Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente

Resumo

Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Resumo

As células-tronco cancerígenas (CSCs) estão implicadas na iniciação, desenvolvimento e recidiva do tumor após o tratamento, e tornaram-se o centro de atenção de muitos estudos nas últimas décadas. Por isso, é importante desenvolver métodos para investigar o papel dos genes-chave envolvidos na haste celular cancerosa. O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer. Acredita-se que as células-tronco do câncer gástrico (GCSCs) sejam a raiz da recaída do câncer gástrico, da metástase e da resistência a medicamentos. A compreensão da biologia dos GCSCs é necessária para avançar no desenvolvimento de terapias-alvo e, eventualmente, reduzir a mortalidade entre os pacientes. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Introdução

O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer¹. Apesar dos avanços na cirurgia combinada, quimioterapia e radioterapia na terapia GC, o prognóstico permanece ruim e a taxa de sobrevivência de cinco anos ainda é muito baixa². A recidiva e a metástase são as principais razões que causam as mortes pós-tratamento.

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são um subconjunto de células cancerígenas que possuem a capacidade de se auto-renovar e gerar as diferentes linhagens celulares que reconstituem o tumor³. Acredita-se que os CSCs sejam responsáveis pela recaída do câncer e pela metástase devido às suas capacidades de autoconexão e semeadura de novos tumores, bem como sua resistência à quimioterapia e radioterapias tradicionais⁴. Portanto, direcionar CSCs e eliminar CSCs fornecem um potencial empolgante para melhorar o tratamento e reduzir a mortalidade de pacientes com câncer.

Os CSCs foram isolados de muitos tipos de tumores sólidos⁵. Em 2009, células-tronco de câncer gástrico (GCSCs) isoladas das linhas celulares de câncer gástrico humano foram originalmente descritas por Takaishi et al.⁶. Chen e colegas primeiro identificaram e purificaram GCSCs de tecidos tumorais de adenocarcinoma gástrico humano (GAC)⁷. Esses achados não apenas proporcionam uma oportunidade de estudar biologia dos GCSCs, mas também fornecem grande importância clínica.

Uma característica particular dos CSCs é sua capacidade de formar uma esfera⁸. Células únicas são banhadas em condições nãoadherentes em baixa densidade, e apenas as células possuídas com auto-renovação podem crescer em um aglomerado sólido e esférico chamado esfera. Assim, o ensaio de formação da esfera tem sido considerado como o ensaio padrão-ouro e amplamente utilizado para avaliar o potencial de auto-renovação das células-tronco in vitro.

A interferência de RNA (RNAi) é uma poderosa ferramenta de pesquisa para estudar a função genética pela derrubada de um gene específico⁹. No entanto, tecnologias de knockdown de genes estáveis de longo prazo têm certas limitações, como o desafio de explorar a função de um gene que é essencial para a sobrevivência celular. Sistemas RNAi condicional podem ser úteis para a baixa regulação dos genes desejados de forma temporal e/ou especial controlada pela administração de um agente indutor. Os sistemas induutíveis tetraciclina (Tet) são um dos sistemas condicionais mais utilizados¹⁰. Os sistemas indutíveis de Tet podem induzir o silenciamento genético alvo controlando a expressão de shRNA após a adição de um indutor exógeno (preferencialmente doxiciclina, Dox). Os sistemas indutíveis do Tet podem ser divididos em dois tipos: sistemas Tet-On ou Tet-Off. A expressão de shRNA pode ser ligada (Tet-On) ou desligada (Tet-Off) na presença do indutor. No sistema Tet-ON sem um indutor, o repressor Tet (TetR) expresso constitutivamente se liga à sequência de elementos tet-responsivo (TRE) contendo um promotor dependente pol III sensível ao Tet para expressão de shRNA, reprimindo assim a expressão do shRNA. Enquanto, após a adição de Dox, o TetR é sequestrado longe do promotor dependente de Pol III. Isso facilita a expressão do shRNA e leva ao knockdown genético.

O protocolo descrito aqui emprega um sistema de shRNA indutível de tetraciclina funcional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar a função de clusterin em GCSCs derivados do paciente. Clusterin foi identificado como uma molécula-chave nova para manter a hasteza e a sobrevivência dos GCSCs em um estudo anterior¹¹. Utilizamos o protocolo descrito para estudar os efeitos da clusterina na auto-renovação dos GCSCs. Essa metodologia também é aplicável a outros tipos de células-tronco cancerígenas.

