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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Resumo

Técnicas químicas e de bioconjugação foram desenvolvidas rapidamente nos últimos anos e permitem a construção de polímeros proteicos. No entanto, um processo controlado de polimerização proteica é sempre um desafio. Aqui, desenvolvemos uma metodologia enzimática para a construção de proteína polimerizada passo a passo em uma sequência racionalmente controlada. Neste método, o C-terminus de um monomer proteico é NGL para conjugação de proteínas usando o oaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) enquanto o N-terminus foi um site de decote tev (vírus etch de tabaco) cleavable mais um L (ENLYFQ/GL) para proteção temporária n-terminal. Consequentemente, o OaAEP1 foi capaz de adicionar apenas um monomer de proteína de cada vez, e então o TEV protease cedeu o N-terminus entre Q e G para expor o NH2-Gly-Leu. Em seguida, a unidade está pronta para a próxima ligadura OaAEP1. A poliproteína projetada é examinada por um uso do domínio proteico individual usando espectroscopia de força única baseada em microscopia atômica (AFM-SMFS). Portanto, este estudo fornece uma estratégia útil para a engenharia de poliproteínas e a imobilização.

Introdução

Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios1. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios4,5,6,7. No entanto, o método anterior sempre resulta em uma sequência aleatória e descontrolada, e o último leva a outros problemas, incluindo a dificuldade para a superexpressão de proteínas tóxicas e de grande porte e a purificação de proteínas complexas com cofator e outras enzimas delicadas.

Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos um método enzimático que conjuga monomer proteático em conjunto para polímero/poliproteína de forma stepwise usando uma proteína ligase OaAEP1 combinada com um TEV 8protease,9. OaAEP1 é uma endopeptidase rigorosa e eficiente. Duas proteínas podem ser ligadas covalentemente como sequência Asn-Gly-Leu (NGL) através de dois termini por OaAEP1 em menos de 30 min se o N-terminus for resíduos Gly-Leu (GL) e a outra do qual o terminal C é resíduos NGL10. No entanto, o uso do OaAEP1 apenas para ligar o monômero de proteína leva a um polímero proteico com uma sequência descontrolada como o método de acoplamento à base de cisteína. Portanto, projetamos o N-terminus da unidade proteica com um local protease TEV removível mais um resíduo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes do decote TEV, o n-terminal não participaria da ligadura OaAEP1. E então os resíduos GL no N-terminus, que são compatíveis com a ligadura OaAEP1, são expostos após o decote TEV. Assim, alcançamos um método sequencial de biosíntese enzimática de poliproteína com uma sequência relativamente bem controlada.

Aqui, nosso método de síntese enzimática stepwise pode ser usado na preparação de amostras de poliproteína, incluindo controlado por sequência e descontrolado, e imobilização proteica para estudos de moléculaúnica também, especialmente para o sistema complexo, como metaloproteína.

Além disso, os experimentos de SMFS baseados em AFM nos permitem confirmar a construção e estabilidade do polímero de proteína no nível de uma única molécula. A espectroscopia de força de molécula única, incluindo AFM, pinça óptica e pinça magnética, é uma ferramenta geral na nanotecnologia para manipular a biomolécula mecanicamente e medir sua estabilidade11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. A AFM de molécula única tem sido amplamente utilizada no estudo da proteína (un)dobrável21,22,23,24,25, a medida de força do receptor-ligand interação26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, ligação química inorgânica20,36,37,38,39,40,41,42,43e metal-ligand vínculo em metaloproteína44,45,46,47,48,49, 50 . Aqui, a AFM de uma única molécula é usada para verificar a sequência de poliproteína sintetizada com base no sinal de desdobramento da proteína correspondente.

