Descrevemos uma técnica para rotulagem retrógrada de neurônios motores em Drosophila. Usamos um corante lipofílico dissolvido em óleo e entregamos uma pequena gota para uma preparação de filé embrionário por um microinjetor. Cada neurônio motor cuja membrana é contatada pela gotícula pode então ser rapidamente rotulado. Neurônios motores individuais são continuamente rotulados, permitindo que detalhes estruturais finos sejam claramente visualizados. Dado que os corantes lipofílicos vêm em várias cores, a técnica também fornece um meio para obter neurônios adjacentes rotulados em multicolor. Esta técnica de rastreamento é, portanto, útil para estudar morgênese neuronal e conectividade sináptica no sistema de neurônios motores de Drosophila.

Introdução

O sistema de neurônio motor embrionário de Drosophila oferece um poderoso modelo experimental para analisar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)^1,2,3. O sistema de neurônios motores é passível de técnicas bioquímicas, genéticas, de imagem e eletrofisiológicas. Usando as técnicas, manipulações genéticas e análises funcionais podem ser realizadas no nível dos neurônios motores individuais^2,4,5,6.

Durante o desenvolvimento inicial do sistema nervoso, neuroblasts dividir e gerar um grande número de glia e neurônios. A relação espaço-temporal entre a delaminação e o perfil de expressão gênica dos neuroblastos já foi investigada em detalhes^7,8,9. No caso do sistema de neurôniomotor, a formação da junção neuromuscular embrionária (NMJ) tem sido extensivamente estudada usando o aCC (célula de canto anterior), RP2 (camarão cru 2) e neurônios motores RP5^2,10. Por exemplo, quando o neurônio motor RP5 forma uma junção sináptica nascente, a filopodia pré-sináptica e pós-sináptica está misturada^11,12,13. Essa comunicação celular direta é vital para iniciar a formação nmj. Ao contrário do que sabemos sobre os ramos nervosos periféricos, nosso conhecimento de como os dendritos motores iniciam conectividade sináptica dentro do SNC ainda é primitivo.

Neste relatório, apresentamos uma técnica que permite a rotulagem retrógrada dos neurônios motores em embriões por meio de entrega mediada por micropipette de corantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear os 38 neurônios motores innervating cada um dos 30 músculos da parede do corpo em um hemi-segmento em 15 h após a postura de ovos (AEL)¹⁴. Ao utilizar esta técnica, o nosso grupo investigou exaustivamente numerosos alelos de ganho de função/perda de função^15,16,17. Recentemente, desvendamos os mecanismos moleculares que impulsionam o início da conectividade de dendrita motoreae e demonstramos que uma interação Dscam1-Dock-Pak define o local de conseqüência dendrita no neurônio motor^{aCC 17}. Em geral, esta técnica é adaptável para a análise fenotípica de quaisquer neurônios motores embrionários em tipo selvagem ou cepas mutantes, aumentando a nossa capacidade de fornecer novos insights sobre o design funcional do sistema nervoso Drosophila.

Protocolo

1. Equipamentos e Suprimentos

1. Materiais para a coleta de embriões e treinamento de adultos para pôr ovos
   1. Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mL e abrindo um buraco na tampa para definir um filtro de malha com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)entre o tubo e a tampa.
      NOTA: Alternativamente, filtros celulares com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)podem ser usados para a etapa de filtragem da coleta de embriões.
   2. Faça pratos de ágar com premix de ágar de uva(Mesa de Materiais)de acordo com as instruções listadas. Resumidamente, mexa suavemente 1 pacote da mistura de pó em 500 mL de temperatura ambiente (RT, 23 °C) dH₂O e microondas a mistura dissolvida para ferver vigorosamente. Depois de esfriar a 70 a 75 °C, despeje a mistura em placas de Petri (60 mm). Depois que o ágar é solidificado, placas de loja em 4 °C.
   3. Prepare a pasta do fermento misturando o fermento seco ativo(tabela dos materiais)e a água a uma consistência da pasta, e mantenha-se em 4 °C.
   4. Use gaiolas de coleta de ovos (para 60 mm placa de Petri, Mesa de Materiais)que fornecem fluxo de ar suficiente.
2. Preparação de agulhas de dissecação e micropipettes de injeção de tine
   1. Prepare micropipette de injeção de tingelo e agulha de dissecação da mesma tubulação capilar com um diâmetro interno de 0,6 mm e um diâmetro externo de 1,2 mm(Mesa de Materiais). Puxe a tubulação capilar por um puxador de micropipette em 7% de 170 V saída máxima(Mesa de Materiais)para criar uma agulha afiada com uma cone de ~ 0,4 cm de comprimento.
   2. Para injeção de tine, ajuste a micropipette com um beveler micropipette(Tabela de Materiais)por uma técnica de veveling bolha descrita no manual do instrumento.
      1. Em suma, mergulhe o moedor com um agente molhado(Mesa de Materiais)para evitar que a água 'arraste' a ponta da agulha. Coloque a agulha na braçadeira micropipette em 25-30° e abaixe a ponta em dois terços do raio para fora do centro da superfície beveling. Moer a agulha enquanto uma seringa com tubos empurra o ar para a agulha, para garantir que a micropipette estará livre de aparas de vidro.
      2. Marque a micropipette com um marcador permanente de ponta fina para indicar a posição da abertura na ponta depois de biving como é um desafio para localizar a abertura estreita da micropipette que é formada em um ângulo.