Protocolo

Todas as experimentações utilizando células-tronco de câncer gástrico derivadas do paciente descritas aqui foram aprovadas pelo comitê de ética local⁷.

1. Cultura de células-tronco do câncer gástrico

1. Preparação de GCSCs meio de cultura completa
   1. Prepare os GCSCs meio de cultura completa adicionando meio DME/F12 fresco com os seguintes ingredientes essenciais: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrin/Selenita de sódio, 0,2% de glicose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoácido não essencial, 10 μM 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/mL NaHCO₃, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina. Filtrar e esterilizar usando um filtro de 0,22 μm.
      NOTA: O meio de cultura completo gcscs é recomendado armazenado preferencialmente não mais do que duas semanas a 4 °C.
2. Recuperação de GCSCs e cultura
   NOTA: Os GCSCs foram obtidos da seguinte forma: As amostras de tumores foram submetidas à dissociação mecânica e enzimática. As suspensões de célula única foram obtidas por filtragem com rede de nylon de suspensão bem dispersa. As células cancerígenas resultantes foram cultivadas em GCSCs Complete Culture Medium, e algumas células cresceram para formar esferas. Essas esferas foram então submetidas à dissociação enzimática, e os GCSCs podem ser obtidos por triagem citofluormétrica da população celular manchada com marcadores CD44/CD54. O protocolo detalhado e os ensaios funcionais dos GCSCs foram relatados⁷.
   1. GCSCs pré-quentes completam o meio de cultura a 37 °C por no máximo 30 min.
   2. Descongele os GCSCs do armazenamento de nitrogênio líquido e descongele rapidamente os criovias em um banho de água de 37 °C. Continue girando os frascos até que todo o conteúdo derreta totalmente.
      NOTA: Descongele rapidamente as células congeladas (<1 min) em um banho de água de 37 °C.
   3. Transfira todo o conteúdo dos criovials para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de GCSCs meio de cultura completa. Centrifugar a 800 x g por 5 min no RT.
   4. Aspire o supernatante cuidadosamente e suspenda a pelota celular em 10 mL de GCSCs frescos meio completo. Aplaque a suspensão da célula em uma placa de Petri de 100 mm. Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5% e adicionar 5 mL de meio completo fresco no terceiro dia.
3. Subcultura de tumores GCSCs
   NOTA: Os GCSCs do centro de tumores só possuem nutrientes suficientes antes que o tamanho das esferas cresça até 80-100 μm de diâmetro. Uma vez que as esferas escuras e de baixa refratividade aparecem (cerca de 6 dias de cultura), é necessário subculturar as tumoresferas.
   1. Agite o prato suavemente e transfira o meio de cultura tumorsphere dos GCSCs (os tumores médios e não aderentes) em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Para maiores volumes médios, podem ser necessários tubos de centrífugas maiores.
   2. Centrifugar a 600 x g por 5 min e dispor cuidadosamente do supernaspe. Após a centrifugação, uma pelota off-white será visível.
   3. Adicione 2 mL de solução de dissociação celular para resuspensar a pelota para dissociação mecânica e enzimática a 37 °C. Encaixe suavemente para cima e para baixo 10 vezes a cada 2-3 minutos no procedimento de digestão para quebrar as esferas até que as tumorferas sejam dispersas em suspensão de célula única. Recomenda-se que este processo de dissociação total seja inferior a 15 min.
      NOTA: Realize uma verificação visual sob o microscópio para confirmar que não permanecem grandes esferas ou agregados celulares.
   4. Adicione 10 mL de GCSCs frescos meio de cultura completa (5x o volume da solução de descolamento celular) para terminar o procedimento de digestão e centrífuga a 800 x g em RT por 5 minutos.
   5. Descarte o supernasciente e resuspenque as células com 1 mL de GCSCs frescos pré-aquecidos completos meio de cultura. Semente um número apropriado de células em uma nova placa de Petri de 100 mm com 10 mL de GCSCs pré-aquecidos frescos completa cultura média e incubar a 37 °C, 5% CO₂.
   6. Realimentar as culturas tumorais após 3 dias adicionando 5 mL de meio completo pré-aquecido fresco. Após 6 dias, as células de passagem quando os tumores crescem até 80-100 μm de diâmetro.
4. Criopreservação de GCSCs
   NOTA: Não criopreserve as células GCSCs adicionando meio às tumores diretamente. Os tumores gcscs devem ser digeridos em células únicas para que o agente protetor celular possa entrar em todas as células para garantir o armazenamento estável de células a longo prazo. Certifique-se de que as células estão em situação saudável e sem contaminação.
   1. Colher tumores GCSCs. Centrífuga a 600 x g por 5 min.
   2. Descarte o supernasce e adicione 2 mL de solução de dissociação celular para dissociar tumores GCSCs a 37 °C. Termine o procedimento de digestão adicionando 10 mL de GCSCs meio de cultura completa.
   3. Centrifugar a 800 x g por 5 min e coletar GCSCs únicos.
   4. Suspenda suavemente os GCSCs com meio criopreservador sem soro. A concentração final recomendada é 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ células/mL.
   5. Dispense a suspensão celular em alíquotas de 1 mL em frascos criogênicos marcados.
   6. Coloque imediatamente os criovias contendo as células em uma câmara isopropanol e armazene-as a -80 °C. Transfira os frascos para nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento a longo prazo.