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Protocolo

1. Produção de proteínas

  1. Clone genético
    1. Compre genes codificando para a proteína de interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxina (RD)51, o módulo de ligação de celulose (CBM), o domínio dockerin-X (XDoc) e coesão de Ruminococcus flavefacience,protease do vírus da gravação de tabaco (TEV), polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs).
    2. Realize a reação da cadeia de polimerase e use o sistema de enzimas de digestão de três restrições BamHI-BglII-KpnI para recombinar o gene de diferentes fragmentos de proteína.
    3. Confirme todos os genes por sequenciamento de DNA direto.
  2. Expressão e produção de proteínas
    1. Transforme E. coli BL21(DE3) com o pQE80L-POI ou pET28a-POI plasmid para expressão.
    2. Escolha uma única colônia em 15 mL de meio LB com respectivos antibióticos (por exemplo, 100 μg/mL ampicillin sódio sal ou 50 μg/mL, kanamicina). Continue agitando as culturas a 200 rpm a 37 °C por 16-20 h.
    3. Diluir as culturas durante a noite em 800 mL de meio LB (1:50 diluição). Para rubdoxina, centrífuga da cultura a 1.800 x g, depois resuspender em 15 mL de m9 médio (complementado com 0,4% de glicose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), e depois diluí-la em 800 mL de m9 médio.
    4. Incuba r$ 37 °C enquanto treme a 200 rpm, até que a cultura atinja uma densidade óptica de 600 nm (OD600) de 0,6. Economize 100 μL amostra da cultura como o controle pré-indução para testar a expressão proteica.
    5. Induzir a expressão proteica adicionando IPTG a uma concentração final de 1 mM e agitar a cultura a 37 °C por 4h a 200 rpm. Reserve uma amostra de 100 μL da cultura como o controle pós-indução para testar a expressão proteica.
    6. Centrífuga a cultura a 13.000 x g por 25 min a 4 °C e armazenar a -80 °C antes da purificação.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
  3. Purificação da proteína de interesse
    1. Resuspender as células em 25 mL de tampão de lise (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 contendo DNase, RNase, PMSF) e usar um sônico (15% amplitude) para lyse-lo por 30 min no gelo.
    2. Esclareça o lysato celular em 19.000 x g por 40 min a 4 °C.
    3. Embalar 1 mL (volume de cama) da coluna de afinidade Co-NTA ou Ni-NTA e lavar a coluna com 10 volumes de coluna (CV) de água ultrapura e, em seguida, 10 CVs de tampão de lavagem (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7.4) por fluxo de gravidade.
    4. Passe a proteína supernatante através da coluna pelo fluxo de gravidade por três vezes.
    5. Despeje o tampão de lavagem na coluna com 50 CVs para afastar proteínas contaminantes.
    6. Elute a proteína vinculada com 3 CVs de tampão de elusão gelada (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7.4). Quando se trata de proteínas de rubredoxina, é necessário mais purificação de troca de aniô sussura utilizando coluna de troca de aniôon em pH 8,5 a 4 °C.
    7. Analise a amostra pelo SDS-PAGE.

2. Funcionalidade de deslizamento de cobertura e superfície cantilever

  1. Preparação da superfície do deslizamento de cobertura funcional
    1. Dissolva 20 g de cromador de potássio em 40 mL de água ultrapura. Adicione lentamente 360 mL de ácido sulfúrico concentrado à solução cromador de potássio com haste de vidro mexa suavemente e prepare o ácido cromômico.
      ATENÇÃO: O produto químico usado aqui e o ácido cromômico final é fortemente corrosivo e ácido. Trabalhe com equipamentos de proteção adequados. A solução libera calor quando adiciona ácido sulfúrico concentrado, o que significa adição lenta e pausa adequada para resfriamento.
    2. Limpe e ative um deslizamento de cobertura de vidro a 80 °C por 30 min por tratamento de ácido cromômico. Mergulhe completamente os deslizamentos de cobertura em 1% (v/v) Solução de toluea APTES por 1h à temperatura ambiente, protegendo-os da luz.
    3. Lave o deslizamento de cobertura com tolueno e álcool etílico absoluto e seque o deslizamento de cobertura com um fluxo de nitrogênio.
    4. Incubar o deslizamento de cobertura a 80 °C por 15 min e depois esfriar até a temperatura ambiente.
    5. Adicione 200 μL de sulfo-SMCC (1 mg/mL) na solução de sulfoxida de dimetil (DMSO) entre dois coverslips imobilizados e incubar por 1 h protegido da luz.
    6. Lave o deslizamento de cobertura com DMSO primeiro e depois com álcool etílico absoluto para remover sulfo-sMCC residual.
    7. Seque o deslizamento um fluxo de nitrogênio.
    8. Tubo de 60 μL de 200 μM GL-ELP50nm-C solução de proteína em um deslizamento de cobertura funcional e incubar por cerca de 3 h.
    9. Lave o deslizamento de cobertura com água ultrapura para remover o GL-ELP50nm-C não reagido.
      NOTA: Os coverslips funcionais são capazes por cerca de duas semanas armazenamento a 4 °C.
  2. Preparação da superfície cantilever funcionalizada
    1. Limpe os cantilevers a 80 °C por 10 min por tratamento de ácido cromômico.
    2. Funcionalize o cantilever por amino-silanização com 1% (v/v) Solução de tolueno APTES e, em seguida, asse o cantilever a 80 °C por 15 min antes de conjugar para sulfo-SMCC.
    3. Ligue o C-ELP50nm-NGL à superfície com o grupo maleimida do sulfo-SMCC por 1,5 h.
    4. Lave o C-ELP50nm-NGL não reagido no deslizamento de cobertura por água ultrapura.
    5. Mergulhe um cantilever funcional em 200 μL de 50 μM solução de proteína GL-CBM-XDoc contendo 200 nM OaAEP1 a 25 °C por 20-30 min. Em seguida, use buffer AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar proteína não reagida.
      NOTA: A química superficial dos cantilevers e o deslizamento de cobertura são semelhantes.