2. Preparação para a coleta de embriões

1. Certifique-se de que as moscas adultas (20-40 wild-type Canton-S ou moscas brancas), machos e fêmeas, são mantidos em jovens (<7 dias) e condições saudáveis para a coleção de ovos ideal.
   NOTA: Para estimular a postura de ovos, as moscas são treinadas em sua gaiola de coleta de ovos um par de dias antes da coleta de ovos em placas de ágar listradas com pasta de fermento pelo menos uma vez por dia.

3. Encenação de embriões

1. Permitir que as moscas coloquem ovos durante a noite (ou pelo menos 15 h) na RT para coletar os embriões a 15 h AEL, ou seja, estágio 16¹⁸, para ver a dendritogênese dos neurônios motores aCC e RP3. De manhã, recolher o prato com os ovos.
   NOTA: Os embriões em 15 h AEL terá um intestino distinto de 4^{câmaras 18}. Para a imagem de imagem diferentes estágios seguem seus critérios morfológicos específicos e condições de envelhecimento.
2. Para coletar os embriões, dechorionate os ovos colocados na placa com 50% de lixívia por 5 min.
3. Uma vez que os chorões tenham limpado, despeje o conteúdo da placa através do aparelho de filtragem ou filtro celular para isolar os embriões. Usando uma garrafa de água espremer, diluir a lixívia deixada no prato e recolher tantos embriões quanto possível, decantando a mistura no filtro.
4. Lave os embriões no filtro 3-4x com mais água ou até que o odor de lixívia se dissipe. Retire o filtro do aparelho e lave os embriões em outra placa limpa com água. Decantar a água da nova placa em que os embriões estão.
5. Prepare um slide de vidro, cobrindo-o com duas camadas de fita de vinil no centro, formando um retângulo. Corte uma piscina retangular da fita usando uma lâmina de barbear. Coloque uma fina tira de fita dupla face para a extremidade superior da piscina, este é o lugar onde os embriões serão colocados como mostrado na Figura 1.
6. Usando fórceps finos, selecione individualmente 5-10 embriões em 15 h AEL e coloque-os na fita dupla face com o lado dorsal virado para cima. Adicione o soro soro^{de Ringer 19} ao pool de dissecação para proteger os embriões da dessecação (Figura 1).

4. Dissecação e coloração

1. Usando uma agulha de vidro um microscópio de dissecação(Tabela de Materiais),corte através da linha média de um único embrião em sua superfície de seu posterior a sua extremidade anterior. Em seguida, arraste o embrião para fora da membrana vitelline da fita para o vidro (encaixotado na Figura 1). Tome cuidado para não danificar os tecidos interiores do embrião.
2. Vire os tecidos epiteliais do centro e anexar a borda epidérmica na superfície do slide de vidro (Figura 1, inserção).
3. Usando uma agulha conectada ao tubo com uma abertura de ponta de ~ 300 μm (preparado quebrando a ponta fina de uma agulha de dissecação), aspirar ou soprar ar para separar e remover os troncos traqueais dorita longitudinal, bem como quaisquer tripas restantes.
4. Use 4% de paraformaldeído (PFA) em sosseo tampão de fosfato (PBS) para corrigir os embriões por 5 min em RT. Lave os embriões 3x com PBS.
5. Manchar os embriões com 1 μL de anticorpo anti-rábano peroxidase conjugado com cinina 3 tina (anti-HRP Cy3) (Tabela de Materiais) em 200 μL da PBS por 1 h. Lave os embriões com PBS 3x após a coloração.
   NOTA: O corante da anti-HRP pode ser alterado com base nos corantes lipofílicos de escolha para injeção.

5. Enchimento da micro-pipeta de injeção

1. Corantes lipofílicos térmicos (5 mg/mL de DiO ou DiD, Tabela de Materiais)a 60 °C em uma mistura de 1:10 de etanol: óleo vegetal antes de usar.
2. Prepare um toque dissolvido em óleo para a micropipette de injeção. Coloque a micropipette no suporte capilar(Figura 2,#1). Usando o micromanipulador(Tabela de Materiais),ajuste a micropipette para estar sobre o toque slide. Em seguida, ajuste o palco para colocar a micropipette no corantes (Figura 2,#2).
3. Para encher a micropipette, use um microinjetor (Tabela de Materiais) ( Figura2, #3). Colete o tinuismo na micropipette, definindo o P_i (pressão de injeção) entre 200-500 hPa (hectopascal), o T_i (tempo de injeção) entre 0,1-0,5 s e P_c (pressão de compensação) a 0 hPa para 5 min (Figura 2, #4).
4. Uma vez que o corante foi coletado, retire o toque slide e coloque a amostra no estágio do microscópio. Em seguida, aumente o P_c para um intervalo de 20 a 60 hPa antes de abaixar a micropipette na amostra para evitar a contaminação do PBS por ação capilar.