2. Geração de linhas de GCSCs indutíveis

ATENÇÃO: Os lentivírus recombinantes foram designados como organismos de nível 2 pelo Instituto Nacional de Saúde e Centro de Controle de Doenças. O trabalho envolvendo lentivírus requer a manutenção de uma instalação de Biossegurança Nível 2, considerando que os supernacantes virais produzidos por esses sistemas lentivirais poderiam conter vírus recombinantes potencialmente perigosos.

1. Geração de partículas de lentivírus
   1. Sintetizar 2 vetores lentivirais que carregam shRNA indutível visando clusterin humano e um vetor lentiviral de controle não direcionado (GV307) da GeneChem com base no design da Tabela 1 (vetor GV307 contém: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
   2. Semente 4 x 10⁶ 293T células de embalagem lentivirais em uma placa de Petri de 100 mm com 10 mL de DMEM suplementadas com soro bovino fetal de 10%.
   3. Incubar células 293T durante a noite a 37 °C, 5% de CO₂. Certifique-se de que a densidade celular 293T é cerca de 50-80% confluente no dia da transfecção.
   4. Leve o soro reduzido de temperatura média a ambiente e prepare o tubo A e o tubo B, conforme descrito na Tabela 2.
   5. Transfira o tubo A para o tubo B, misture bem e incuba os complexos por 20 minutos à temperatura ambiente para preparar complexos lipídicos-DNA.
   6. Remova 5 mL de médio, antes de adicionar complexo lipídeto-DNA, deixando um total de 5 mL.
   7. Adicione 5 mL de complexo lipídicos-DNA no prato de cultura dropwise e gire suavemente o prato para distribuir o complexo.
      NOTA: Dispense cuidadosamente o líquido contra a parede do prato para evitar perturbar as células 293T.
   8. Incubar prato de cultura por 24 h a 37 °C, 5% CO₂.
   9. Após 24 horas após a transfecção, remova cuidadosamente o meio de transfecção e substitua suavemente por 10 mL de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% de FBS. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% DE CO₂.
      NOTA: Todos os supernass e pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.
   10. Aproximadamente após 48 horas após a transfecção, colhe 10 mL de supernantes contendo lentivírus.
       NOTA: Todos os vasos e pontas da cultura celular devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.
   11. Filtre o supernatante lentiviral usando um filtro de poros de 0,45 μm para remover detritos celulares.
       NOTA: Todos os filtros e seringas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.
   12. Transfira sobrenante esclarecido para um recipiente estéril, adicione o Concentrador Lenti-X (1/3 volume de supernante esclarecido) para misturar por inversão suave.
   13. Incubar a mistura a 4 °C durante a noite.
   14. Centrífuga amostras a 1.500 x g para 45 min a 4 °C. Após centrifugação, e pelotas off-white serão visíveis. Remova cuidadosamente o supernasce, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
       NOTA: Todos os supernass e pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.
   15. Resuspenque suavemente a pelota em 1 mL de DMEM suplementada com 10% de FBS como estoque de vírus, armazene a -80 °C.
2. Geração de linhas celulares transfectadas estáveis
   1. Semente 6 x 10⁶ GCSCs em uma placa de Petri de 100 mm com 10 mL DMEM complementado com 10% de FBS para 24 h a 37 °C, 5% CO₂ (70-80% confluência antes da infecção).
   2. Aspire o meio no prato, adicione as partículas lentivirais concentradas diluídas com 4 mL de meio DMEM completo contendo reagente de polibreno (5 μg/mL) no prato. Incubar por 18 h a 37 °C, 5% DE CO₂.
      NOTA: A concentração ideal de polibrene depende do tipo celular e pode precisar ser testada em diferentes concentrações para decidir as concentrações efetivas. Caso contrário, pode ser empiricamente determinado, geralmente na faixa de 2-10 μg/mL. Todos os tubos e pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.
   3. Mude o médio, substitua por 10 mL de DMEM por 10% de FBS médio e incubar por 24h a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Todos os meios e as pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.
   4. Aspire o supernascimento com detritos celulares, substitua por DMEM fresco suplementado com 10% de FBS médio contendo puramicina (2,5 μg/mL) e incubar por 24 h a 37 °C, 5% DE CO₂. Em seguida, substitua o DMEM fresco complementado por 10% de FBS médio contendo puramicina (5 μg/mL) e incubar a 37 °C, 5% de CO₂ para adicional de 24 h.
   5. Enxágüe os GCSCs adeptos duas vezes com 5 mL de DPBS sem cálcio e magnésio.
   6. Dissociar GCSCs com 1 mL de solução de dissociação celular pré-aquecida e incubar 2-3 min a 37 °C.
   7. Adicione 5 mL de GCSCs pré-aquecidos frescos meio de cultura completa à suspensão celular.
   8. Dispense 3 mL em um tubo centrífugo de 15 mL (tubo A) para criopreservar as células, e os outros 3 mL em um tubo centrífugo de 15 mL (tubo B) para induzir por doxiciclina.
   9. Tubo de centrífuga A e tubo B a 800 x g por 5 min.
   10. Resuspenda a pelota do tubo A com 1 mL de meio criopreservador sem soro, transfira o frasco para -80 °C durante a noite e remova-o em armazenamento líquido de nitrogênio.
   11. Aspire o supernasal e resuspende as células do tubo B em 1 mL de GCSCs frescos pré-aquecidos completos meio de cultura. Semente um número apropriado de células em uma nova placa de Petri de 10 mm de 10 mL gcscs frescos pré-aquecidos completos com doxiciclina (Dox) (2,5 μg/mL) e incubar por 48 h a 37 °C, 5% CO₂.
       NOTA: A concentração ideal de Dox pode variar entre as linhas celulares. Cada linha celular deve ser testada em diferentes concentrações de Dox para decidir as concentrações eficazes para KD e para toxicidade nas células.
   12. Confirme a repressão estável de clusterin em GCSCs por mancha ocidental.