3. Preparação de poliproteína stepwise com sequências controladas

  1. Conecte a unidade de ligação Coh-tev-L-POI-NGL ao GL-ELP50nm imobilizado na superfície do deslizamento de cobertura pela OaAEP1 por 30 min.
  2. Use 15-20 mL de tampão AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar quaisquer proteínas não reagidas.
  3. Adicione 100 μL de PROTEase TEV (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glicerol, pH 8.0) para cortar a unidade proteica no TEV reconhecer o local por 1h a 25 °C.
  4. Use 15-20 mL de tampão AFM para lavar proteínas residuais.
  5. Conecte a unidade de ligação Coh-tev-L-POI-NGL ao GL-Ub-NGL-Glass da OaAEP1 por 30 min.
  6. Repita os passos 3,3 a 3,5 N-1 vezes para construir proteínas construa GL-(Ub)n-NGL na superfície do vidro. Omita a última reação do decote TEV à reserva de coesão no polímero de proteína supor como Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Medição do experimento AFM e análise de dados

  1. Medições de AFM
    1. Adicione 1 mL de tampão AFM à câmara com 10 mM CaCl2 e 5 mM Ácido Ascórbico.
    2. Escolha a ponta D da sonda AFM funcionalizada para o experimento. Use o teorema da equipartição para calibrar o cantilever no buffer AFM com um valor de constante de mola precisa(k)antes de cada experimento.
    3. Conecte a ponta cantilever à superfície da amostra para formar o par Coeoso/Dockerin.
    4. Retraia o cantilever a uma velocidade constante de 400 nm·s−1 da superfície. Enquanto isso, registre a curva de extensão de força a uma taxa amostral de 4000 Hz.
  2. Análise de dados
    1. Use o processamento de dados JPK selecione traços de extensão de força selecionados.
    2. Use software para analisar os traços. Encaixe as curvas com o modelo de corrente de verme (WLC) de elasticidade do polímero e obtenha força desdobrada e incremento de comprimento de contorno para o pico de desdobramento da proteína individual.
    3. Encaixe os histogramas das forças desdobradas com o modelo gaussiano para obter os valores mais prováveis de força desdobrada (u>) e incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>).

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Resultados

Os resíduos ngl introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetarão a estabilidade do monômero de proteína sonímero no polímero como a força desdobrada (u>), e o incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>) é comparável com o estudo anterior (Figura 1). O resultado purificatório da proteína rubredoxina é mostrado na Figura 2. Para provar a proteína após o decote TEV ser compatível com a seguinte li...

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Discussão

Descrevemos um protocolo de biossíntese enzimática e imobilização da poliproteína e verificamos o projeto de poliproteína pela SMFS baseada em AFM. Essa metodologia fornece uma nova abordagem para a construção do polímero proteico em uma sequência projetada, que complementa métodos anteriores para engenharia de poliproteína e imobilização4,6,52,53,54

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant no. 21771103, 21977047), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (Grant No. BK20160639) e Shuangchuang Program of Jiangsu.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
iron (III) chloride hexahydrateEnergy chemical99%
Zinc chlorideAlfa Aesar100.00%
calcium chloride hydrateAlfa Aesar99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic AcidSigma Life ScienceBio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylateThermo Scientific90%
GlycerolMacklin99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Alfa Aesar
GenesGenscript
Equipment
Nanowizard 4 AFMJPK Germany
MLCT cantileverBruker Corp
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare
AKTA FPLC systemGE Healthcare
Glass coverslipSail Brand
Nanodrop 2000Thermo Scientific
Avanti JXN-30 CentrifugeBeckman Coulter
Gel Image SystemTanon

Referências

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