6. Injeção de corantes em neurônios

1. Localizar o embrião no centro usando o microscópio com lente 10x objetiva(Tabela de Materiais)e alinhar a micropipette com o embrião.
   NOTA: O tamanho da gota de tinua pode ser ajustado alterando o P_i ou o tamanho da abertura da ponta da micropipette. A gota deve ser de 10 a 20 μm, que é aproximadamente a largura de 1 músculo.
2. Mude a lente objetiva para uma lente 40x de imersão na água(Mesa de Materiais)e submerte a lente em PBS para ver o embrião.
   1. Use microscopia de fluorescência para verificar a morfologia neuronal marcada pelo anti-HRP Cy3 e determinar o local da injeção.
   2. Durante a injeção, use microscopia de campo brilhante para ver a gota de corantes. Quando o embrião estiver em foco, mude a posição da micropipette para fazer contato suave com a ponta do axônio de interesse (por exemplo, aCC, RP3).
   3. Deixe cair o corante em um abdominal direito (A2−A6) hemi-segmento na junção neuromuscular de aCC ou RP3 (Figura 3) com DiD ou DiO, usando os neurônios marcados por anti-HRP Cy3. Usando o controle da mão (mouse; Figura 2, 5) liberar o tinuismo e remover a micropipette depois de deixar cair o tinulado com o micromanipulador e passar para o próximo local de injeção.
      NOTA: Ao contrário de outros corantes (por exemplo, amarelo Lúcifer, calcein) que se espalham para as células vizinhas através de junções gap, corantes lipofílicos associam-se com membranas celulares e não se transferem para os vizinhos. Devido ao tamanho relativamente grande da gota de tinua, no entanto, esta técnica também resulta na rotulagem dos músculos em parceria (Figura 3A).
3. Incubar a amostra em RT por 1 h após a tine-gota antes da imagem latente.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui antes da montagem, e a amostra pode ser mantida em 4 °C durante a noite. Corantes lipofílicos também podem ser entregues usando iontoforese, se um amplificador intracelular acoplado diretamente (DC) estiver prontamente disponível^20.

7. Imagem com microscópio confocal

1. Retire a fita dupla face e fita de vinil do slide de vidro com a ajuda de fórceps.
2. Prepare um deslizamento de cobertura (22 x 22 mm² No.1 vidro de cobertura) com uma pequena quantidade de graxa de vácuo(Mesa de Materiais)nos quatro cantos e cuidadosamente coloque na amostra, evitando bolhas de ar. Remova todo o excesso PBS usando limpadores da tarefa.
3. Empurre para baixo o deslizamento da tampa para ajustar a distância de funcionamento entre a lente objetiva e a amostra. Selar completamente as bordas da tampa escorregar com esmalte.
4. Imagem na ampliação de 10x e de 100x usando um microscópio confocal.
5. Use o software ImageJ para processar imagens brutas do microscópio(Tabela de Materiais).
   NOTA: A observação deve começar dentro de 10 minutos após a montagem para as melhores imagens. Caso contrário, na RT, o tinativo se espalhará para locais adjacentes ao local da injeção, criando fundo indesejado para imagens. Para retardar a difusão de tine, a amostra pode ser armazenada a 4 °C por algumas horas.

Resultados

Uma imagem representativa dos neurônios motores aCC e RP3 é mostrada na Figura 3C para demonstrar a rotulagem multicolorida dos neurônios motores a 15 h AEL. Suas morfologias dendríticas são em grande parte invariáveis entre embriões. O padrão de coloração obtido com anticorpo anti-HRP é mostrado em cinza. Uma pequena gota de DiO ou DiD foi depositada no NMJ do músculo 1 ou 6/7, respectivamente. A Figura 4 demonstra a capacidade de m...

Discussão

O uso de rotulagem de corante para estudar morfologia neuronal tem várias vantagens sobre as técnicas genéticas de rotulagem de células. A técnica de rotulagem de corante pode minimizar a quantidade de tempo necessário para rotular e imaginar as morfologias dos neurônios motores. O processo de rotulagem de corante é bastante rápido, pois é preciso menos de 2 h e nos permite definir o contorno das projeções neuronais. Como alternativa, pode-se visualizar o neurônio motor aCC escolhendo uma linha GAL4 que expr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)