3. Ensaio de formação de esferas

1. Descongele as linhas de GCSCs indutíveis congelados (ver passo 1.2).
2. Determine a densidade celular viável de uma amostra de 10 μL usando um Contador automatizado de células.
3. Ajuste o volume com GCSCs pré-aquecidos meio de cultura completa para obter uma concentração de 2 x 10⁴ células viáveis/mL.
4. Dispense em 3 novos poços de placa de cultura de 96 poços de cultura de apego ultra-baixo (0,1 mL/bem) de cada grupo.
5. Incubar as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂. A formação da esfera deve ocorrer dentro de 3 a 10 dias. Monitore e regise a visualização da formação de tumores a cada 2 dias.
   NOTA: O meio não é recomendado para ser alterado em caso de qualquer perturbação da formação tumorosa. Essas tumores devem ser facilmente distinguidas de células únicas e agregadas.
6. Determine os resultados da formação tumorais avaliando os tamanhos dos tumores formados usando software de imagem.

Resultados

As células-tronco do câncer gástrico do adenocarcinoma gástrico primário foram cultivadas em meio de cultura livre de soro. Após 6 dias, as células se expandiram do fenótipo de célula única(Figura 1A)para formar grandes esferas(Figura 1B).

Para avaliar a função de clusterin em GCSCs, sequências de shRNA contra clusterin e m...

Discussão

GC é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Os GCSCs são críticos na recaída do câncer gástrico, metástase e resistência a medicamentos. O uso de GCSCs de pacientes com câncer gástrico nos permitirá explorar seu ponto fraco e desenvolver os medicamentos direcionados para o tratamento de pacientes com GC.

O ensaio de formação de esferas é um método útil para examinar o potencial de auto-renovação das células-tronco do câncer in vitro. Os ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1